Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58083
Automatic Translation
1, 2
1Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

אנו מתארים שיטות כדי לבודד את הכלבים נויטרופילים של דם מלא, להמחיש את NET-צורה נויטרופילים בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ זריחה. גם המתוארים הם פרוטוקולים לכמת היווצרות נטו, citrullinated היסטון H3 (citH3) ביטוי באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence.

Abstract

בתגובה פתוגנים פולשים, נויטרופילים משחררים מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), אשר הן רשתות חוץ-תאי ה-DNA מעוטרים עם שינויים היסטוניים, חלבונים מיקרוביאלית. היווצרות מופרז נטו (NETosis), citH3 שחרור במהלך אלח דם קשורה בתפקוד איברים מרובים ותמותה בעכברים ובבני אדם אבל השלכותיו אצל כלבים אינם ידועים. במסמך זה, אנו מתארים שיטה לבודד נויטרופילים הכלבי מהדם כל תצפית, כימות של NETosis. ליקוציט עשיר פלזמה, שנוצר על ידי משקעי סחף לתוספי, מופרד באמצעות מדיה ההפרדה הדרגתיות צפיפות זמינים מסחרית ואסף גרנולוציטים עבור תא count ו בדיקות הכדאיות. לצפות NETosis בזמן אמת בנויטרופילים בשידור חי, תא permeant וכתמים impermeant פלורסנט חומצת גרעין התא מתווספים נויטרופילים הופעל על-ידי ליפופוליסכריד (LPS) או 13 12-פעילים phorbol-אצטט (PMA). שינויים מורפולוגיה גרעיני ויצירת רשת שנצפו לאורך זמן על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. במבחנה NETosis מאופיין בהמשך co-colocalization של התא ללא ה-DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) ו- citrullinated היסטון H3 (citH3) באמצעות פרוטוקול כפול-immunolabelling שונה. כדי לכמת באופן אובייקטיבי נטו היווצרות וביטוי citH3 באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, רשתות, תאים citH3-חיוביות הן לכמת באופן עיוור באמצעות תוכנה הזמינים. טכניקה זו היא assay ספציפיים כדי להעריך במבחנה הקיבולת של נויטרופילים הכלבי לעבור NETosis.

Introduction

הנויטרופילים הם אחראים על הביטחון הראשונית נגד פולשים גורמי מחלה קצרת ימים גרנולוציטים. נויטרופילים, גייס לאתר של זיהום, לחסל מיקרואורגניזמים phagocytosis, degranulation ועל הדור של חמצן תגובתי מינים (ROS)1. בנוכחות חיידקים או endotoxins, נויטרופילים שחרור נויטרופילים חוץ-תאית מלכודות (רשתות), המורכבת של כרומטין חוץ-תאית מעוצבים עם שינויים היסטוניים, חלבונים פרטנית כמו elastase myeloperoxidase (MPO)2. למרות רשתות יש מאפיינים מיקרוביאלית הכרחית, הוכחה ניסויית וקלינית גוברת מרמז כי היווצרות נטו נלהב במהלך אלח דם עלול להוביל מספר איברים בתפקוד ומוות3,4, 5 , 6.

כי רשתות עשויים לשחק תפקיד pathophysiological דומה אצל כלבים, התערבויות טיפוליות או למנוע או להפחית את היווצרות נטו עשוי לשמש אסטרטגיות טיפול חדשניים בבעלי חיים ספיגה. מסיבה זו, יש צורך טכניקה אמין להעריך ולכמת NETosis ורכיבים נטו אצל כלבים. רכיבים נטו כולל DNA ללא תא (cfDNA) ו נוקליאוזומים בעבר הוערכו נויטרופילים הכלביים, פלזמה כלבים קליני-7,-8,-9. באמצעות מבחני פלורסצנטיות, Goggs ו- Letendre מצא כי כלבים ספיגה יש רמות גבוהות יותר של cfDNA יותר בריאים הכלבים8. למרות טכניקות אלה הן מאוד אובייקטיביים, כמותיים, מדידה של cfDNA ושל נוקליאוזומים סמנים של NETosis היא לא ספציפית מאז הם הנגזרות תאים עם נמק פרט NETosing נויטרופילים. כאן נתאר טכניקה אשר מנצל פלורסצנטיות מיקרוסקופ כדי לבחון את התנהגויות של נויטרופילים NETosing בשידור חי. אנחנו גם פירוט פרוטוקול ששונתה באמצעות כפול-immunolabeling סובייקטיבי לכמת רשתות ורכיבים שלהם כגון MPO citH3 נויטרופילים הכלבי10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס (פרוטוקול מס: 18338).

