Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.
Polymodal iyon kanalları farklı doğada birden çok uyaranlara allosteric değişiklikler transduce; Bu dinamik biçimler belirlemek ve büyük ölçüde bilinmeyen kalmak için zorlu. Agonist bağlayıcı siteleri yapısal özellikleri ve birkaç iyon kanalları etkinleştirme mekanizması tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) dökülme ışık son gelişmeler ile sahne onların perdeleme derinlemesine bir dinamik analiz için hazır Spektroskopik yaklaşımları kullanarak mekanizmaları. Spektroskopik teknikleri elektron paramagnetic rezonans (EPR) ve çift elektron-elektron rezonans (geyik) gibi esas olarak büyük miktarlarda saf prokaryotik iyon kanalları incelenmesi için sınırlı olmuştur. Fonksiyonel ve istikrarlı membran proteinlerinin büyük miktarda gereksinimini memeli iyon kanalları bu yaklaşımları kullanarak çalışma engel. EPR ve geyik birçok avantaj, x-ışını kristalografisi veya cryo-EM tarafından elde etmek zor olabilir, düşük çözünürlükte olsa, yapısının belirlenmesi ve mobil protein bölgelerin dinamik değişiklikler dahil olmak üzere ve geri dönüşümlü geçişi izleme sunar geçiş (sensitize ve desensitizedyani, kapalı, açık,). Burada, biz iletişim kuralları için EPR ve GEYİĞE Spektroskopi etiketli deterjan çözündürüldükten fonksiyonel geçici reseptör potansiyel ba * kanal Alt familya V üye 1 (TRPV1) miligram almak için sağlar.
Tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) son gelişmeler ile olağanüstü bir hızla memeli iyon kanal yapıları elde edilmiştir. Özellikle, polymodal iyon kanalları, geçici reseptör potansiyel vanilloid 1 (TRPV1), gibi yapısal çalışmaların daha fazla anlayış onun harekete geçirmek mekanizmaları1,2,3, sağladı 4 , 5. ancak, dinamik bir membran ortamında gömülü iyon kanalları vukuf onların polymodal perdeleme ve uyuşturucu bağlama düzenekleri anlamak için gereklidir.
Elektron paramagnetic rezonans (EPR) ve çift elektron-elektron rezonans (geyik) spectroscopies iyon kanalları6,7,8,9 için en kesin mekanik modellerin bazıları hazırladık , 10 , 11 , 12 , 13. bu yaklaşımlar prokaryotik incelenmesi için esas olarak sınırlı olmuştur ve archeal iyon kanalları çok miktarda bakteri overexpressed zaman deterjan saf protein verim. Ökaryotik membran protein üretiminde böcek ve fonksiyonel ve yapısal karakterizasyon14,15,16memeli hücreleri gelişmesiyle birlikte, şimdi biyokimyasal elde etmek mümkündür miktarda deterjan saf protein spektroskopik çalışmalar için.
EPR ve geyik sinyalleri bir tek-sistein kalıntı proteini içerisinde bağlı bir paramagneticspin etiket (SL) (Örneğin, methanethiosulfonate) ortaya. Spin-Etiketler üç yapısal bilgi türlerinden rapor: hareket, eriþebilirlik ve mesafeler. Bu bilgiler tortular protein içinde gömülü veya membran veya apo ve ligand bağlı Birleşik13,17,18,19sulu ortamda maruz belirleme sağlar. Yüksek çözünürlüklü bir yapı (varsa) bağlamında, EPR ve geyik veri dinamik modeller kendi doğal ortamlarında tersinir gating geçiş (yani, kapalı, açık, süre izleme türetmek için kısıtlamalar topluluğu sağlar. duyarlı ve desensitized). Ayrıca, x-ışını kristalografisi veya cryo-EM tarafından belirlemek zor olabilir esnek bölgeleri ikincil yapılar yanı sıra protein20içinde yer atamak için bu çevresel veri kümeleri kullanarak elde edilebilir. Cryo-EM yapıları lipid nanodiscs elde edilen sağlanan iyon geçişi hakkında değerli bilgi kanalları3,21,22,23,24, 25; Ancak, spektroskopik yaklaşımlar cryo-EM kullanarak belirlemek zor olabilir konformasyon Birleşik (Örneğin, termal değişiklikler) üzerinden dinamik bilgi sağlayabilir.
EPR ve geyik tüm sistein kalıntıları (özellikle bol miktarda memeli kanalları), düşük protein verim, protein istikrarsızlık arıtma sırasında ve sonrasında spin etiketleme kaldırırken protein fonksiyon eksikliği de dahil olmak üzere, uygulamak için birçok zorlukların üstesinden gelmek ve deterjan veya lipozomlar protein toplama. Burada, bu kritik engellerin üstesinden gelmek ve bir memeli duyusal reseptör için geyik ve EPR spectra bilgilerini aldıysanız protokolleri tasarladık. Burada amaç ifade, arıtma, etiketleme ve sulandırma fonksiyonel en az sistein-az sıçan TRPV1 (eTRPV1) spektroskopik analizleri için oluşturmak için yöntemleri tarif etmektir. Bu metodoloji işlevlerine sistein kalıntıları kaldırılması rağmen tutmak veya disülfür bağları oluşturan sistein içeren bu membran proteinlerinin için uygundur. Bu koleksiyon iletişim kurallarının diğer memeli iyon kanalları spektroskopik analiz için adapte.
