Summary
Beschrijven we een nieuwe methode voor de levering van DNA plasmide in de cellen van de urothelial van muis blaas in vivo via de urinebuis catheterisatie en electroporation. Het biedt een snelle en gemakkelijke manier voor het genereren van autochtone Muismodellen van ziekten van de blaas.
Abstract
Genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMMs) zijn uiterst waardevol in onthullende roman biologische inzicht in de mechanismen van het initiatie en de vooruitgang van menselijke ziekten zoals kanker. Transgene en voorwaardelijke knock-out muizen zijn vaak gebruikt voor gene overexpressie of ablatie in specifieke weefsels of cel typt in vivo. Genereren van germline Muismodellen kan echter tijdrovend en kostbaar. Recente vooruitgang in de gene bewerken van technologieën en de haalbaarheid van het leveren van DNA-plasmiden door virale infectie hebt ingeschakeld snelle generatie niet-germline autochtoon Muismodellen kanker voor verscheidene organen. De blaas is een orgaan dat is moeilijk voor virale vectoren te openen, als gevolg van de aanwezigheid van een glycosaminoglycaan laag die betrekking hebben op de urothelium geweest. Hier beschrijven we een nieuwe methode ontwikkeld in lab voor efficiënte levering van DNA-plasmiden in de muis blaas urothelium in vivo. Door intravesicale instillation van pCAG-GFP DNA plasmide en electroporation van chirurgisch blootgestelde blaas, laten we zien dat het DNA plasmide specifiek in de urothelial cellen van de blaas voor voorbijgaande expressie kan worden geleverd. Onze methode biedt een snelle en gemakkelijke manier voor overexpressie en knockdown van genen in de blaas van de muis, en kan worden toegepast op het opbouwen van GEMMs van blaaskanker en andere urologische aandoeningen.
Introduction
Genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMMs) hebt is spelen een essentiële rol bij de uitbreiding van onze kennis over dierlijke ontwikkeling, gene functies in vivo, en mechanismen van1,2van de progressie van de ziekte. Germline GEMMs zijn traditioneel ontwikkeld op twee manieren. De eerste is de oprichting van transgene muizen door pronuclear injectie van DNA plasmide gevolgd door transplantatie van zygoten in pseudopregnant vrouwtjes. Anderzijds is de generatie van knock-out/knock-in muizen door homologe recombinatie bij embryonale stamcellen en de ontwikkeling van chimaera. Voorwaardelijke knockout van genen in bepaalde weefsels of cellen soort belang houdt het kweken van genetisch gemanipuleerde allelen met Cre en flox sites voor meerdere generaties. Het hele proces kan worden duur en tijdrovend, vooral als het doel is om het weefsel-specifiek richten op meerdere genen. Onlangs, bewerken van gene technologieën zoals geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) zijn toegepast op de verschillende organen van de muizen voor het opwekken van weefsel-specifieke genetische wijzigingen voor autochtone kanker modellering van3, 4,5,6,7 of juiste ziekte mutaties in situ8,9. De levering van de vectoren van de gRNA werd in deze studies, meestal bereikt door adenovirale of lentivirale infectie van het orgaan of de hydrodynamische staart-veneuze injectie. Het relatieve gemak van levering van de componenten van de CRISPR naar de longen en de lever is sterk verbeterd het gemak en de efficiency van kanker modelleren in deze organen ten opzichte van de traditionele Muismodellen van Cre-Lox gebaseerd.
De urothelium van de blaas is waar de meeste tumoren van de blaas vandaan komen. De levering van DNA vectoren aan de urothelium van de blaas voor kankertherapie modeling of gen wordt belemmerd door een glycosaminoglycaan laag op het oppervlak van de apicale urothelial, die als een barrière voor de hechting van besmettelijke virussen10,11 fungeert. Verschillende voorbehandelingsplatformen agentia zoals Syn3 en dodecyl-β-d-maltoside zijn gebruikt om deze barrière te verstoren en adenovirus infectie efficiëntie12,13,14te verbeteren. Of adeno-geassocieerde virussen (AAVs) kunnen effectief het infecteren van de blaas is niet gemeld. Over het geheel genomen zou een niet-virale gebaseerde leveringswijze wenselijk zijn. Hier beschrijven we een nieuwe methode ontwikkeld in het lab voor efficiënte DNA plasmide levering aan de urothelium van de muis via de urinebuis catheterisatie en electroporation. Omdat onze aanpak geen chemische voorbehandeling van de glycosaminoglycaan laag of virus productie vergt, het aanzienlijk vereenvoudigt de levering van DNA-plasmiden in de urothelium van de blaas muis en verschillende in vivo studies moet vergemakkelijken van ziekten van de blaas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die hier beschreven werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren en voorschriften van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Californië in Santa Cruz.