1. דם אוסף

  1. לצייר 10 מ"ל של דם מכל אחת את הווריד cephalic או צוואר באמצעות מחט 21 G על ידי השאיפה מזרק.
  2. כדי למנוע עודף מאמץ גזירה, הסר את המחט המזרק לפני העברת דם לתוך צינור המכיל הפארין נתרן (75 USP). היפוך בעדינות הצינורות כמה פעמים כדי להבטיח ערבוב נאותה של קרישה והדם. בדיקה של קרישי דם או אגרגטים תא אדום לפני הצבת את הדוגמאות על קרח.

2. נויטרופילים בידוד

  1. לדלל דם anticoagulated עם אמצעי אחסון שווה תמיסת מלח של Dubecco קר כקרח באגירה פוספט (DPBS) (pH 7.4, בלי קטיונים דו ערכיים). העברה 8 מ של דם מדולל לתוך 50 מ ל פוליפרופילן חרוט צינור המכיל 25 מ של 3% לתוספי (מתוך spp. Leuconostoc המומסים בתמיסה נתרן כלוריד 0.9%). מקם את הצינור זקוף בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לאפשר צבירת והצטברות של אריתרוציטים.
  2. בזהירות שכבה 5 מיליליטר ליקוציט עשיר פלזמה (איור 1) מעל 5 מ של התקשורת הדרגתיות צפיפות צינור עגול-התחתון 14 מ ל פוליפרופילן. יש להיזהר לא לערבב את 2 פתרונות11.
  3. Centrifuge הצינורות ב x 400 גרם עם האצה/ההאטה (A/D) מוגדר כ- 0 (בלי בלמים) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. שימוש של 5 מ"ל pipet סרולוגית לאסוף את שכבת תאים גרנולוציט על-ידי עקיפת פלזמה של שכבות תאי תא (PBMC) דם היקפיים (איור 1). השתמש pipet חדש בכל פעם כדי למזער את הזיהום.
  5. מקום 4-6 מ"ל של השכבה תא polymorphnuclear (נויטרופיל) צינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ. מאז כמות קטנה של כדוריות דם אדומות אגרגטים עשוי להיות aspirated יחד עם השכבה נויטרופיל, להשתמש pipet סרולוגית של 1 מ"ל להסיר בעדינות מצרפי כדוריות דם אדומות אשר התיישבו בחלק התחתון של הצינור.
  6. Lyse של אריתרוציטים הנותרים עם 20 מ של מים קרים הנדסה גנטית. היפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים במשך 30 עד 60 s כדי להבטיח lysing נאותה לפני הוספת אמצעי שווה של קרח 1.8% נתרן כלורי פתרון.
  7. צנטריפוגה ב x 112 גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, A/D מוגדר כ- 0.
  8. חזור על השלב פירוק כדוריות דם אדומות אם גלולה זו נראית אדומה. למחוק את תגובת שיקוע בזהירות עם pipet סרולוגית, בעדינות resuspend בגדר ב 100 µL של DPBS (דקסטרוז 5 מ מ, MgCl מ מ2, CaCl 1.9 מ מ2 ו- 1% אלבומין שור, pH 7.3). לשלב את כל התאים resuspended ומניחים על קרח.
  9. לבצע ספירת תאים באמצעות מנתח אוטומטית תא ואמת הרוזן על-ידי hemocytometer. במידת הצורך, להתרכז PMNs על זכוכית באמצעות של cytocentrifuge (1,000 סל ד, 5 דקות), לקבוע את אחוזי נויטרופילים על ידי ספירת נויטרופילים מבין המספר הכולל של תאים.
  10. האילתים של נויטרופילים על-ידי ביצוע מבחן הדרה trypan blue כפי שתואר על ידי. Strober et al. 12 הבידוד מוצלח אמור להניב את הכדאיות של בין 95 ל- 100%, נויטרופילים צריך להיות גדול מ- 95%.
  11. לקבוע את הריכוז של נויטרופילים על-ידי הכפלת ספירת הכולל עם אחוז הכדאיות ואת אחוז נויטרופילים. הבידוד מוצלח אמור להניב ריכוז של נויטרופילים מ- 1.5 עד 6 x 106/mL.
  12. לדלל נויטרופילים כדי ריכוז סופי של עונה 1 פרק 106/mL עם DPBS המכיל דקסטרוז 5 מ מ, מ מ MgCl2, 1.9 מ מ CaCl2ו- 1% אלבומין שור עם pH להתאים ל- 7.3.

