Summary
Podemos descrever métodos para isolar caninos neutrófilos do sangue inteiro e visualizar a formação líquida em neutrófilos ao vivo usando microscopia de fluorescência. Também descritos são protocolos para quantificar a formação líquida e citrulinado histona H3 (citH3) expressão usando microscopia de imunofluorescência.
Abstract
Em resposta à invasão de patógenos, os neutrófilos liberar neutrófilos armadilhas extracelulares (redes), que são redes extracelulares de DNA decorado com histonas e proteínas antimicrobianas. Formação excessiva de líquido (NETosis) e liberação de citH3 durante a sepse está associada a vários órgãos e mortalidade em ratos e seres humanos, mas suas implicações em cães são desconhecidas. Aqui, descrevemos uma técnica para isolar caninos neutrófilos do sangue inteiro para observação e quantificação de NETosis. Plasma rico em leucócitos, gerado pela sedimentação de dextrano, é separado por meios de separação gradiente de densidade comercialmente disponíveis e granulócitos coletados para contagem e testes de viabilidade celular. Para observar em tempo real NETosis em neutrófilos ao vivo, celular permeant e celular impermeant fluorescente do ácido nucleico manchas são adicionadas ao neutrófilos ativados por lipopolissacarídeo (LPS) ou phorbol myristate 12 13-acetato (PMA). Alterações na morfologia nuclear e formação líquida são observadas ao longo do tempo por microscopia de fluorescência. In vitro NETosis caracteriza-se ainda mais por co-colocalization do DNA de células livres (cfDNA), mieloperoxidase (MPO) e citrulinado histona H3 (citH3) usando um protocolo duplo-encontrava modificado. Para quantificar objectivamente formação líquida e citH3 expressão usando microscopia de fluorescência, redes e células citH3-positivo são quantificadas de forma cega usando software disponível. Esta técnica é um ensaio específico para avaliar em vitro capacidade dos neutrófilos caninos para submeter-se NETosis.
Introduction
Os neutrófilos são granulócitos curta duração responsáveis para a defesa inicial contra invasão de agentes patogénicos. Neutrófilos, recrutados para o local da infecção, eliminam microorganismos pela fagocitose, degranulação e geração de oxigênio reativo espécies (ROS)1. Na presença de bactérias ou Endotoxinas, neutrófilos liberação dos neutrófilos extracelular armadilhas (redes), composto de cromatina extracelular decorado com histonas e granulares proteínas como elastase e mieloperoxidase (MPO)2. Embora os NETs têm propriedades antimicrobianas indispensáveis, aumentar as evidências experimentais e clínicas sugere que excesso de zelo formação líquida durante a sepse pode levar a vários órgãos disfunção e morte3,4, 5 , 6.
Porque redes podem desempenhar um papel fisiopatológico semelhante em cães, intervenções terapêuticas que impedem ou diminuem a formação de líquido podem servir como estratégias de tratamento romance em animais sépticos. Por esta razão, há uma necessidade de uma técnica confiável avaliar e quantificar os componentes líquidos em cães e NETosis. NET componentes incluindo DNA sem célula (cfDNA) e os nucleossomas anteriormente foram avaliadas em neutrófilos caninos e plasma de cães clínico7,8,9. Utilizando ensaios de fluorescência, Goggs e Letendre encontraram que cães sépticos têm níveis mais elevados de cfDNA que cães saudáveis8. Embora essas técnicas sejam altamente objetiva e quantitativa, medição de cfDNA e os nucleossomas como marcadores de NETosis é específico já que eles podem ser derivados de células necróticas diferente NETosing neutrófilos. Aqui nós descrevemos uma técnica que utiliza a microscopia de fluorescência para examinar os comportamentos dos neutrófilos de NETosing ao vivo. Também detalhamos um protocolo modificado usando duplo-immunolabeling para quantificar subjetivamente redes e seus componentes como MPO e citH3 em canino neutrófilos10.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade da Califórnia, Davis e institucional Cuidado Animal (número de protocolo: 18338).