1. plasmide en Tools voorbereiding
- Voor elke blaas naar transfect, ten minste 20 µL van DNA plasmide (1 µg/µL) voor te bereiden.
- Voeg 1 µL van Trypan blauw aan de 20 µL van plasmide oplossing in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Pipetteer aan meng goed.
- Autoclaaf alle chirurgische instrumenten en steriliseren van de werkruimte met 70% ethanol. Spray chirurgische instrumenten en handschoenen met 70% ethanol vaak of een glazen kraal sterilisator gebruiken bij het uitvoeren van de volgende stappen uit steriele voorwaarden te handhaven.
2. het verdoven van dieren
- Een tabel top anesthesie-systeem gebruiken om te anesthetize van het dier met Isofluraan. Zet de O2 tank en aanpassen van de zuurstof debietmeter aan 1 L/min.
- Plaats een volwassen vrouwelijke C57BL/6J muis in de zaal van inductie. Inschakelen en aanpassen van de vaporizer Isofluraan tot 3% voor inductie. De muis moet in anesthesie binnen 2 min. beheren buprenorfine pijnstiller (0,1 mg/kg) subcutaan na verwijdering van de muis uit de zaal inductie voor preëmptieve analgesie.
NB: In dit protocol, vrouwelijke muizen worden gebruikt, zoals ze zijn gemakkelijker om met te werken tijdens de urinebuis catheterisatie. Het protocol werkt ook voor mannelijke muizen, maar extra voorzichtigheid is geboden bij het uitvoeren van stap 3. - Ophthalmic zalf toepassen door de ogen van het dier om te voorkomen dat droogte. Plaats de verdoofde muis naar boven op een verwarming pad met zijn neus in de neus. Zet de lucht circuit switch om te laten Isofluraan gaan via de neus.
- Het hoofd en de neus met plakband beperken. Pas de Isofluraan vaporizer tot 2% voor onderhoud.
- Het beperken van de ledematen met plakband. Teen-snuifje tests uitvoeren om te ervoor te zorgen het dier is in diepe verdoving en dan scheren de buikstreek.
3. urine uitputting en blaas spoelen
- Smeermiddel van toepassing op de katheter (24G, lengte van 2.11 centimeter, buitendiameter van 0.045 cm) en ervoor zorgen dat de buitenste oppervlak volledig bedekt is.
- Breng de katheter in de plasbuis opening en langzaam duw totdat de blaas, op welk moment de urine via de katheter stromen moet wordt bereikt. Druk zachtjes op de buik te helpen urine uitputting.
- Controleer als de katheter in de blaas correct is ingevoegd door het observeren van automatische urine uitgaande stromen. Vermijd piercing de plasbuis en blaas muur, en smeermiddel meerdere malen toepassen indien nodig.
- Gooi de urine met een precisiepipet in een bekerglas van afval.
- Pipetteer 80 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in het buitenste einde van de katheter, met de andere kant nog steeds in de blaas. Zorgvuldig hechten van een spuit van 1 mL aan de katheter. Duw voorzichtig de spuit te injecteren de PBS in de blaas. Laat enkele PBS in de katheter te voorkomen dat er luchtbellen in de blaas.
- Verwijder de injectiespuit. Wachten op PBS voor de afvoer uit de blaas. Druk zachtjes op de buik te evacueren van PBS.
- Gooi de PBS in de katheter met een pipet in het bekerglas van afval.
- Herhaal PBS wassen (stappen 3,4-3,6) voor twee meer tijden.
Opmerking: Het is essentieel te werken voorzichtig tijdens deze stappen wassen. Bloed in de katheter of de mislukking van automatische uitgaande stroom van vloeistof duidt meestal op de urethra is doorboord door. Het is ook belangrijk om te voorkomen dat de invoering van luchtbellen, zoals ze de electroporation efficiëntie zal afnemen.