3. פלורסנט מיקרוסקופיה של נויטרופילים בשידור חי

  1. במקום 200 עד 400 μL של נויטרופילים (1 x 106/mL) כל טוב של פולי-L-ליזין מצופה צלחת תרבות 12-. טוב. לאפשר נויטרופילים לדבוק בתחתית הבארות מאת המקננת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. תווית חומצות גרעין עם 1 μM של אחד של שני צבעי חומצת גרעין, אחד כי כתמי בתאים עם ממברנות שלם ואחד כתמי בתאים עם חדיר ממברנות (ראה טבלה של חומרים), 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. להפעיל נויטרופילים עם μg/mL 100 ליפופוליסכריד (LPS) (e. coli O55. B5), 100 ננומטר phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) לשלוט, או מקביל בנפח DPBS כפקד שלילי עבור 180 דקות ב 37 º C.
  4. לרכוש תמונות באמצעות ה-GFP (עירור: 470/22 ננומטר, פליטת: 525/50 ננומטר) וערוצי טקסס אדום (עירור: 585/29 nm, פליטת: 628/32 ננומטר)-מיקרוסקופיה קרינה פלואורסצנטית בהגדלה X 40 נקודות בפעם הבאה: 30, 90, 120, 180 דקות.

4. נטו כימות וזיהוי מרכיבים נטו באמצעות Immunofluorescence

  1. בזהירות המקום 18 מ מ קוטר פולי-D-ליזין מצופה שער גולשת לתוך הבארות של צלחת תרבות 12-. טוב. תווית הבארות כראוי.
  2. זרעי μL 100-200 של מבודדים נויטרופילים (1 x 106/mL) ישירות על גבי coverslips ולאפשר נויטרופילים לדבוק שער גולשת על ידי המקננת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. הפעל נויטרופילים כמתואר ב- 3.3. לעכב היווצרות רשת על-ידי pretreating נויטרופילים עם 200 µΜ Cl-amidine (15 דקות, 37 ° C) לפני ההפעלה כפי שצוין בעבר שתואר על ידי Li. et al. 13 . ודא כי הפקד רכב מתאים (דימתיל סולפוקסיד) נכלל לניסוי.
  4. הסר בזהירות את שער גולשת עם מלקחיים משובחים. שכבה גיליון הסרט פרפין מעל דוכן מבחנה כדי ליצור בארות רדודים מקום 2-3 טיפות של 4% מחברים כל טוב10. תווית הבארות כראוי ולהניח בעדינות את שער גולשת במהופך על הבארות מלא מחברים. מאפשרים לתאים יהיה קבוע בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
  5. לשטוף את התאים 3 פעמים ב DPBS במשך 5 דקות, על-ידי הזזתם מבאר אחד למשנהו.
  6. אם לא ניתן לבצע immunolabelling זמן קצר לאחר הפעלת נויטרופילים, קיבוע, לאפשר שער גולשת להיות אוויר יבש על ידי הנחת את הפנים שער גולשת על פיסת נייר ספיגת. שער גולשת ניתן לאחסן עד 1 בשבוע פנים כלפי מעלה לתוך צלחת עם תוויות ברורות. ובכן 12 תרבות ב 4 ° C עד ניתוח נוסף. לשטוף את התאים 3 פעמים ב- DPBS עבור 1 דקות שימוש באותה השיטה כפי שמתואר 4.4 לפני שתמשיך לשלב הבא.
  7. כדי permeabilize תאים, בעדינות שכבה בתגית כיסוי במהופך על ירידה של 1% NP-40 דקות 1 בטכניקה המתוארת ב- 4.4. רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 1 דקות על כיסא נדנדה.
  8. באופן אקראי להקצות כל דגימה מספר ולהשתמש היהלום נקודת סמן לתייג את coverslips בהתאם.
  9. להכין, פטרי בודדים תווית מרופדת עם סרט פרפין ומניחים μL 100-200 של הסרום עיזים 5% על הסרט (חסימת מאגר). שכב על coverslips במהופך על המאגר חסימה. מניחים על כיסא נדנדה, תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
