Summary
Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.
Abstract
Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) são extremamente valiosos em revelando romance biológicas insights sobre os mecanismos de iniciação e progressão de doenças como o câncer. Os ratos transgénicos e condicional nocaute foram usados frequentemente para superexpressão do gene ou ablação em tecidos específicos ou célula tipos em vivo. No entanto, gerar modelos de rato germline pode ser demorada e dispendiosa. Recentes avanços no gene edição de tecnologias e a viabilidade de entrega de plasmídeos de DNA por infecção viral permitiram a rápida geração de modelos de câncer não-germline autóctones do mouse para vários órgãos. A bexiga é um órgão que tem sido difícil para vetores virais acessar, devido à presença de uma camada de glicosaminoglicano cobrindo o Urotélio. Aqui, descrevemos um método novo desenvolvido em laboratório para entrega eficiente de plasmídeos de DNA no rato bexiga Urotélio em vivo. Através de instilação intravesical de plasmídeo de DNA pCAG-GFP e eletroporação de bexiga cirurgicamente exposta, nós mostramos que o plasmídeo de DNA pode ser entregues especificamente nas células uroteliais da bexiga para expressão transiente. Nosso método fornece uma maneira rápida e conveniente para superexpressão e nocaute de genes na bexiga do mouse e pode ser aplicado para a construção de GEMMs de câncer de bexiga e outras doenças urológicas.
Introduction
Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) têm jogado um papel essencial em expandir o nosso conhecimento sobre o desenvolvimento animal, gene funções in vivoe mecanismos de progressão de doença1,2. GEMMs do germline tradicionalmente são desenvolvidos de duas maneiras. A primeira é a criação de ratos transgênicos por injeção pró-nuclear do plasmídeo de DNA seguido a transplantação de zigotos pseudopregnant mulheres. A outra é a geração de batida-para fora/TOC-em ratos por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias e o desenvolvimento de quimeras. Nocaute condicional de genes num tipo específico de tecido ou célula de interesse envolve a criação de alelos geneticamente modificados com Cre e flox sites para várias gerações. Todo o processo pode ser caro e demorado, especialmente se o objetivo é atingir múltiplos genes tecido-especificamente. Recentemente, tecnologias de edição de gene como clusterizadas regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) foram aplicadas aos vários órgãos dos ratos para induzir alterações genéticas de tecido-específica para o cancro autóctone modelagem3, 4,5,6,7 ou doença correta mutações em situ8,9. Nesses estudos, a entrega dos vetores gRNA geralmente foi conseguida através de adenovírus ou particulas de Lentivirus infecção do órgão ou injeção de cauda-veia hidrodinâmica. A relativa facilidade de entrega dos componentes CRISPR para o pulmão e o fígado tem melhorado muito a conveniência e eficiência de câncer nesses órgãos em comparação com os modelos tradicionais de rato Cre-Lox com base de modelagem.
O bexiga Urotélio é onde a maioria dos tumores de bexiga são originários. A entrega dos vetores de DNA para a bexiga Urotélio para terapia de modelagem ou o gene do câncer é dificultada por uma camada de glicosaminoglicano na superfície apical urotelial, que age como uma barreira para a aderência do vírus infeccioso10,11. Vários agentes de pré-tratamento como Syn3 e o dodecil-β-d-maltoside tem sido utilizados para romper essa barreira e melhorar adenovírus infecção eficiência12,13,14. Se o vírus adeno-associado (AAVs) efetivamente podem infectar a bexiga não foi relatado. Em geral, um método de entrega com base não-virais seria desejável. Aqui, descrevemos um método inovador desenvolvido no laboratório para entrega eficiente do plasmídeo de DNA para o Urotélio rato através de cateterismo de uretra e eletroporação. Porque a nossa abordagem não implica pré-tratamento químico da camada glicosaminoglicano ou produção de vírus, significativamente simplifica a entrega de plasmídeos de DNA no rato Urotélio de bexiga e deve facilitar estudos em vivo doenças da bexiga.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos aqui foram realizados em conformidade com as diretrizes e normas da institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia em Santa Cruz.
