JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Published: July 03, 2018
doi:
10.3791/57796
, , , ,
1Department of Physiology,University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics,Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

Denne artikkelen beskriver bestemte metoder for å få biokjemiske mengder vaskemiddel-solubilized TRPV1 for spectroscopic analyse. Kombinert protokollene gir biokjemiske og Biofysiske verktøy som kan tilpasses for å lette strukturelle og funksjonelle studier for pattedyr ionekanaler i en membran-kontrollert miljø.

Abstract

Polymodal ionekanaler transduce flere stimuli av forskjellige naturer allosteric endringer; disse dynamiske konformasjonen er utfordrende å finne og forblir hovedsakelig ukjent. Med nylige fremskritt innen enkelt-partikkel cryo-elektron mikroskopi (cryo-EM) belyse strukturfunksjonene av Agonistiske bindende områder og aktivisering mekanisme flere ionekanaler, er scenen satt for en dynamisk dybdeanalyse av deres gating mekanismer bruke spektroskopiske tilnærminger. Spektroskopiske teknikker som elektron spinn resonans (EPR) og doble elektron-elektron resonans (DEER) har vært hovedsakelig begrenset til studiet av prokaryote ionekanaler som kan bli renset ved store mengder. Kravet for store mengder funksjonelle og stabil membran proteiner har hemmet studiet av pattedyr ion kanalene benytter disse tilnærmingene. EPR og HJORT tilby mange fordeler, inkludert fastsettelse av strukturen og dynamiske endringer av mobile protein regioner, om enn på lav oppløsning, som kan være vanskelig å få Røntgenkrystallografi eller cryo-EM, og overvåking reversibel gating Overgang (dvs., lukket, åpen, oppmerksomme og ufølsomme). Her gir vi protokoller for å få milligram funksjonelle vaskemiddel-solubilized forbigående reseptor potensielle kasjon kanal gruppe V medlem 1 (TRPV1) som kan merkes for EPR og HJORT spektroskopi.

Introduction

Med nylige fremskritt innen enkelt-partikkel cryo-elektronmikroskop (cryo-EM), er pattedyr ion kanal strukturer anskaffet på en ekstraordinær. Spesielt har strukturelle studier av polymodal ionekanaler, for eksempel forbigående reseptor potensielle vanilloid 1 (TRPV1), gitt videre forståelse dens aktivisering mekanismer1,2,3, 4 , 5. men dynamisk informasjon om ionekanaler i en membran miljø er nødvendig for å forstå deres polymodal gating og narkotika-bindende mekanismer.

Elektron spinn resonans (EPR) og doble elektron-elektron resonans (DEER) spectroscopies har gitt noen av de mest endelige mekanistisk modellene for ion kanaler6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. disse metodene har vært hovedsakelig begrenset til undersøkelse av prokaryote og archeal ion kanaler som gir mye vaskemiddel-renset proteiner når overexpressed i bakterier. Med utviklingen av eukaryote membran proteiner produksjon i insekt og pattedyrceller funksjonelle og strukturelle karakterisering14,15,16er det nå mulig å få biokjemiske mengder vaskemiddel-renset proteiner for spektroskopiske studier.

EPR og HJORT signaler oppstår fra en paramagneticspin etikett (SL) (dvs., methanethiosulfonate) knyttet til en enkelt-cystein rester i protein. Spin-etikettene rapportere tre typer strukturinformasjon: bevegelse, accessibilities og avstander. Denne informasjonen kan avgjøre om rester er gravlagt i protein eller utsettes for membran eller vandig miljø i apo og ligand binding stater13,17,18,19. I forbindelse med en kodebasert struktur (når tilgjengelig), gir EPR og HJORT dataene en samling av betingelser for deriving dynamiske modeller i sitt eget miljø mens overvåking reversibel gating overgang (dvs., lukket, åpen oppmerksomme og ufølsomme). Videre kan fleksibel områder som kan være vanskelig å fastslå Røntgenkrystallografi eller cryo-EM oppnås ved hjelp av disse miljømessige datasett tilordne sekundære strukturer samt plassering i protein20. Cryo-EM strukturer innhentet i lipid nanodiscs gitt verdifull informasjon om gating av ion kanaler3,21,22,23,24, 25; men kan spektroskopiske tilnærminger gi dynamisk informasjon fra conformational stater (f.eks, termisk endringer) som kan være vanskelig å fastslå bruker cryo-EM.