  10. רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 5 דקות על כיסא נדנדה.
  11. לדלל נוגדן ראשוני (1:400 ארנב polyclonal אנטי-citrullinated היסטון H3 (citH3) בנסיוב עיזים 5%). דגירה בתאים שכותרתו צלחות פטרי עם הסרט פרפין. שכבה בכל תגית כיסוי במהופך על 50 ל- 100 μL של הפתרון מדולל נוגדן. מניחים על כיסא נדנדה, תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
  12. רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 5 דקות על כיסא נדנדה.
  13. נוגדנים משניים שתדללו מצומדת fluorophore (1:200) בנסיוב עיזים 5%. דגירה בתאים שכותרתו צלחות פטרי עם הסרט פרפין. שכבה בכל תגית כיסוי במהופך על 50 ל- 100 μL של הפתרון מדולל נוגדן. מניחים על כיסא נדנדה, דגירה h 1 ב 37 מעלות צלזיוס בחושך.
  14. רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 5 דקות על כיסא נדנדה בחושך.
  15. גילוי בו-זמניות של myeloperoxidase (MPO) בצע את השלבים שלהלן עבור פרוטוקול ששונה immunolabeling זוגי כפי שתואר על ידי Li. et al. 13
  16. דגירה בתאים שכותרתו צלחות פטרי עם הסרט פרפין. שכבה בכל תגית כיסוי במהופך על 100 עד 200 μL של 10% ארנב סרום תחת עדין נדנדה (לילה, 4 ° C, בחושך).
  17. רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 5 דקות על כיסא נדנדה בחושך.
  18. דגירה תאים 50 μg/mL unconjugated עז אנטי-ארנב Fab קטעים עבור 2 h בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה בחושך.
  19. רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 5 דקות על כיסא נדנדה בחושך.
  20. לדלל נוגדן ראשוני (1:200 ארנב polyclonal נגד MPO נוגדנים) בנסיוב עיזים 5%. דגירה בתאים שכותרתו צלחות פטרי עם הסרט פרפין. שכבה בכל תגית כיסוי במהופך על 50 ל- 100 μL של הפתרון מדולל נוגדן. מניחים על כיסא נדנדה, דגירה h 1 ב 37 מעלות צלזיוס בחושך.
  21. לדלל נוגדנים משניים מצומדת fluorophore בנסיוב עיזים 5%, דגירה כמתואר ב- 4.8
  22. רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 5 דקות על כיסא נדנדה בחושך.
  23. הפרעה פקדים כדאי להיערך על ידי למעט הדגירה עם גם נוגדנים העיקרי בשלב השני labelling החיסון.
  24. כתם DNA עם 300 nM של 4 אינץ ', 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (דאפי) עבור 5 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
  25. רחץ 3 פעמים ב- DPBS עבור 1 דקות על כיסא נדנדה בחושך.
  26. חלה ירידה (~ 50 μl) של mountant antifade על זכוכית. טפח בעדינות על קצה coverslip על נייר סופג כדי להסיר עודפי מאגר לפני שיקימו את coverslip עם תאי במהופך. המדיום הרכבה יוצרות שכבה דקה בין coverslip את השקופית זכוכית. כדי להסיר בועות אוויר, לחץ בעדינות על coverslip עם מלקחיים משובחים.
  27. אפשר דוגמאות לרפא בן לילה בחושך ב 4 º C. המדיום הרכבה צריך להקשיח לבדיקה מיקרוסקופית עם עדשות טבילה. לאחסן דגימות 4 ° C בחושך.

5. נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית כמת

  1. לעוור את operator(s) רכישת וניתוח תמונות מיקרוסקופ לתנאים ניסיוני.
  2. באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות בהגדלה X 40, קח 10 תמונות באופן אקראי מאזורים שונים בכל coverslip בניסוי תחת הערוצים בהתאמה. ודא כי זמן החשיפה, הבהירות והניגודיות של כל ערוץ נשמרים עקביים בכל הרכישה של תמונות.
  3. לנתח את התמונות באמצעות תוכנת זמינים כגון ImageJ (NIH). לזהות רשתות המבוסס על שיתוף לוקליזציה של cfDNA, citH3 ו- MPO (איור 3 א, ב'). לכמת את מספר רשתות ו נויטרופילים בשדות אקראי 10 עבור כל תנאי הניסוי. המספרים של רשתות שפורסמו ניתן לבטא יחס (מספר רשתות: המספר הכולל של נויטרופילים) עבור כל תנאי הניסוי.
  4. כדי להעריך את ההשפעות טיפול על הביטוי citH3 תאיים, לספור את מספר נויטרופילים עם citH3 תאיים ומספר נויטרופילים ללא תאיים citH3 בשדות אקראי 10-40 X הגדלה מתחת הערוצים בהתאמה ( איור 3, חצים אדומים). CitH3 תאיים הביטוי ניתן לבטא את היחס שבין מספר נויטרופילים עם תאיים citH3 למספר של נויטרופילים ללא citH3 תאיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות פרוטוקול זה הדמיה תא חי, החוקרים ניתן להבחין מורפולוגיה גרעינית, פלזמה הקרומיות ונוכחות של cfDNA ב חי נויטרופילים. צבע גרעיני impermeant תא כתמי חומצות גרעין אדום בתאים עם קרום התא הפגוע. צבע תא-permeant אחר, תוויות חומצות גרעין תאיים בתאים חיים עם ממברנות פלזמה ללא פגע. כל נויטרופילים שלם, ללא קשר טיפולי שלהם, עליו להופיע ירוק, תערוכת גרעינים lobulated האופיינית-0 כדי 30 דקות לאחר גירוי (איור 2 א). הגרעינים של נויטרופילים שטופלו PMA מתחילים לאבד את המראה lobulated שלהם על ידי בסביבות 60 דקות, להמשיך decondense עד cfDNA (איור 2B). LPS, ממריץ איטית יותר, יותר הפיזיולוגיות של נויטרופילים הכלביים, בדרך כלל לא לגרום כרומטין decondensation או NETosis עד 90 דקות לאחר גירוי (איור 2B). מאת 120 דקות, נויטרופילים LPS, ובחום-מופעל ניתן לראות מוקף cfDNA. בהשוואה ל- LPS, נויטרופילים הופעל יותר-PMA לאבד שלהם שלמות קרום פלזמה כפי שהם אדום מוכתמות תא impermeant לצבוע (איור 2C). Unstimulated נויטרופילים (פקד DPBS) צריך לשמור על הגרעינים lobulated ועל שלמות קרום פלזמה לאורך כל תקופת דגירה (איור 2 א-ג).

