Summary

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Published: July 03, 2018
doi:

Summary

Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.

Abstract

Polymodal iyon kanalları farklı doğada birden çok uyaranlara allosteric değişiklikler transduce; Bu dinamik biçimler belirlemek ve büyük ölçüde bilinmeyen kalmak için zorlu. Agonist bağlayıcı siteleri yapısal özellikleri ve birkaç iyon kanalları etkinleştirme mekanizması tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) dökülme ışık son gelişmeler ile sahne onların perdeleme derinlemesine bir dinamik analiz için hazır Spektroskopik yaklaşımları kullanarak mekanizmaları. Spektroskopik teknikleri elektron paramagnetic rezonans (EPR) ve çift elektron-elektron rezonans (geyik) gibi esas olarak büyük miktarlarda saf prokaryotik iyon kanalları incelenmesi için sınırlı olmuştur. Fonksiyonel ve istikrarlı membran proteinlerinin büyük miktarda gereksinimini memeli iyon kanalları bu yaklaşımları kullanarak çalışma engel. EPR ve geyik birçok avantaj, x-ışını kristalografisi veya cryo-EM tarafından elde etmek zor olabilir, düşük çözünürlükte olsa, yapısının belirlenmesi ve mobil protein bölgelerin dinamik değişiklikler dahil olmak üzere ve geri dönüşümlü geçişi izleme sunar geçiş (sensitize ve desensitizedyani, kapalı, açık,). Burada, biz iletişim kuralları için EPR ve GEYİĞE Spektroskopi etiketli deterjan çözündürüldükten fonksiyonel geçici reseptör potansiyel ba * kanal Alt familya V üye 1 (TRPV1) miligram almak için sağlar.

Introduction

Tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) son gelişmeler ile olağanüstü bir hızla memeli iyon kanal yapıları elde edilmiştir. Özellikle, polymodal iyon kanalları, geçici reseptör potansiyel vanilloid 1 (TRPV1), gibi yapısal çalışmaların daha fazla anlayış onun harekete geçirmek mekanizmaları1,2,3, sağladı 4 , 5. ancak, dinamik bir membran ortamında gömülü iyon kanalları vukuf onların polymodal perdeleme ve uyuşturucu bağlama düzenekleri anlamak için gereklidir.

Elektron paramagnetic rezonans (EPR) ve çift elektron-elektron rezonans (geyik) spectroscopies iyon kanalları6,7,8,9 için en kesin mekanik modellerin bazıları hazırladık , 10 , 11 , 12 , 13. bu yaklaşımlar prokaryotik incelenmesi için esas olarak sınırlı olmuştur ve archeal iyon kanalları çok miktarda bakteri overexpressed zaman deterjan saf protein verim. Ökaryotik membran protein üretiminde böcek ve fonksiyonel ve yapısal karakterizasyon14,15,16memeli hücreleri gelişmesiyle birlikte, şimdi biyokimyasal elde etmek mümkündür miktarda deterjan saf protein spektroskopik çalışmalar için.

EPR ve geyik sinyalleri bir tek-sistein kalıntı proteini içerisinde bağlı bir paramagneticspin etiket (SL) (Örneğin, methanethiosulfonate) ortaya. Spin-Etiketler üç yapısal bilgi türlerinden rapor: hareket, eriþebilirlik ve mesafeler. Bu bilgiler tortular protein içinde gömülü veya membran veya apo ve ligand bağlı Birleşik13,17,18,19sulu ortamda maruz belirleme sağlar. Yüksek çözünürlüklü bir yapı (varsa) bağlamında, EPR ve geyik veri dinamik modeller kendi doğal ortamlarında tersinir gating geçiş (yani, kapalı, açık, süre izleme türetmek için kısıtlamalar topluluğu sağlar. duyarlı ve desensitized). Ayrıca, x-ışını kristalografisi veya cryo-EM tarafından belirlemek zor olabilir esnek bölgeleri ikincil yapılar yanı sıra protein20içinde yer atamak için bu çevresel veri kümeleri kullanarak elde edilebilir. Cryo-EM yapıları lipid nanodiscs elde edilen sağlanan iyon geçişi hakkında değerli bilgi kanalları3,21,22,23,24, 25; Ancak, spektroskopik yaklaşımlar cryo-EM kullanarak belirlemek zor olabilir konformasyon Birleşik (Örneğin, termal değişiklikler) üzerinden dinamik bilgi sağlayabilir.