Mange vanskeligheter må overvinnes for å implementere EPR og HJORT, inkludert mangel på protein-funksjonen når du fjerner alle cystein rester (spesielt rikelig i pattedyr kanaler), lav protein avkastning, protein ustabilitet under rensing og etter spinn merking , protein kontonumre i vaskemiddel eller liposomer. Her har vi utviklet protokoller for å overvinne disse kritiske barrierer og har fått HJORT og EPR spectra informasjon for et pattedyr sensoriske reseptorene. Formålet her er å beskrive metoder for uttrykket, rensing, merking og rekonstituering av en funksjonell minimal cystein mindre rotte TRPV1 (eTRPV1) konstruere for spectroscopic analyser. Denne metoden er egnet for de membran proteinene som holder sin funksjon til tross for fjerning av cystein rester eller inneholder cystein danner disulfide obligasjoner. Denne samlingen av protokoller kan tilpasses for spectroscopic analyse av andre pattedyr ionekanaler.

Protocol

1. TRPV1 mutagenese Merk: En minimal TRPV1 konstruksjon for spectroscopic analyse26 ble bygget fra full lengde cystein mindre kanal TRPV127 med metoden for polymerase kjedereaksjon (PCR) (figur 1). Denne cystein mindre minimal TRPV1 konstruksjonen (referert til som eTRPV1 heretter) består av rester 110-603 og 627-764. eTRPV1 ble klonet pMO (en pcDNA3.1-baserte vektor) for funksjonsanalyse og en rekombinant donor vekto…

Representative Results

Funksjonell karakteristikk av Minimal cystein mindre TRPV1 konstruere (eTRPV1) og Single-cystein mutanter Første skritt mot spektroskopiske studier er å ingeniør og karakterisere cystein mindre protein konstruksjoner (figur 2A) som er funksjonelle og gi biokjemiske mengder proteiner. eTRPV1 fungerer som bestemmes av Ca2 + bildebehandling og TEVC (figur 2B<str…

Discussion

Dagens teknologi for uttrykk og rensing av pattedyr membran proteiner har gjort det mulig å skaffe tilstrekkelige mengder protein for spektroskopiske studier14,15,16,42. Her har vi tilpasset disse teknologiene for å uttrykke, rense, Rekonstituer og utføre spectroscopic analyser i TRPV1.

Blant de viktige trinnene i protokollen, nedenfor er de som vi har utført fei…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er svært takknemlig til Dr. H. Mchaourab for å gi tilgang til EPR og HJORT spektrometre og Dr. T. Rosenbaum for å gi den full lengde cystein mindre TRPV1 plasmider.

Materials

QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 – Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  2. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
  3. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
  4. Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
  5. Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
  6. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
  7. Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
  8. Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
  9. Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
  10. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
  11. Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
  12. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  13. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
  14. Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  16. Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
  17. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
  18. Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
  19. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
  20. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
  21. Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
  22. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  23. Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
  24. McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
  25. Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L., Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
  26. Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
  27. Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
  28. Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
  29. Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
  30. Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
  31. Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
  32. Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
  34. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
  35. Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
  36. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
  37. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  38. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
  39. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  40. Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
  41. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
  42. He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
  43. Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).

Tags

TRPV1Ion ChannelSpectroscopic AnalysisElectron Paramagnetic ResonanceDouble Electron Electron ResonanceConformational ChangesThermal GatingLight-independent GatingPCR MutagenesisRecombinant BacmidETRPV1Cysteine Mutants

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image