1. plasmídeo e preparação de ferramentas
- Para cada bexiga transfect, preparar pelo menos 20 µ l de DNA do plasmídeo (1 µ g / µ l).
- Adicione 1 µ l de Trypan azul para a 20 µ l de solução de plasmídeo em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Pipeta para misturar bem.
- Autoclave cirúrgica todos os instrumentos e esterilizar a área de trabalho com 70% de etanol. Spray instrumentos cirúrgicos e luvas com etanol a 70% com frequência ou usar um esterilizador de grânulo de vidro ao executar as seguintes etapas para manter condições estéreis.
2. médico-Légal Animal
- Use um sistema de anestesia superior de tabela para anestesiar o animal com isoflurano. Ligue o tanque2 O e ajuste o medidor de fluxo de oxigênio para 1 L/min.
- Coloca um rato adulto de C57BL/6J feminino na câmara de indução. Ativar e ajustar o vaporizador de isoflurano para 3% para a indução. O mouse deve estar em anestesia dentro de 2 min. administrar analgésico de buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea após a remoção do mouse da câmara de indução para analgesia preemptiva.
Nota: No presente protocolo, ratos fêmeas são usados, porque são mais fáceis de trabalhar com durante cateterismo de uretra. O protocolo também funciona para ratos masculinos, mas um cuidado adicional é necessária ao executar a etapa 3. - Aplica a pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar ressecamento. Coloque o mouse anestesiado virado para cima sobre uma almofada de aquecimento com seu nariz do cone de nariz. Gire o interruptor de circuito de ar para soltar isoflurano através do cone de nariz.
- Conter a cabeça e o cone de nariz com fita adesiva. Ajuste o vaporizador de isoflurano para 2% para manutenção.
- Conter os membros com fita adesiva. Realize testes de dedo-pinch para certificar-se de que o animal está em anestesia profunda e em seguida, raspar a região abdominal.
3. urina depleção e lavagem da bexiga
- Aplique lubrificante ao cateter (24G, comprimento de 2,11 cm, diâmetro externo de 0,045 cm) e certifique-se de que sua superfície externa é totalmente coberto.
- Insira o cateter na abertura da uretra e lentamente empurre-os até atingir a bexiga, momento em que a urina deve fluir através do cateter. Pressione suavemente o abdômen para ajudar a depleção de urina.
- Verifique se o cateter é inserido corretamente a bexiga, observando a urina automática out-fluxo. Evitar a perfuração da parede da uretra e da bexiga e aplique o lubrificante várias vezes se necessário.
- Descarte a urina com uma pipeta para um copo de resíduos.
- Pipete 80 µ l de soro de tampão fosfato (PBS) para a extremidade externa do cateter, com a outra extremidade ainda na bexiga. Cuidadosamente, anexe uma seringa de 1 mL para o cateter. Empurre suavemente a seringa para injetar a PBS para a bexiga. Embora alguns PBS o cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga.
- Remova a seringa. Espere para PBS drenar para fora da bexiga. Pressione suavemente o abdômen para evacuar PBS.
- Descarte a PBS o cateter com uma pipeta para o copo de resíduos.
- Repita PBS lavagem (etapas 3.4-3.6) para mais duas vezes.
Nota: É essencial trabalhar suavemente durante estas etapas de lavagem. Sangue no cateter ou falhas de automatic out-fluxo de líquido geralmente indica a uretra é perfurada através de. Também é importante evitar a introdução de bolhas de ar, como eles irão diminuir a eficiência de eletroporação.
4. plasmídeo entrega
- Aplicar o etanol a 70% no abdômen do mouse e usar um bisturi para fazer uma incisão vertical de 1 cm para abrir a pele abdominal acima da bexiga.
