Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için
Summary
Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.
Abstract
Polymodal iyon kanalları farklı doğada birden çok uyaranlara allosteric değişiklikler transduce; Bu dinamik biçimler belirlemek ve büyük ölçüde bilinmeyen kalmak için zorlu. Agonist bağlayıcı siteleri yapısal özellikleri ve birkaç iyon kanalları etkinleştirme mekanizması tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) dökülme ışık son gelişmeler ile sahne onların perdeleme derinlemesine bir dinamik analiz için hazır Spektroskopik yaklaşımları kullanarak mekanizmaları. Spektroskopik teknikleri elektron paramagnetic rezonans (EPR) ve çift elektron-elektron rezonans (geyik) gibi esas olarak büyük miktarlarda saf prokaryotik iyon kanalları incelenmesi için sınırlı olmuştur. Fonksiyonel ve istikrarlı membran proteinlerinin büyük miktarda gereksinimini memeli iyon kanalları bu yaklaşımları kullanarak çalışma engel. EPR ve geyik birçok avantaj, x-ışını kristalografisi veya cryo-EM tarafından elde etmek zor olabilir, düşük çözünürlükte olsa, yapısının belirlenmesi ve mobil protein bölgelerin dinamik değişiklikler dahil olmak üzere ve geri dönüşümlü geçişi izleme sunar geçiş (sensitize ve desensitizedyani, kapalı, açık,). Burada, biz iletişim kuralları için EPR ve GEYİĞE Spektroskopi etiketli deterjan çözündürüldükten fonksiyonel geçici reseptör potansiyel ba * kanal Alt familya V üye 1 (TRPV1) miligram almak için sağlar.
Introduction
Tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) son gelişmeler ile olağanüstü bir hızla memeli iyon kanal yapıları elde edilmiştir. Özellikle, polymodal iyon kanalları, geçici reseptör potansiyel vanilloid 1 (TRPV1), gibi yapısal çalışmaların daha fazla anlayış onun harekete geçirmek mekanizmaları1,2,3, sağladı 4 , 5. ancak, dinamik bir membran ortamında gömülü iyon kanalları vukuf onların polymodal perdeleme ve uyuşturucu bağlama düzenekleri anlamak için gereklidir.
Elektron paramagnetic rezonans (EPR) ve çift elektron-elektron rezonans (geyik) spectroscopies iyon kanalları6,7,8,9 için en kesin mekanik modellerin bazıları hazırladık , 10 , 11 , 12 , 13. bu yaklaşımlar prokaryotik incelenmesi için esas olarak sınırlı olmuştur ve archeal iyon kanalları çok miktarda bakteri overexpressed zaman deterjan saf protein verim. Ökaryotik membran protein üretiminde böcek ve fonksiyonel ve yapısal karakterizasyon14,15,16memeli hücreleri gelişmesiyle birlikte, şimdi biyokimyasal elde etmek mümkündür miktarda deterjan saf protein spektroskopik çalışmalar için.
EPR ve geyik sinyalleri bir tek-sistein kalıntı proteini içerisinde bağlı bir paramagneticspin etiket (SL) (Örneğin, methanethiosulfonate) ortaya. Spin-Etiketler üç yapısal bilgi türlerinden rapor: hareket, eriþebilirlik ve mesafeler. Bu bilgiler tortular protein içinde gömülü veya membran veya apo ve ligand bağlı Birleşik13,17,18,19sulu ortamda maruz belirleme sağlar. Yüksek çözünürlüklü bir yapı (varsa) bağlamında, EPR ve geyik veri dinamik modeller kendi doğal ortamlarında tersinir gating geçiş (yani, kapalı, açık, süre izleme türetmek için kısıtlamalar topluluğu sağlar. duyarlı ve desensitized). Ayrıca, x-ışını kristalografisi veya cryo-EM tarafından belirlemek zor olabilir esnek bölgeleri ikincil yapılar yanı sıra protein20içinde yer atamak için bu çevresel veri kümeleri kullanarak elde edilebilir. Cryo-EM yapıları lipid nanodiscs elde edilen sağlanan iyon geçişi hakkında değerli bilgi kanalları3,21,22,23,24, 25; Ancak, spektroskopik yaklaşımlar cryo-EM kullanarak belirlemek zor olabilir konformasyon Birleşik (Örneğin, termal değişiklikler) üzerinden dinamik bilgi sağlayabilir.
EPR ve geyik tüm sistein kalıntıları (özellikle bol miktarda memeli kanalları), düşük protein verim, protein istikrarsızlık arıtma sırasında ve sonrasında spin etiketleme kaldırırken protein fonksiyon eksikliği de dahil olmak üzere, uygulamak için birçok zorlukların üstesinden gelmek ve deterjan veya lipozomlar protein toplama. Burada, bu kritik engellerin üstesinden gelmek ve bir memeli duyusal reseptör için geyik ve EPR spectra bilgilerini aldıysanız protokolleri tasarladık. Burada amaç ifade, arıtma, etiketleme ve sulandırma fonksiyonel en az sistein-az sıçan TRPV1 (eTRPV1) spektroskopik analizleri için oluşturmak için yöntemleri tarif etmektir. Bu metodoloji işlevlerine sistein kalıntıları kaldırılması rağmen tutmak veya disülfür bağları oluşturan sistein içeren bu membran proteinlerinin için uygundur. Bu koleksiyon iletişim kurallarının diğer memeli iyon kanalları spektroskopik analiz için adapte.