1. coleta de sangue
- Retire 10 mL de sangue ou a veia cefálica ou jugular, usando uma agulha 21G por aspiração de seringa.
- Para evitar excessiva tensão de cisalhamento, retire a agulha da seringa antes de transferir o sangue em tubos contendo heparina de sódio (USP 75). Inverta suavemente os tubos algumas vezes para garantir a mistura adequada de anticoagulante e sangue. Seleção de provas de coágulos ou agregados de células vermelhas, antes de colocar as amostras no gelo.
2. neutrófilo isolamento
- Dilua o sangue anticoagulado com um volume igual de fosfato salino do gelada Dubecco (DPBS) (pH 7,4, sem cátions divalentes). Transferência de 8 mL de sangue diluído em um tubo cónico polipropileno de 50 mL contendo 25 mL de dextrano de 3% (a partir de Leuconostoc spp. dissolvido em solução de cloreto de sódio 0,9%). Coloca o tubo na posição vertical em temperatura ambiente por 30 min permitir a agregação e sedimentação de eritrócitos.
- Cuidadosamente da camada em cima de 5 mL de mídia gradiente de densidade em um tubo de fundo redondo de polipropileno 14 mL 5 mL de plasma rico em leucócitos (Figura 1). Tenha cuidado para não misturar as 2 soluções11.
- Centrifuga os tubos a 400 x g com aceleração/desaceleração (A/D) definido como 0 (sem freio) por 30 min à temperatura ambiente.
- Usando um 5 mL pipeta sorológica recolher a camada de células de granulócitos por ignorar o plasma e camadas de células mononucleares (PBMC) de sangue periférico (Figura 1). Use uma outra pipeta cada vez para minimizar a contaminação.
- Lugar de 4 a 6 mL da camada de células polymorphnuclear (PMN) em um tubo cônico polipropileno de 50 mL. Desde que uma pequena quantidade de agregados de eritrócitos pode ser aspirada juntamente com a camada PMN, use uma pipeta sorológica 1ml para remover suavemente os agregados de eritrócitos que são liquidados na parte inferior do tubo.
- Lise as hemácias restantes com 20 mL de água ultrapura fria. Inverter suavemente o tubo várias vezes para 30 a 60 s para garantir a adequada lise antes de adicionar um volume igual de solução de cloreto de sódio 1,8% gelada.
- Centrifugar a 112 x g por 10 min a 4 ° C, A/D definido como 0.
- Repita a etapa de lise de eritrócitos se esta pelota aparece vermelha. Descartar o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta sorológica e suavemente resuspenda o pellet em 100 µ l de DPBS (dextrose 5 mM, 0.9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 e 1% albumina de soro bovino, pH 7,3). Combinar todas as células de ressuspensa e colocar no gelo.
- Realizar uma contagem de células usando um analisador de célula automatizada e verificar a contagem por um hemocytometer. Se necessário, concentrar PMN numa lâmina de vidro usando um cytocentrifuge (1.000 rpm, 5 min) e determinar a porcentagem de neutrófilos pela contagem do número de neutrófilos, o número total de células.
- Determinar a viabilidade dos neutrófilos através da realização de um teste de exclusão de trypan azul conforme descrito por Strober et al . 12 sucesso isolamento deve render uma viabilidade de 95 a 100% e neutrófilos devem ser superiores a 95%.
- Determine a concentração de neutrófilos multiplicando-se a contagem total de células com a viabilidade de porcentagem e neutrófilos por cento. Isolamento de sucesso deve produzir uma concentração de neutrófilos de 1,5 a 6 x 106/mL.
- Dilua os neutrófilos para uma concentração final de 1 x 106/mL com DPBS contendo dextrose 5 mM, 0.9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2e 1% de albumina de soro bovino com pH ajustado para 7,3.