4. plasmide levering
- Toepassing van 70% ethanol op de buik van de muis en met een scalpel te maken van een verticale insnijding van 1 cm tot het openen van de buikhuid boven de blaas.
- Pipetteer van ten minste 20 µL plasmide plus Trypan blauw oplossing in het buitenste einde van de katheter, en bevestig de injectiespuit.
- Injecteren de plasmide-oplossing in de blaas. Als de blaas blauw, is de injectie succesvol. Laat wat vloeistof in de katheter te voorkomen dat er luchtbellen in de blaas.
- Pak de externe urethrale opening met pincet en verwijder vervolgens de katheter en spuit. Een tekenreeks aan te scherpen de externe urethrale opening gebruiken. Maak twee lussen met de tekenreeks en vervolgens binden met twee knopen.
Opmerking: Aanscherping van de urethrale is belangrijk voor het voorkomen van terugvoer van plasmide vloeistof. - Inschakelen van de electroporation generator met de volgende parameters: 33V, 50 ms werktijd, en 950 ms intervaltijd.
- Houd de blaas met een pincet en knijpen van de blaas met twee elektroden. Druk de voetpedaal voor het uitvoeren van de electroporation.
Opmerking: De elektrische pulsen worden ingesteld op 5 keer met korte tussenpozen optreden na iedere pedal push. De muis kan trillen in dit proces. Meer dan eens het voetpedaal duwen kan verhogen de efficiëntie van de levering, maar teveel elektrische pulsen kunnen beschadigen de integriteit van de weefsels van de urothelium.- Vermijd ieder contact tussen de pincet en de elektroden, omdat dit zal het genereren van een vonk.
5. herstel
- Suture van de buik- en huid opening met steriele chirurgische hechtdraad en clips. Toepassing van jodium op de wond.
- Het dier uit het Isofluraan systeem verwijderen. Buprenorfine pijnstiller (0,1 mg/kg) subcutaan te verlichten na chirurgische pijn te beheren.
- Houd het dier op de verwarming pad en terug te sturen naar de kooi na volledig herstel. Controleer het dier ten minste eenmaal per dag voor normale mobiliteit, drink- en voederinrichtingen gedrag en geen tekenen van infectie tot de incisie is genezen en verwijder vervolgens de clips. Latere injecties van buprenorfine pijnstiller beheren als het dier pijn symptoom wordt weergegeven zoals verminderd verzorgen, agressiviteit en vocalisatie verhoogd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om aan te tonen van het succes van de levering van het gen in de urothelium van de blaas, hebben we de pCAG-GFP15 plasmide voor electroporation gebruikt. 20 µL van plasmiden en Trypan Blue oplossing werd geïnjecteerd via de urinebuis en 5 elektrische pulsen werden toegediend. Na 48u, we ontleed de muis blaas en waargenomen patches van GFP fluorescentie onder een dissectie fluorescentie Microscoop, terwijl een negatieve controle blaas die niet ondergaan electroporation toonde geen GFP-signaal (figuur 1A). Wanneer we uitgevoerd immunofluorescentie kleuring van verdeelde blaas weefsels met cytokeratin (CK) 5, CK18, en GFP antilichamen, vonden we dat GFP signaal was aanwezig in de paraplu, tussenliggende, en basale cellen, maar niet in de spier laag (figuur 1B), die goede specificiteit van plasmide bezorging binnen de urothelium aangeeft. Ongeveer 15% van de urothelial cellen zijn GFP+, en dergelijke klonale aard zou ideaal zijn voor kanker modellering omdat tumoren meestal van afzonderlijke cellen initiëren.