- Pipetar pelo menos 20 µ l de solução de azul de Trypan além de plasmídeo a extremidade externa do cateter e aplique a seringa.
- Injete a solução de plasmídeo da bexiga. Se a bexiga ficar azul, a injeção é bem sucedida. Deixe algum líquido no cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga.
- Pegue o orifício uretral externo usando uma pinça e em seguida, retire o cateter e a seringa. Use uma sequência de caracteres para apertar o orifício uretral externo. Faça dois loops com a sequência de caracteres e em seguida amarre com dois nós.
Nota: Aperto do uretral é importante para prevenir o refluxo de líquido do plasmídeo. - Liga o gerador de eletroporação com os seguintes parâmetros: 33V, 50 ms de tempo de trabalho e tempo de intervalo de ms 950.
- Segurar a bexiga com uma pinça e comprima a bexiga com dois eletrodos. Pressione o pedal para executar a eletroporação.
Nota: Os impulsos elétricos são definidos para ocorrer 5 vezes com intervalos curtos após cada impulso pedal. O mouse pode contorcer-se neste processo. Empurrar o pedal mais uma vez que pode aumentar a eficiência de entrega, mas também muitos pulsos elétricos podem danificar a integridade do tecido do Urotélio.- Evite qualquer contacto entre a pinça e os eletrodos, como isso irá gerar uma faísca.
5. recuperação
- Suture a abertura abdominal e pele com esterilizados para suturas cirúrgicas e clipes. Aplica iodo sobre o ferimento.
- Retire o animal do sistema de isoflurano. Administre analgésico buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea para aliviar a dor pós-cirúrgica.
- Manter o animal sobre a almofada de aquecimento e devolvê-lo para a gaiola em casa depois da recuperação completa. Verifique se o animal pelo menos uma vez por dia para mobilidade normal, beber e alimentar comportamentos e sem sinais de infecção até que a incisão é curado e remova os grampos. Administre injeções subsequentes de buprenorfina analgésico se o animal exibe sintoma de dor, tais como reduzida aliciamento, aumento da agressividade e vocalização.
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Representative Results
Para demonstrar o sucesso da entrega do gene para a bexiga Urotélio, usamos o plasmídeo de15 pCAG-GFP para eletroporação. 20 µ l de solução de azul de Trypan e plasmídeo foi injetado através da uretra e 5 pulsos elétricos foram administrados. Após 48 h, nós dissecado a bexiga de rato e observadas manchas de fluorescência de GFP sob um microscópio de fluorescência de dissecação, Considerando que um negativo controlar a bexiga que não sofreu electroporation não mostrou nenhum sinal GFP (figura 1A). Quando realizamos a mancha da imunofluorescência de tecidos da bexiga seccionado com citoqueratinas (CK) 5, CK18, e anticorpos GFP, encontramos que a GFP sinal estava presente no guarda-chuva, intermediária e células basais, mas não no músculo da camada (figura 1B), indicando boa especificidade da entrega do plasmídeo no Urotélio. Aproximadamente 15% das células uroteliais são GFP+, e tal natureza clonal deve ser ideal para câncer modelagem desde tumores geralmente iniciar de células individuais.