רכיבים נטו בהיקף של cfDNA, citH3 ו- MPO בגרגרים מזוהים באמצעות פרוטוקול immunolabeling כפול. שחרורו של רשתות, מזוהה בהתבסס על שיתוף לוקליזציה של cfDNA, citH3 ו- MPO, בתגובה LPS PMA מוצגים באיור 3A ו- 3B, בהתאמה. נויטרופילים מגורה על ידי LPS 180 דקות לייצר פיגומים הדומה דיסקרטית של רשתות בסמיכות הסמוך נויטרופילים (איור 3 א). לעומת זאת, מופעל PMA נויטרופילים המיוצר כמויות אדירות של הרשתות שהיו גדולים באופן ניכר באזור (איור 3B, יח). Citrullination של שינויים היסטוניים H3, על ידי deiminase peptidylarginine האנזים (PAD), מהווה סימן היכר של NETosis. ובחום, תמריץ חזק של משטח, התוצאה היא מספר גבוה יותר של תאים המבטאים תאיים citH3 לעומת unstimulated, מגורה-LPS נויטרופילים (איור 3E).

Figure 1
איור 1: תרשים סכימטי הממחיש את השלבים של בידוד נויטרופילים הכלבי. דם מלא heparinized מדולל קודם מעורבב עם 3% לתוספי על שקיעת כדוריות הדם האדומות (RBC). ליקוציט עשיר פלזמה אז שנאספו, שכבות על גבי נפחים שווים של צפיפות זמינים מסחרית ההפרדה הדרגתיות מדיה. בעקבות צנטריפוגה (x 400 גרם, 30 דקות), השכבה RBC-גרנולוציט מופק, RBCs הנותרים יוסרו על ידי פירוק היפוטוניק. לאחר תוספת של-1.8% NaCl, גרנולוציטים הם טוו למטה (112 x גרם, 5 דקות), resuspended במאגר ייעודי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג פלורסנט תמונות של נויטרופילים הכלבי בשידור חי- נויטרופילים מבודד הופעלו עם 100 LPS µg/mL, נפח 100 ננומטר ובחום, או שווה ערך באגירה פוספט תמיסת מלח של Dubecco (DPBS) כפקד שלילי בסך 180 מינימלית חומצות גרעין ב נויטרופילים שלם בשידור חי היו מוכתמים ירוק עם שימוש של תא-permeant צבע בזמן cfDNA ו נויטרופילים עם קרום התא שנפרצו היו מוכתמים אדום עם צבע התא-impermeant. (א, ד) DPBS ו LPS-שטופלו נויטרופילים כל הקפיד על קרום התא שלם עם גרעינים lobulated (כוכבית). (A, E) הגרעינים של נויטרופילים הופעל-PMA החלו לעבור decondensation (חץ). (B, F) על ידי 90 דקות, רוב הגרעינים של נויטרופילים הופעל LPS או PMA איבד את המראה שלהם lobulated (חץ כחול). (ג) לאחר 120 דקות, נויטרופילים הופעל-PMA כל היה חדיר ממברנות פלזמה מוקף cfDNA בעוד cfDNA יכלו להיראות המקיפים מספר קטן של נויטרופילים הופעל-LPS (חיצים). נויטרופילים unstimulated לא לייצר cfDNA וגם לא היה פוגע קרום התא בכל נקודת זמן (A-C). (A-B) המקורי 40 X הגדלה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (D-F) 80 X הגדלה. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. ניסוי ששוכפל פעמיים של נויטרופילים מבודד מתורמים שונים 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: היווצרות נטו. (A-C) תמונות immunofluorescent הנציגה של היווצרות במבחנה נטו. נויטרופילים מבודד מתורם יחיד היה קבוע, permeabilized, צבעונית ה-dna (כחול) myeloperoxidase (MPO, ירוק) ו- citrullinated היסטון H3 (citH3, אדום) לאחר גירוי עם (א) 100 µg/mL LPS, (B) 100 ננומטר PMA או DPBS (C) עבור 180 מינימלית רשתות, המזוהה על-ידי שיתוף לוקליזציה של cfDNA, MPO citH3, הן עם מיתאר (קווים מנוקדים) ב (א) LPS - ו (ב) PMA מופעל נויטרופילים. דוגמאות של ביטוי תאיים citH3 מסומנים באמצעות חצים אדומים. (ג) לא רשתות ולא תאיים citH3 נראים unstimulated נויטרופילים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (D, E) נציג תיבת, שפם מתווה של היווצרות נטו, תאיים citH3 ביטוי נויטרופילים מבודד 4 כלבים. תיבת משתרע מ 25th ל 75תאנון percentiles, שפם span החל מהקטן אל הערך הגדול ביותר. LPS וגירוי PMA הביא צורה נטו (D) משמעותית וביטוי תאיים citH3 (E) בהשוואה unstimulated נויטרופילים. + מייצג את מתכוונת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מציגים כאן פרוטוקול כדי לבחון את השינויים בשחרור קונפורמציה, cfDNA גרעינים נויטרופילים כלבים חיים באמצעות צבע permeant תא והן צבע impermeant תא. היתרון העיקרי של assay הזה הוא שהיא מאפשרת גילוי בזמן אמת של היווצרות נטו על ידי מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה בנויטרופילים לחיות בלי קיבוע תא, לכן, מתן כלי יקר ופשוט להבחנה במבחנה היווצרות נטו. מאז assay זו אינה דורשת נוגדנים איתור רכיבים נטו, זה אידיאלי עבור הלומדים NETosis מינים עם זמינות מוגבלת של נוגדנים תלויי מין. שימוש assay הזה, המחברים הראו כי נויטרופילים הכלבים עוברים כרומטין decondensation תחת LPS או PMA גירוי לפני NETosis13. חיסרון גדול של טכניקה זו היא שזה לא ספציפיות עבור NETosis. כי תא impermeant לצבוע כתמי גם חומצות גרעין בתאים נמק או חומצות גרעין שוחררו נויטרופילים lysed, תאים impermeant-חיוביות cfDNA או תאים להיות שקרית מתורגם נויטרופילים רשתות או NETosing. לחלופין, יחודיות של NETosis יכול להיות מוגברת על ידי כולל נויטרופילים הופעל PMA או LPS כי הם מיוחדים עם PAD4-המעכב, Cl-amidine. הפגנו כאן את החשיבות של הבטחת עקרות וטיפול נאות של נויטרופילים לאורך כל תהליך הבידוד כמו זיהום, הכוחות העצום יכול להוביל נמק במבחנה וסלולרי פירוק. אנו ממליצים גם עמידה עם טמפרטורות נאותה לאורך כל הפרוטוקולים, מניעת ממושך (> 1 דקות) פירוק היפוטוניק. כדי לאשר את הכדאיות של נויטרופילים מבודד בשעות נוספות, מבחן הדרה Trypan Blue, כמו גם פקד שלילי בהיקף של נויטרופילים unstimulated מומלץ מאוד.