3. fluorescente microscopia de neutrófilos ao vivo
- Lugar de 200 a 400 μL de neutrófilos (1 x 106/mL) em cada poço de um poli-L-lisina revestido chapa 12-poços de cultura. Permitir que os neutrófilos aderir ao fundo dos poços, incubando-se as células a 37 ° C por 30 min.
- Rotular os ácidos nucleicos com 1 μM de um dos dois corantes ácidos nucleicos, que manchas nas células com membranas intactas e que as manchas nas células com membranas permeáveis (ver Tabela de materiais), durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Ativar os neutrófilos com 100 lipopolissacarídeo μg/mL (LPS) (e. coli O55. B5), 100 nM phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) como controle positivo, ou quantidade equivalente de DPBS como controle negativo para 180 min a 37 ° C.
- Adquirir imagens usando o GFP (excitação: 470/22 nm, emissão: 525/50 nm) e vermelho Texas canais (excitação: 585/29 nm, emissão: 628/32 nm) na microscopia de fluorescência ampliação de 40 X nos seguintes pontos tempo: 30, 90, 120 e 180 min.
4. líquido de quantificação e detecção de componentes de rede usando a imunofluorescência
- Cuidadosamente coloque 18 mm diâmetro poli-D-lisina revestido lamínulas em poços de uma placa de cultura 12-poços. Rotule os poços adequadamente.
- Semente 100 a 200 μL de isolado de neutrófilos (1 x 106/mL) diretamente sobre as lamelas e permitir que os neutrófilos a aderir as lamínulas incubando-se as células a 37 ° C por 30 min.
- Ative os neutrófilos, conforme descrito no ponto 3.3. Inibir a formação de líquido por pretreating neutrófilos com 200 µΜ Cl-amidina (15 min, a 37 ° C) antes da ativação, conforme descrita por Li et al. 13 certifique-se de que o controle do veículo adequado (DMSO) é incluído no experimento.
- Remova cuidadosamente a lamínulas com pinça fina. Uma folha de película de parafina de camada mais um stand de tubo de ensaio para criar poços rasos e coloque 2 a 3 gotas de 4% PFA em cada bem10. Rotular os poços adequadamente e delicadamente Coloque as lamínulas de cabeça para baixo para os poços de PFA-cheia. Permitir que as células a fixar-se em temperatura ambiente por 20 min.
- Lave as células 3 vezes em DPBS por 5 min, movendo-as de um poço para a próxima.
- Se encontrava não pode ser executada logo após a fixação e a ativação de neutrófilos, permita lamínulas ser ar secado colocando as lamínulas viradas para cima em um pedaço de papel de absorvência. Lamínulas podem ser armazenadas por até 1 semana viradas para cima em uma placa de cultura de 12 poços rotulados a 4 ° C até posterior análise. Lave as células 3 vezes em DPBS por 1 min, usando a mesma técnica, conforme descrito em 4.4 antes de prosseguir para a próxima etapa.
- Para permeabilize células, delicadamente encostar o deslizamento da tampa de cabeça para baixo em uma queda de 1%, NP-40 para 1 min usando a técnica descrita em 4.4. Lavar 3 vezes em DPBS por 1 min em uma cadeira de balanço.
- Aleatoriamente, atribuir cada amostra para um número e use um marcador de ponto de diamante para rotular as lamelas em conformidade.
- Preparar e pratos de Petri individuais etiqueta forrado com película de parafina e coloque 100 a 200 μL de 5% de soro de cabra no filme (tampão de bloqueio). Coloque as lamelas de cabeça para baixo sobre o tampão de bloqueio. Coloque em uma cadeira de balanço e incubar durante 1 h a 37 ° C.
- Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço.
- Diluir o anticorpo primário (1: 400 histona de polyclonal anticitrulinado coelho H3 (citH3) em 5% de soro de cabra). Incube as células em pratos de Petri rotulado forrado com película de parafina. Coloque cada lamela de cabeça para baixo em 50 a 100 μL da solução diluída de anticorpo. Coloque em uma cadeira de balanço e incubar durante 1 h a 37° C.
- Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço.
- Diluído anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo (1: 200), no soro de cabra de 5%. Incube as células em pratos de Petri rotulado forrado com película de parafina. Coloque cada lamela de cabeça para baixo em 50 a 100 μL da solução diluída de anticorpo. Coloque em uma cadeira de balanço e incubar 1 h a 37 ° C, no escuro.
- Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço no escuro.
- Para a deteção simultânea da mieloperoxidase (MPO), siga as etapas a seguir para um protocolo de immunolabeling duplo modificado conforme descrito por Li et al. 13
- Incube as células em pratos de Petri rotulado forrado com película de parafina. Coloque cada lamela de cabeça para baixo em 100 a 200 μL de coelho 10% soro sob suave balançar (durante a noite, 4 ° C, no escuro).
- Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço no escuro.
- Incube a células em cabra de unconjugated 50 μg/mL anticoelho Fab fragmentos para 2 h à temperatura ambiente em um roqueiro no escuro.
- Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço no escuro.
- Dilua o anticorpo primário (1: 200 coelho anti-humano MPO anticorpo polyclonal) no soro de cabra de 5%. Incube as células em pratos de Petri rotulado forrado com película de parafina. Coloque cada lamela de cabeça para baixo em 50 a 100 μL da solução diluída de anticorpo. Coloque em uma cadeira de balanço e incubar 1 h a 37° C, no escuro.
- Diluir o anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo em 5% de soro de cabra e incubar conforme descrito em 4,8
- Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço no escuro.
- Controles de interferência devem ser preparadas por excluindo incubação com ambos os anticorpos primários na segunda etapa imune-rotulagem.
- Mancha de DNA com 300 nM de 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, dicloridrato (DAPI) por 5 min no escuro à temperatura ambiente.
- Lavar 3 vezes em DPBS por 1 min em uma cadeira de balanço no escuro.
- Aplique uma gota (~ 50 μl) de antidesgaste para montagem numa lâmina de vidro. Bata levemente a extremidade da lamela em um papel absorvente para remover o tampão em excesso antes de montar a lamela com as células de cabeça para baixo. O meio de montagem deve formar uma fina camada entre a lamínula e a lâmina de vidro. Para remover as bolhas de ar, pressione suavemente na lamela com pinça fina.
- Permitir que as amostras curar durante a noite, no escuro a 4 ° C. O meio de montagem deve endurecer por análise microscópica com lentes de imersão. Armazenar as amostras em 4 ° C, no escuro.
5. neutrófilos extracelular armadilha quantificação
- Cego aos operadores adquirir e analisar as imagens do microscópio para condições experimentais.
- Usando um microscópio de fluorescência na ampliação de X 40, com 10 imagens aleatoriamente de diferentes regiões de cada lamela em um experimento sob os respectivos canais. Certifique-se de que o tempo de exposição, brilho e contraste de cada canal são mantidos consistentes em toda a aquisição de imagens.
- Analise as imagens usando o software disponível como ImageJ (NIH). Identifica redes com base na localização co de cfDNA, citH3 e MPO (Figura 3A, B). Quantificar o número de redes e neutrófilos em 10 campos aleatórios para cada condição experimental. Números de redes lançado pode ser expressa como uma razão (número de redes: número total de neutrófilos) para cada condição experimental.
- Para avaliar os efeitos do tratamento na expressão intracelular citH3, contar o número de neutrófilos com citH3 intracelular e número de neutrófilos sem citH3 intracelular em 10 campos aleatórios na ampliação de X 40 sob os respectivos canais ( Figura 3, setas vermelhas). Expressão citH3 intracelular pode ser expressa como a relação entre número de neutrófilos com intracelular citH3 para o número de neutrófilos sem citH3 intracelular.
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Representative Results
Usando este protocolo de imagem de célula viva, os investigadores podem observar a morfologia nuclear, integridade da membrana plasmática e presença de cfDNA na vida de neutrófilos. Um corante nuclear impermeant de célula manchas vermelho de ácidos núcleos em células com as membranas das células danificadas. Célula-permeant outro corante, rótulos os ácidos nucleicos intracelular em células vivas com membranas de plasma intactas. Todos os neutrófilos intactos, independentemente de seus tratamentos, devem aparecer verdes e exibem os núcleos lobulados característicos de 0 a 30 min após estimulação (Figura 2A). Núcleos de neutrófilos PMA-Tratado começam a perder sua aparência lobulada por cerca de 60 min e continuar a decondense até o lançamento do cfDNA (Figura 2B). LPS, um estimulante mais lento e mais fisiológico de neutrófilos caninos, normalmente não resulta em ocorre descondensação da cromatina ou NETosis até 90 min após estimulação (Figura 2B). Por 120 min, LPS e PMA-ativado neutrófilos podem ser vistos rodeado por cfDNA. Em comparação com LPS, neutrófilos ativado mais-PMA perdem sua integridade de membrana plasmática, como eles estão manchados de vermelho pelo corante impermeant celular (Figura 2). Unstimulated neutrófilos (controle DPBS) devem manter núcleos lobulados e a membrana plasmática intacta durante todo o período de incubação (Fig. 2A-C).
NET componentes consistindo de cfDNA, citH3 e grânulos de MPO são detectados usando o protocolo duplo immunolabeling. Lançamento de redes, identificadas com base na localização co de cfDNA, citH3 e MPO, em resposta ao LPS e PMA são mostrados na Figura 3A e 3B, respectivamente. Os neutrófilos estimulados por LPS para 180 min produzem discretas web-como andaimes de redes nas proximidades de neutrófilos nas proximidades (Figura 3A). Em contraste, PMA-ativado neutrófilos produziram grande quantidade de redes que estavam visivelmente maiores em área (Figura 3B, D). Citrullination das histonas H3, catalisada pela enzima peptidylarginine deiminase (PAD), é uma marca registrada de NETosis. PMA, um estimulante potente do PAD, resulta em um número maior de células expressando intracelular citH3 comparado com neutrófilos unstimulated e LPS-estimulada (Figura 3E).
Figura 1: um diagrama esquemático demonstrando as etapas de isolamento dos neutrófilos canina. Sangue heparinizado diluído é primeiro misturado com 3% de dextran para sedimentação de glóbulos vermelhos (RBC). Plasma rico em leucócitos é então coletado e mergulhado em volumes iguais de mídia de separação gradiente de densidade comercialmente disponível. Após centrifugação (400 x g, 30 min), a camada de hemácias-granulócitos é extraída e as restantes hemácias são removidas por lise hipotónica. Após adição de 1,8% NaCl, granulócitos são girados para baixo (112 x g, 5 min) e resuspended no buffer dedicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagens fluorescentes representante de neutrófilos caninas ao vivo. Os neutrófilos isolados foram ativados com 100 µ g/mL LPS, volume de 100 nM PMA, ou equivalente de fosfato salino do Dubecco (DPBS) como controlo negativo para um total de 180 min. ácidos nucleicos em neutrófilos intactos ao vivo estavam manchadas de verde com o uso de um celular-permeant tintura, enquanto cfDNA e neutrófilos com comprometimento das membranas celulares estavam manchados de vermelho com uma tintura célula-impermeant. (A, D) DPBS e LPS-tratados com neutrófilos todos mantiveram uma membrana celular intacta com núcleos lobulados (asterisco). (A, E) Os núcleos de neutrófilos PMA-ativado começaram a sofrer ocorre descondensação (setas). (B, F) Por 90 min, a maioria dos núcleos em neutrófilos ativados por LPS ou PMA tinham perdido sua aparência lobulada (setas azuis). (C) após 120 min, todos os neutrófilos ativado PMA tinham permeáveis membranas de plasma rodeadas por cfDNA enquanto cfDNA pode ser visto em torno de um pequeno número de neutrófilos LPS-ativado (setas). Os neutrófilos unstimulated não produziu cfDNA nem tinham comprometido a membrana celular em qualquer ponto do tempo (A-C). (A-B) Original 40 X ampliação. Barra de escala = 100 µm. (D-F) ampliação X 80. Barra de escala = 30 µm. experimento foi replicado duas vezes de neutrófilos isolados de 3 diferentes doadores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: formação NET. (A-C) Imagens de imunofluorescência representante da formação em vitro NET. Os neutrófilos isolados de um único doador foram fixados, permeabilizado e manchado por DNA (azul), mieloperoxidase (MPO, verde) e citrulinado histona H3 (citH3, vermelho) após estimulação com (A) 100 µ g/mL LPS, (B) 100 nM PMA ou DPBS (C) 180 min. redes, identificadas pela localização co de cfDNA, MPO e citH3, são delineadas (linhas pontilhadas) no (A) LPS - e neutrófilos (B) PMA-ativado. Exemplos da expressão intracelular de citH3 são indicados por setas vermelhas. (C) n redes nem citH3 intracelular são vistos em unstimulated neutrófilos. Barra de escala = 100 µm. (D, E) representante caixa e whisker parcelas de formação líquida e expressão intracelular citH3 em neutrófilos isolados de 4 cães. A caixa estende-se desde o 25th para 75th percentis e bigodes de calibração do menor para o maior valor. LPS e estimulação de PMA resultaram em significativa formação de líquido (D) e expressão de citH3 intracelular (E) em comparação com os neutrófilos unstimulated. + representa a dizer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresentamos aqui um protocolo para observar as alterações no lançamento de conformação e cfDNA núcleos na vida canina neutrófilos usando um corante permeant célula e um corante impermeant célula. A principal vantagem deste teste é que ela permite detecção em tempo real de formação líquida por microscopia de alta resolução em neutrófilos ao vivo sem fixação da pilha, portanto, fornecendo uma ferramenta simples e valiosa para a observação em vitro NET formação. Desde que este ensaio não requer anticorpos para a detecção de componentes de rede, é ideal para estudar NETosis em espécies com disponibilidade limitada de anticorpos espécie-específicos. Usando este ensaio, os autores demonstraram que os neutrófilos caninos sofrem ocorre descondensação da cromatina em LPS ou PMA estimulação antes da NETosis13. Uma grande desvantagem dessa técnica é que não é específico para NETosis. Porque o corante impermeant celular também manchas de ácidos nucleicos nas células necróticas ou ácidos nucleicos lançados de neutrófilos lisados, cfDNA ou célula células impermeant-positivo poderiam ser interpretadas falsamente como neutrófilos redes ou NETosing. Alternativamente, a especificidade do NETosis pode ser aumentada, incluindo neutrófilos PMA ou LPS-ativado que são pré-tratados com o inibidor de PAD4, Cl-amidina. Temos aqui demonstrado a importância de garantir a esterilidade e manuseio adequado dos neutrófilos durante todo o processo de isolamento como contaminação e as forças pura podem levar à necrose em vitro e lise de células. Também recomendamos que cumpram as temperaturas adequadas durante os protocolos e prevenção prolongada (> 1 min) lise hipotónica. Para confirmar a viabilidade de horas extras de neutrófilos isolados, um teste de exclusão de Trypan azul, bem como um controle negativo consistindo de neutrófilos unstimulated é altamente recomendado.
Porque cfDNA detectado por corantes de ácidos nucleicos célula-impermeável não é específico para NETosis, desenvolvemos um protocolo duplo-immunolabeling para quantificar em vitro NET formação e expressão intracelular citH3 em neutrófilos caninos. Como a liberação de neutrófilos granulares proteínas como MPO juntamente com cfDNA e citH3 para o espaço extracelular, líquida quantificação com base na localização co de cfDNA, citH3 e MPO é mais específica em comparação com outros ensaios como cfDNA, os nucleossomas ou complexo DNA-MPO 14. devido à limitada disponibilidade de anticorpos que reagem de forma cruzada com proteínas caninas, usamos os anticorpos primários que se originam de outra espécie (coelho). Para evitar a captura de anticorpos primários por sítios de ligação livre residual em anticorpos secundários em qualquer etapa do processo de coloração, primeiro utilizamos o soro de coelho, seguido por fragmentos Fab unconjugated saturar os sítios de ligação grátis. Um passo crítico deste procedimento é garantir uma lavagem adequada para impedir a ligação de excesso de imunoglobulinas e fragmentos Fab que podem interferir com deteção da segunda proteína de interesse. Também recomendamos que teste diferentes diluições de anticorpos primários e secundários para minimizar as interferências e ligação inespecífica. Para garantir que os anticorpos secundários de qualquer passo encontrava vincula especificamente para seu anticorpo primário, os investigadores devem incluir 2 controles diferentes que excluem qualquer anticorpo primário na segunda etapa encontrava. Ligação não-específica ocorre quando são detectados sinais de ambos os anticorpos secundários.
Histona citrullination ou desaminação, catalisada pela enzima peptidylarginine deminase 4 (PAD4), é essencial na NETosis bactérias associadas em camundongos e humanos15,16. Usando este ensaio, fomos capazes de determinar que NETosis induzida por LPS em cães também necessita de histona H3 citrullination por PAD13. Para testar se o estimulante de interesse induz NETosis pela ativação PAD4, recomendamos a inclusão de controles positivos usando ativadores de PAD4 conhecidos como PMA ou o ionóforo de cálcio, A2318717. Se os neutrófilos mostram negativos de coloração para citH3 nas amostras de controle positivo, o protocolo deve ser revisto até uma coloração positiva suficiente é resultou. Recomendamos também a inclusão de controles negativos biológicos constituído por neutrófilos unstimulated ou tratados com o inibidor PAD, Cl-amidine de neutrófilos.
Identificação precisa da estrutura de redes distinta pode ser um desafio usando esta técnica. Isto pode ser particularmente difícil em amostras com extensa NETosis, como a fusão das estruturas NET libertadas de vários neutrófilos adjacentes pode levar para a subestimação dos eventos NETotic. Os resultados deste teste podem ser correlacionados com outros ensaios mais objetivos como citometria de fluxo ou ELISA, que ainda não foram validados para uso em neutrófilos caninos. Para evitar a formação da estrutura de rede confluente, investigadores podem propagar uma menor concentração de células. Como alternativa, diminuir o tempo de incubação total pode evitar extensa NETosis e fusão de estruturas de rede. Embora este protocolo pode ser usado para investigar NETosis em outras espécies, com base na experiência dos autores, a resposta dos neutrófilos para LPS ou PMA pode variar muito entre espécies.
A descoberta de redes em cães destaca que o NETosis é um mecanismo conservado da imunidade inata durante infecção microbiana e doença imune-mediada. Os ensaios aqui apresentados podem ser uma ferramenta valiosa para o estudo da NETosis em cães e outras espécies. Uma melhor compreensão de NETosis induzida por sepse irá facilitar uma pesquisa mais adicional para o desenvolvimento de estratégias de tratamento inovador para sepse.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O autor correspondente foi financiado pela Morris Animal Foundation (D15CA-907). O estudo foi apoiado por fundos da Universidade da Califórnia, Davis, centro de saúde de equinos e centro de saúde de animais de companhia (2016-24-F). Os autores gostaria de reconhecer Geena Ng pela sua assistência com as figuras e Nghi Nguyen pela sua assistência com o vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
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