İfade ve memeli membran proteinlerinin arınma için güncel teknolojileri protein spektroskopik çalışmalar14,15,16,42için yeterli miktarda elde etmek mümkün kılmıştır. Burada, hızlı, arındırmak, yeniden oluşturma ve spektroskopik çözümlemesi TRPV1 içinde bu teknolojiler adapte olması.
Arasında protokol kritik adımlarda, aşağıda TRPV1 için …
The authors have nothing to disclose.
Dr. H. EPR ve geyik Spektrometreler erişim sağlamak için Mchaourab ve Dr. T. Rosenbaum tam uzunlukta sistein-az TRPV1 plazmid sağlamak için minnettarız.
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 210519-5 | |
2-Propanol (Isopropanol) | Fisher Scientific | A416 | |
Albumin Bovine Serum (BSA) | GoldBio.com | A-420-10 | |
Amylose resin | NEB | E8021L | |
Aprotinin | GoldBio.com | A-655-25 | |
Asolectin from Soybean | Sigma | 11145 | |
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen Life Technologies | 10359016 | |
Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) | Drummond Scientific | 3-000-203 G/X | |
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) | Sutter Instrument | B150-110-10HP | |
CaCl2 2H2O | Fisher Scientific | C79 | |
Carbenicillin (Disodium) | GoldBio.com | C-103-5 | |
Cellfectin Reagent | Invitrogen Life Technologies | 10362-010 | |
cellSens | Olympus | ||
Chloroform | Fisher Scientific | C606SK | |
Collagenase Type 1 | Worthington-Biochem | LS004196 | |
Critiseal | VWR | 18000-299 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
D-(+)-Maltose Monohydrate | Fisher Scientific | BP684 | |
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Sigma | D0572 | |
Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 45-000-148 | |
EGTA | Fisher Scientific | O2783 | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10082-147 | |
Fluo-4 AM | Life Technologies | F-14201 | |
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Science, Inc | 2160250 | |
GenCatch PCR Cleanup Kit | Epoch Life Science, Inc | 2360050 | |
Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
Glass capillary (25 µl) | VWR | 53432-761 | |
Glass Flask 2800 mL | Pyrex USA | 4423-2XL | |
Glycerol | Fisher BioReagents | BP229 | |
HEK293S GnTl- | ATCC | CRL-3022 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) | GoldBio.com | I2481C25 | |
Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
KCl | Fisher Chemical | P217 | |
LB Broth, Miller | Fisher bioReagents | BP1426 | |
Leupeptin Hemisulfate | GoldBio.com | L-010-5 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen Life Technologies | 11668-019 | |
MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | BP214 | |
MgSO4 7H2O | Fisher Scientific | BP213 | |
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Ambion | AM1344 | |
MOPS | Fisher bioReagents | BP2936 | |
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate | Toronto Research Chemicals, Inc | O873900 | |
NaCl | Fisher Chemical | S271 | |
Opti-MEM | Life Technologies | 31985-062 | |
Pepstatin A | GoldBio.com | P-020-5 | |
Pluronic Acid F-127 (20%) | PromoKine | CA707-59004 | |
PMSF | GoldBio.com | P4170 | |
Poly-L-lysine Solution | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Sealed capillary | VitroCom | special order | |
SF-900 II SFM (insect cell medium) | Gibco, Life Technologies | 10902-088 | |
Sf9 Cells (SFM Adapted) | Invitrogen Life Technologies | 11496-015 | |
Soybean Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids, Inc | 541602C | |
Sucrose | Fisher Scientific | S25590 | |
Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 29091596 | |
TCEP HCl | GoldBio.com | TCEP1 | |
Tetracyclin Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152 | |
Tryptone | Difco | 0123-01 | |
X-gal | GoldBio.com | X4281C | |
Xenopus oocytes | Nasco | LM00935M | |
XL1 – Blue Competent Cells | Agilent Technologies, Inc | 200249 | |
Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | |
Econo-Pack chromatography column | Bio-Rad | 7321010 | |
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels | Bio-Rad | 17000436 | |
pFastBac1 Expression Vector | Invitrogen Life Technologies | 10360-014 | |
DH10Bac Competent Cells | Invitrogen Life Technologies | 10361-012 | |
Critiseal capillary tube sealant | Leica Microsystems | 02-676-20 | |
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers | Applied Biosystems | 4359571 | |
Transfer pipete | Fishebrand | 13-711-9AM | |
Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 |