Figuur 1: succesvolle levering van pCAG-GFP plasmide aan de muis blaas urothelium. (A) de vergelijking van een blaas die onderging electroporation (rechts) naar een negatieve controle blaas (links) toont dat electroporation succesvol draaide de blaas groen. (B) immunofluorescentie kleuring van verdeelde blaas weefsels mozaïek-expressiepatroon van GFP+ cellen in paraplu tonen (CK18+), intermediate (CK5+CK18+), en basale (CK5+) urothelial lagen. Schaal bar in A overeenkomt met 1 mm, en met B 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electroporation verhoogt de permeabiliteit van de celmembraan en is een krachtige technologie voor gene electrotransfer16. Gene levering in levende knaagdieren door electroporation is vaak gebruikt in de neurobiologie velden17,18,19,20,21. De potentiële toepassingen in vele andere organen hebben niet uitgebreid onderzocht. Om onze kennis is onze hier beschreven methode het eerste verslag na succesvolle gene levering door electroporation aan de urothelium van de blaas. Het biedt een aantal voordelen aan de besmetting met adenovirus, lentivirus-gebaseerde methoden. Ten eerste, de electroporation methode is eenvoudiger, veiliger en goedkoper te nemen omdat niet-virale genetische vectoren worden gebruikt en de levering van DNA-plasmiden aan specifieke orgel sites in vivo betrekkelijk eenvoudig is. Ten tweede, het vermijdt de ongewenste host immuunrespons die vaak geassocieerd met de levering door virus vectoren22 worden. Ten derde, in het geval van blaas ontkent het de behoefte aan chemische voorbehandeling van de glycosaminoglycaan laag, die normaal virus binding aan urothelial cellen blokken.
De belangrijkste stappen in dit protocol zijn de catheterisatie, spoelen en plasmide injectie. Extra zorg en zachte behandeling nodig zijn om ervoor te zorgen dat de katheter niet via de plasbuis of de blaas muur doorboren bij het uitvoeren van de invoegpositie en toevoegen/verwijderen van de spuit. Toepassing van passende smeermiddel om het volledig te dekken de buitenste oppervlakte van de katheter is ook van essentieel belang. Een andere mogelijke oorzaak van mislukking is de invoering van luchtbellen in de blaas tijdens spoelen en plasmide injectie, aangezien het elektrische geleidbaarheid zal afnemen. Om dit te voorkomen, is het raadzaam altijd verlaten wat vloeistof in de katheter bij het uitvoeren van deze stappen.
Ons protocol zou moeten werken voor volwassen muizen van elke leeftijd, omdat we niet een verschil in de efficiëntie van de levering tussen jongere (2 maanden) en oudere (1 jaar) muizen observeren deed. Verschillende factoren kunnen invloed zijn plasmide levering efficiëntie. Het is raadzaam 20 µL van plasmide als de minimale volume voor injectie als lager bedrag kan geen voldoende betrekking op de binnenzijde van de blaas. Toenemende plasmide volume en concentratie in het algemeen resulteert in hogere penetratie, maar geen extra voordeel werd waargenomen voor volumes dan 60 µL. geven van meer elektrische pulsen en aanraken van de verschillende oppervlakten van de blaas met elektroden zal hebben de grootste invloed op de verbetering van de efficiëntie van de levering. De parameters van de electroporation beschreven in dit protocol is ingesteld op toestaan van permeabilization van urothelial cellen met behoud van de integriteit van het weefsel, aangezien hogere spanning neigt ertoe celdood. Het is mogelijk aan tweak deze parameters voor verdere optimalisatie. Muis-tot-muis variaties en de behandeling van de onderzoeker kunnen de efficiëntie sterk beïnvloeden. Afhankelijk van het doel van het project, is het raadzaam voor het uitvoeren van proeven om te bepalen van de beste parameters voor elke specifieke experiment. Bijvoorbeeld, in het modelleren kanker initiatie en klonen groei, kan een lagere penetratie wensen.
Als een bewijs-van-principe voor onze leveringsmethode, GFP expressie kan worden gevisualiseerd in de blaas zo spoedig 36 h na electroporation, en gedurende ten minste twee weken kan aanhouden. Met deze nieuwe methode is het nu mogelijk om te leveren van DNA-plasmiden naar de blaas van de muis snel en goedkoop voor gene overexpressie of down-regulatie en genoom bewerken. Het opent nieuwe mogelijkheden voor studie blaas ontwikkeling en ziekten, evenals het bouwen van nieuwe autochtone blaas kanker modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende rente.
Acknowledgments
Wij danken Professor Bin Chen, Dr. Yue Zhang en Kendy Hoang voor hulp bij het opzetten van het systeem electroporation. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Santa Cruz Cancer voordeel Group en NIH voor Z.A.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
- Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
- Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
- Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
- Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
- Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
- Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).