EPR ve geyik tüm sistein kalıntıları (özellikle bol miktarda memeli kanalları), düşük protein verim, protein istikrarsızlık arıtma sırasında ve sonrasında spin etiketleme kaldırırken protein fonksiyon eksikliği de dahil olmak üzere, uygulamak için birçok zorlukların üstesinden gelmek ve deterjan veya lipozomlar protein toplama. Burada, bu kritik engellerin üstesinden gelmek ve bir memeli duyusal reseptör için geyik ve EPR spectra bilgilerini aldıysanız protokolleri tasarladık. Burada amaç ifade, arıtma, etiketleme ve sulandırma fonksiyonel en az sistein-az sıçan TRPV1 (eTRPV1) spektroskopik analizleri için oluşturmak için yöntemleri tarif etmektir. Bu metodoloji işlevlerine sistein kalıntıları kaldırılması rağmen tutmak veya disülfür bağları oluşturan sistein içeren bu membran proteinlerinin için uygundur. Bu koleksiyon iletişim kurallarının diğer memeli iyon kanalları spektroskopik analiz için adapte.

Protocol

1. TRPV1 Mutagenesis Not: En az bir TRPV1 yapı spektroskopik Analizi26 tam uzunlukta sistein-az kanal TRPV127 polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi (resim 1) kullanılarak inşa edilmiştir. (ETRPV1 bundan sonra adlandırılır) bu sistein-az en az TRPV1 yapı kalıntıları 110-603 ve 627-764 oluşur. eTRPV1 klonlanmış pMO (pcDNA3.1 tabanlı vektör) fonksiyonel analiz için ve 8 x histidin maltoz bağlayıcı…

Representative Results

En az sistein-az TRPV1 oluşturmak (eTRPV1) ve tek-sistein mutantlar fonksiyonel karakterizasyonu Spektroskopik çalışmalar doğru ilk adım mühendisi ve fonksiyonel ve biyokimyasal proteinler miktarlarda verim sistein-az protein yapıları (Şekil 2A) karakterize olduğunu. eTRPV1 Ca2 + görüntüleme ve TEVC (Şekil 2B-C) tarafından belirl…

Discussion

İfade ve memeli membran proteinlerinin arınma için güncel teknolojileri protein spektroskopik çalışmalar14,15,16,42için yeterli miktarda elde etmek mümkün kılmıştır. Burada, hızlı, arındırmak, yeniden oluşturma ve spektroskopik çözümlemesi TRPV1 içinde bu teknolojiler adapte olması.

Arasında protokol kritik adımlarda, aşağıda TRPV1 için …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. H. EPR ve geyik Spektrometreler erişim sağlamak için Mchaourab ve Dr. T. Rosenbaum tam uzunlukta sistein-az TRPV1 plazmid sağlamak için minnettarız.

Materials

QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 – Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

References

  1. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  2. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
  3. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
  4. Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
  5. Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
  6. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
  7. Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
  8. Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
  9. Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
  10. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
  11. Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
  12. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  13. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
  14. Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  16. Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
  17. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
  18. Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
  19. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
  20. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
  21. Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
  22. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  23. Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
  24. McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
  25. Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L., Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
  26. Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
  27. Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
  28. Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
  29. Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
  30. Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
  31. Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
  32. Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
  34. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
  35. Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
  36. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
  37. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  38. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
  39. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  40. Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
  41. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
  42. He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
  43. Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).

Play Video

Cite This Article
Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

View Video