Protocol
Representative Results
Discussion
İfade ve memeli membran proteinlerinin arınma için güncel teknolojileri protein spektroskopik çalışmalar14,15,16,42için yeterli miktarda elde etmek mümkün kılmıştır. Burada, hızlı, arındırmak, yeniden oluşturma ve spektroskopik çözümlemesi TRPV1 içinde bu teknolojiler adapte olması.
Arasında protokol kritik adımlarda, aşağıda TRPV1 için …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. H. EPR ve geyik Spektrometreler erişim sağlamak için Mchaourab ve Dr. T. Rosenbaum tam uzunlukta sistein-az TRPV1 plazmid sağlamak için minnettarız.
Materials
| QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 210519-5 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fisher Scientific | A416 | |
| Albumin Bovine Serum (BSA) | GoldBio.com | A-420-10 | |
| Amylose resin | NEB | E8021L | |
| Aprotinin | GoldBio.com | A-655-25 | |
| Asolectin from Soybean | Sigma | 11145 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen Life Technologies | 10359016 | |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
| Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) | Drummond Scientific | 3-000-203 G/X | |
| Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) | Sutter Instrument | B150-110-10HP | |
| CaCl2 2H2O | Fisher Scientific | C79 | |
| Carbenicillin (Disodium) | GoldBio.com | C-103-5 | |
| Cellfectin Reagent | Invitrogen Life Technologies | 10362-010 | |
| cellSens | Olympus | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606SK | |
| Collagenase Type 1 | Worthington-Biochem | LS004196 | |
| Critiseal | VWR | 18000-299 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| D-(+)-Maltose Monohydrate | Fisher Scientific | BP684 | |
| DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
| High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Sigma | D0572 | |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 45-000-148 | |
| EGTA | Fisher Scientific | O2783 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F-14201 | |
| GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Science, Inc | 2160250 | |
| GenCatch PCR Cleanup Kit | Epoch Life Science, Inc | 2360050 | |
| Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
| Glass capillary (25 µl) | VWR | 53432-761 | |
| Glass Flask 2800 mL | Pyrex USA | 4423-2XL | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229 | |
| HEK293S GnTl- | ATCC | CRL-3022 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) | GoldBio.com | I2481C25 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217 | |
| LB Broth, Miller | Fisher bioReagents | BP1426 | |
| Leupeptin Hemisulfate | GoldBio.com | L-010-5 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Life Technologies | 11668-019 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | BP214 | |
| MgSO4 7H2O | Fisher Scientific | BP213 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Ambion | AM1344 | |
| MOPS | Fisher bioReagents | BP2936 | |
| MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate | Toronto Research Chemicals, Inc | O873900 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-062 | |
| Pepstatin A | GoldBio.com | P-020-5 | |
| Pluronic Acid F-127 (20%) | PromoKine | CA707-59004 | |
| PMSF | GoldBio.com | P4170 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sealed capillary | VitroCom | special order | |
| SF-900 II SFM (insect cell medium) | Gibco, Life Technologies | 10902-088 | |
| Sf9 Cells (SFM Adapted) | Invitrogen Life Technologies | 11496-015 | |
| Soybean Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids, Inc | 541602C | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590 | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 29091596 | |
| TCEP HCl | GoldBio.com | TCEP1 | |
| Tetracyclin Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Tris Base | Fisher BioReagents | BP152 | |
| Tryptone | Difco | 0123-01 | |
| X-gal | GoldBio.com | X4281C | |
| Xenopus oocytes | Nasco | LM00935M | |
| XL1 – Blue Competent Cells | Agilent Technologies, Inc | 200249 | |
| Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | |
| Econo-Pack chromatography column | Bio-Rad | 7321010 | |
| Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels | Bio-Rad | 17000436 | |
| pFastBac1 Expression Vector | Invitrogen Life Technologies | 10360-014 | |
| DH10Bac Competent Cells | Invitrogen Life Technologies | 10361-012 | |
| Critiseal capillary tube sealant | Leica Microsystems | 02-676-20 | |
| ABI Model 3130XL Genetic Analyzers | Applied Biosystems | 4359571 | |
| Transfer pipete | Fishebrand | 13-711-9AM | |
| Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 |
References
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
- Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
- Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
- Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
- Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
- Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
- Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
- Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
- Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
- Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
- Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
- Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
- Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
- McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
- Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
- Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
- Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
- Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
- Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
- Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
- McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
- Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L., Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
- Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
- Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
- Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
- Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
- Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
- Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
- Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
- Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
- Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
- Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
- Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
- Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
- Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
- Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
- Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
- He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
- Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).