כי cfDNA זוהה על ידי חומצת גרעין התא-אטום צבעי אינה ספציפית עבור NETosis, פיתחנו פרוטוקול כפול-immunolabeling לכימות תנועת במבחנה נטו היווצרות וביטוי תאיים citH3 ב נויטרופילים הכלביים. כמו נויטרופילים משחררים פרטנית חלבונים כמו MPO יחד עם cfDNA ו citH3 לחלל חוץ-תאית, כימות נטו המבוסס על שיתוף לוקליזציה של cfDNA, citH3 ו- MPO הוא ספציפי יותר לעומת מבחני אחרים כגון cfDNA, נוקליאוזומים או מתחם ה-DNA-MPO 14. בגלל המוגבל של נוגדנים cross-react עם חלבונים הכלביים, השתמשנו נוגדנים העיקרי שמקורן ממין אחר (ארנב). כדי למנוע לכידה של נוגדנים הראשי על-ידי אתרי קישור חינם שיורית על נוגדנים משניים בכל שלב של תהליך צביעת, אנחנו קודם מנוצל נסיוב ארנבת ואחריו unconjugated Fab שברי כדי להרוות את אתרי קישור חינם. צעד קריטי של הליך זה נועד להבטיח כביסה נאותה כדי למנוע עודף קשירה של immunoglobulins ושברי ללונג אשר עלולים להפריע לזיהוי של החלבון השני של עניין. אנו ממליצים גם בדיקות דילולים שונים של נוגדנים ראשיות ומשניות כדי למזער את האיגוד ספציפי לבין הפרעות. כדי להבטיח כי הנוגדנים משני משלב גם immunolabelling נקשר באופן שלה נוגדן ראשוני ספציפי, חוקרים צריך לכלול פקדים שונים 2 השוללים גם נוגדן ראשוני בשלב immunolabelling השני. איגוד שאינו ספציפי מתרחש כאשר אותות של שני נוגדנים משניים מזוהים.