Figura 1: sucesso na entrega do plasmídeo pCAG-boas práticas agrícolas para o rato bexiga Urotélio. (A) comparação de uma bexiga que foi submetido a eletroporação (à direita) para uma bexiga de controlo negativo (à esquerda), mostrando que electroporation ficou com êxito a bexiga verde. Imunofluorescência (B) a coloração dos tecidos bexiga seccionado, mostrando o padrão de expressão de mosaico de células GFP+ no guarda-chuva (CK18+), intermediário (CK5+CK18+) e basal (CK5+) camadas urotelial. Barra de escala em A corresponde a 1 mm e em B 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Electroporation aumenta a permeabilidade da membrana celular e é uma tecnologia poderosa para gene electrotransfer16. Entrega do gene em roedores vivos por eletroporação tem sido frequentemente usada em neurobiologia campos17,18,19,20,21. Suas aplicações potenciais em muitos outros órgãos não tem sido exploradas extensivamente. A nosso conhecimento, nosso método descrito aqui é o primeiro relatório de entrega bem sucedida gene por eletroporação de Urotélio a bexiga. Oferece diversas vantagens para os métodos baseados em adenovírus/lentivirus infecção. Primeiro, o método de eletroporação é mais fácil, mais seguro e mais barato adotar porque vetores genéticos não-virais são utilizados e a entrega de plasmídeos de DNA para órgão específico sites na vivo é relativamente simples. Em segundo lugar, evita as respostas imunes indesejáveis do hospedeiro que são frequentemente associadas com a entrega pelo vírus vetores22. Em terceiro lugar, no caso da bexiga, ele nega a necessidade de pré-tratamento químico da camada de glicosaminoglicano, que normalmente bloqueia a ligação do vírus às células uroteliais.
As etapas mais críticas no presente protocolo são a cateterização, enxaguar e injeção de plasmídeo. Cuidado extra e manipulação suave são necessárias para garantir que o cateter não perfurar através da uretra ou da parede da bexiga, ao realizar a inserção e colocar e retirar a seringa. Aplique o lubrificante adequado para cobrir totalmente o exterior superfície do cateter também é essencial. Outra causa provável da falha é a introdução de bolhas de ar na bexiga durante a injeção de enxaguamento e plasmídeo, pois isso irá diminuir a condutividade elétrica. Para evitar isso, recomendamos sempre deixar algum líquido no cateter ao executar essas etapas.
Nosso protocolo deve funcionar para ratos adultos de qualquer idade, porque nós não observaram diferença na eficiência de entrega entre os mais jovens (2 meses) e mais velhos ratos (1 ano). Vários fatores podem influenciar a eficiência de entrega do plasmídeo. Nós recomendamos 20 µ l de plasmídeo como o volume mínimo para injeção como menor quantidade pode não cobrir suficientemente a superfície interior da bexiga. Aumentar o volume do plasmídeo e concentração geralmente produz maior penetração, mas nenhum benefício adicional foi observado para volumes além de 60 µ l. dando mais pulsos elétricos e tocar em diferentes áreas de superfície da bexiga com eletrodos terá o maior impacto na melhoria de eficiência de entrega. Os parâmetros de eletroporação, descritos neste protocolo é definido para permitir a permeabilização de células uroteliais, preservando a integridade do tecido, desde que maior tensão tende a induzir a morte celular. É possível ajustar esses parâmetros para otimizar ainda mais. Rato de variações e a manipulação do pesquisador podem afetar a eficiência consideravelmente. Dependendo do objetivo do projeto, recomendamos executar testes para determinar os melhores parâmetros para cada experimento específico. Por exemplo, na iniciação do câncer e crescimento clonal de modelagem, uma baixa penetração pode ser desejada.
Como um prova de princípio para o nosso método de entrega, expressão de GFP pode ser visualizada na bexiga logo em 36 h após electroporation e pode persistir pelo menos duas semanas. Com este novo método, agora é possível entregar plasmídeos de DNA para a bexiga de rato, rápida e barata para superexpressão do gene ou para baixo-regulamento e edição de genoma. Ele abre novos caminhos para estudar o desenvolvimento da bexiga e doenças, bem como a construção de modelos de câncer de bexiga autóctones romance.
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Disclosures
Os autores não declaram nenhum interesse de concorrente.
Acknowledgments
Agradecemos o Professor Chen Bin, Dr. Yue Zhang e Kendy Hoang para ajuda com a configuração do sistema de eletroporação. Este trabalho foi financiado por doações do grupo de benefício de câncer de Santa Cruz e NIH para Z.A.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
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