היסטון citrullination או דיאמינציה, על ידי את האנזים peptidylarginine deminase 4 (PAD4), הינו חיוני ביותר הקשורים חיידקים NETosis15,בעכברים ובבני אדם16. שימוש assay הזה, הצלחנו לקבוע כי LPS-induced NETosis אצל כלבים דורש גם היסטון H3 citrullination על ידי משטח13. כדי לבדוק אם מעורר עניין המניע NETosis על-ידי הפעלת PAD4, אנו ממליצים על הכללת חיובי פקדים המשתמשים מפעילים PAD4 ידועים כמו PMA או ionophore של סידן, A2318717. אם נויטרופילים הצג שלילי צביעת עבור citH3 הדגימות בקרה חיובית, הפרוטוקול חייב להיות מתוקן עד מספיק חיובי מכתים היא תוצאה. בנוסף, אנו ממליצים הכללת ביולוגי פקדים שלילי בהיקף של נויטרופילים unstimulated או נויטרופילים מטופלים עם החומר המדכא PAD, Cl-amidine.

זיהוי מדויק של מבנה הרשתות עשויה להיות מאתגרת בעזרת טכניקה זו. זה יכול להיות קשה במיוחד בדגימות עם NETosis מקיף, כמו מיזוג נטו מבנים שוחררו נויטרופילים סמוכים מרובים יכולים להוביל underestimation של אירועים NETotic. התוצאות של זה וזמינותו ייתכן בקורלציה עם אחרים מבחני אובייקטיביים יותר כמו cytometry זרימה או אליסה, אשר עדיין מאומתים לשימוש נויטרופילים הכלביים. כדי למנוע היווצרות של מבנה נטו confluent, החוקרים שתוכל לזרוע ריכוז נמוך יותר של תאים. לחלופין, הפחתת זמן הדגירה הכולל יכול להימנע נרחב NETosis מיזוג של מבנים נטו. למרות פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור NETosis בחיות אחרות, מבוסס על הניסיון של המחברים, נויטרופילים בתגובה LPS או PMA יכולים להשתנות במידה רבה בין המינים.

גילוי רשתות אצל כלבים מדגיש כי NETosis הוא מנגנון ההכפלה של מולדת חסינות במהלך זיהום מיקרוביאלי ומחלות בתיווך החיסון. מבחני המובאת כאן יכול להיות כלי רב ערך עבור המחקר של NETosis כלבים ו מינים אחרים. הבנה טובה יותר של אלח דם-induced NETosis יקל על מחקר נוסף אל תוך הפיתוח של אסטרטגיות טיפול חדשניים עבור אלח דם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחבר המקביל מומן על ידי קרן חיה מוריס (D15CA-907). המחקר נתמך על ידי קרנות מן אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, מרכז לבריאות סוסים והמרכז לבריאות בעלי חיים מסייע (2016-24-F). המחברים רוצה להכיר ג'ינה Ng לסיוע שלה עם דמויות ואת נגחי נגוין על הסיוע עם הווידאו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma 31392 Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS GE Life Sciences 17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285801 With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136 Without divalent cations
E. coli O55:B5 InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S11368 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7578 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40 Pierce 28324
Poly-D-Lysine coated coverslips neuVitro H-12-pdl 12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments Jackson ImmunoResearch 111-007-003 Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody Dako A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  3. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  4. Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
  5. Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
  6. Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
  7. Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
  8. Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
  9. Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
  11. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  12. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
  13. Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
  14. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  15. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  16. Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
  17. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 138 מיקרוסקופ Immunofluorescence אלח דם בידוד גרנולוציט היסטון citrullination peptidylarginine deiminase
<em>במבחנה</em> מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, R. H. L., Tablin, F. In… More

Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58083, doi:10.3791/58083 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter