Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

В пробирке Формирование собак нейтрофилов внеклеточного ловушка: Динамические и количественный анализ по микроскопии флуоресцирования

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58083
Automatic Translation
1, 2
1Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Мы описываем методы изолировать собак нейтрофилов из цельной крови и визуализировать NET формирования в живой нейтрофилов, с помощью микроскопии флуоресцирования. Также описаны протоколы для количественного определения чистой формирования и citrullinated гистонов H3 выражение (citH3), с помощью микроскопии иммунофлуоресценции.

Abstract

В ответ на вторжение патогенов нейтрофилов освобождение нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), которые являются внеклеточного сети ДНК, украшенные Гистоны и антимикробные белки. Чрезмерная NET формирования (NETosis) и citH3 релиз во время сепсиса ассоциируется с несколькими полиорганной дисфункции и смертности в мышей и людей, но его последствия в собак неизвестны. Здесь мы опишем технику, чтобы изолировать собак нейтрофилов из цельной крови для наблюдения и количественной оценки NETosis. Лейкоцитов богатые плазмы, порожденных декстрана седиментации, разделенных коммерчески доступных плотность градиента разделения средств массовой информации и гранулоцитов, собранные для мобильных игр и проверки жизнеспособности. Для наблюдения в реальном времени NETosis в живых нейтрофилов, permeant клеток и клеток impermeant флуоресцентные нуклеиновых кислот пятна добавляются нейтрофилов, активированный липополисахарида (LPS) или phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA). Изменения в ядерной морфологии и чистой формирования наблюдаются со временем по микроскопии флуоресцирования. В пробирке NETosis также характеризуется co-colocalization свободных клеток ДНК (cfDNA), миелопероксидаза (МПО) и citrullinated гистонов H3 (citH3) с помощью модифицированных двойной immunolabelling протокола. Чтобы объективно подсчитать чистый формирования и citH3 выражение, с помощью микроскопии флуоресцирования, сетки и citH3-положительных клеток являются количественно в ослепленный манере с использованием доступного программного обеспечения. Эта техника является конкретным пробирного для оценки в vitro способности собак нейтрофилов пройти NETosis.

Introduction

Нейтрофилы являются недолго гранулоцитов ответственных за первоначальный обороны против вторгаясь патогенов. Нейтрофилы, набранных на месте инфекции, устранения микроорганизмов, фагоцитоз, дегрануляция и поколения реактивнооксигенных видов (ров)1. Присутствии бактерий или эндотоксинов нейтрофилов освобождение нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), состоит из внеклеточного хроматина украшен Гистоны и гранулированный белки как эластазы и миелопероксидаза (МПО)2. Хотя сеток незаменимым противомикробными свойствами, увеличивая экспериментальных и клинических доказательств свидетельствует о том, что фанатичным NET формирования во время сепсис может привести к нескольким орган дисфункции и смерти3,4, 5 , 6.

Потому что сети могут играть аналогичную роль патофизиологических в собак, терапевтических вмешательств, которые либо предотвратить или уменьшить NET формирования может служить стратегии Роман лечения в септик животных. По этой причине существует необходимость надежный метод для определения и количественной оценки NETosis и чистых компонентов в собак. NET компонентов, включая свободных клеток ДНК (cfDNA) и нуклеосом ранее были оценены в собачьей нейтрофилов и плазмы от клинических собак7,8,9. Использование флуоресценции анализов, Goggs и Letendre обнаружил, что септик собаки имеют более высокий уровень cfDNA чем здоровые собаки8. Хотя эти методы являются весьма объективные и количественных, измерение cfDNA и нуклеосом как маркеры NETosis неспецифической, так как они могут быть производными от некротических клеток, кроме NETosing нейтрофилов. Здесь мы описываем метод, который использует микроскопии флуоресцирования для изучения поведения живых NETosing нейтрофилов. Мы также подробно измененный Протокол, с помощью двойного immunolabeling субъективно количественной оценки сетей и их компонентов, таких как МПО и citH3 в собачьей нейтрофилов10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом в университете Калифорнии, Дэвис (протокол номер: 18338).

1. крови коллекции

  1. Нарисуйте 10 мл крови от либо предлежании или шейных вен иглой 21 G с помощью шприца аспирации.
  2. Чтобы избежать чрезмерного напряжения сдвига, удалите иглу от шприца перед передачей крови в трубки, содержащих гепарин натрия (75 USP). Аккуратно перевернуть трубы несколько раз для обеспечения надлежащего смешивания антикоагулянт и крови. Проверка свидетельства сгустки или агрегатов эритроцитов до размещения образцов на льду.

2. нейтрофилов изоляции

  1. Разбавьте антикоагулянтом крови с равным объемом ледяной Dubecco фосфат амортизированное saline (DPBS) (рН 7,4, без двухвалентной катионы). Перевод 8 мл разбавленной крови на 50 мл полипропиленовые конические трубка, содержащая 25 мл 3% декстрана (от Leuconostoc spp., растворенного в 0,9% растворе хлорида натрия). Положите трубку upright в комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы позволить агрегации и оседания эритроцитов.
  2. Тщательно слой 5 мл плазмы лейкоцита-богатые люди (рис. 1) на вершине 5 мл градиента плотности СМИ в 14 мл полипропиленовые раунд дно трубки. Будьте осторожны, чтобы не смешать 2 решения11.
  3. Центрифуга для трубы на 400 x g с ускорения/замедления (A/D) установлено значение 0 (без тормозов) за 30 мин при комнатной температуре.
  4. С помощью 5 мл Серологические Пипетки собирать слоя клеток гранулоцитарного, минуя плазмы и периферической крови одноядерных клеток (КСДОР) слоев (рис. 1). Используйте новый накапайте каждый раз для сведения к минимуму загрязнения.
  5. Место 4-6 мл polymorphnuclear (ПМН) слоя клеток в 50 мл полипропиленовые Конические трубки. Поскольку небольшое количество эритроцитов агрегатов может быть придыхательным вместе со слоем ПМН, используйте 1 мл Серологические Пипетки аккуратно удалить агрегатов эритроцитов, которые поселились в нижней части трубки.
  6. Лизируйте оставшиеся эритроцитов с 20 мл холодной воды, сверхчистый. Аккуратно перевернуть трубку несколько раз за 30-60 s для обеспечения адекватного лизировать перед добавлением равного количества ледяной 1,8% раствором хлорида натрия.
  7. Центрифуга на 112 x g для 10 мин при температуре 4 ° C, A/D, равным 0.
  8. Повторите шаг Лизис эритроцитов, если это Пелле появляется красный. Отменить супернатант тщательно с Серологические Пипетки и нежно ресуспензируйте гранулы в 100 мкл DPBS (декстроза 5 мм, 0,9 мм MgCl2, 1,9 мм CaCl2 и 1% бычьего сывороточного альбумина, рН 7.3). Объединить все ресуспензированы клеток и место на льду.
  9. Выполните отсчет клетки, с помощью анализатора автоматизированные ячейки и проверить счетчик Горяева. При необходимости сконцентрировать ПНЛ на слайд стекла с помощью cytocentrifuge (1000 об/мин, 5 мин) и определить процент нейтрофилов, подсчитывая количество нейтрофилов из общего числа клеток.
  10. Определить жизнеспособность нейтрофилы, выполнив испытания изоляции Трипановый синий как говорится Strober соавт. 12 успешных изоляции должна принести жизнеспособность от 95 до 100% и нейтрофилов должен быть более чем на 95%.
  11. Определите концентрацию нейтрофилов путем умножения числа общей ячейки с процент жизнеспособность и процент нейтрофилов. Успешной изоляции должна принести концентрации нейтрофилов от 1,5 до 6 x 10-6/мл.
  12. Разбавляют нейтрофилов до конечной концентрации 1 x 10-6/мл DPBS, содержащих декстрозы 5 мм, 0,9 мм MgCl2, 1,9 мм CaCl2и 1% бычьего сывороточного альбумина с pH скорректирована с 7.3.

3. Люминесцентная микроскопия живой нейтрофилов

  1. Место 200 до 400 мкл нейтрофилов (1 х 106/мл) в каждой скважине поли L-лизин покрытием плиты 12-ну культуры. Разрешить нейтрофилов присоединиться к нижней части скважины по инкубации клеток при 37 ° C за 30 мин.
  2. Ярлык нуклеиновых кислот с 1 мкм, один из двух нуклеиновой кислоты красителей, один, что пятна в клетках при интактном плодном пузыре и один, что пятна в клетках с проницаемой мембраны (см. Таблицу материалы), для 10 мин при комнатной температуре.
  3. Активация нейтрофилов с 100 мкг/мл липополисахарида (LPS) (E. coli O55. B5), 100 Нм phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) как положительный контроль, или эквивалентный объем DPBS как отрицательный контроль для 180 мин при 37 ° C.
  4. Получение изображений с помощью GFP (возбуждения: 470/22 Нм, выбросов: 525/50 Нм) и Техас красный каналы (возбуждения: 585/29 Нм, выбросов: 628/32 нм) на микроскопии флуоресцирования на 40 кратном в следующее время: 30, 90, 120 и 180 мин.

4. чистый количественной оценки и выявления чистых компонентов с помощью иммунофлуоресценции

  1. Осторожно поместите скользит крышка поли-D-лизин покрытием диаметром 18 мм в скважины культуры 12-ну пластины. Метки колодцев надлежащим образом.
  2. Семена от 100 до 200 мкл изолированных нейтрофилов (1 x 10-6/мл) непосредственно на coverslips и позволяют нейтрофилов присоединиться к обложке скользит по инкубации клеток при 37 ° C за 30 мин.
  3. Активация нейтрофилов, как описано в разделе 3.3. Подавляют NET формирования путем предварительной обработки нейтрофилов с 200 µΜ Cl Амидины (15 мин., 37 ° C) до активации, как описано ранее, Li et al. 13 обеспечить что надлежащего транспортного средства управления (ДМСО) включен в эксперименте.
  4. Осторожно удалите крышку скользит с тонкой щипцами. Слой парафина фильм лист над пробирку стенд для создания неглубоких колодцев и место 2-3 капель 4% ПФА в каждом хорошо10. Надлежащим образом метки колодцев и аккуратно класть Обложка скользит вниз на PFA-заполнены скважин. Разрешить клеток фиксируются при комнатной температуре в течение 20 мин.
  5. Вымойте клетки 3 раза в DPBS на 5 мин, перемещая их из одной скважины к следующему.
  6. Если immunolabelling не может быть выполнено вскоре после активации нейтрофилов и фиксации, позволяют скользит крышка быть воздушная сушка, поместив скользит крышка лицом вверх на кусок бумаги поглощения. Скользит крышка может храниться до 1 недели лицом вверх в маркированных культуры 12-ну пластины на 4 ° C до дальнейшего анализа. Вымойте клетки 3 раза в DPBS за 1 мин, используя ту же технику, как описано в 4.4 перед переходом к следующему шагу.
  7. Для разрушения клеток, аккуратно заложить покрытие скольжения вниз, на капли 1% NP-40 за 1 мин, используя технику, переходите к пункту 4.4. Вымойте 3 раза в DPBS за 1 мин на рокер.
  8. Случайным образом назначить ряд каждый образец и использовать маркер точки алмазов для обозначения coverslips соответственно.
  9. Подготовка и лейбл отдельных Петри облицованная пленкой парафина и место 100 до 200 мкл 5% козьего сыворотки на фильм (блокирующий буфер). Заложить coverslips вниз для блокировки буфера. Место на рокер и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
  10. Вымойте 3 раза в DPBS 5 мин на рокер.
  11. Разбавить основное антитело (1: 400 кролика polyclonal анти citrullinated гистонов H3 (citH3) в 5% козьего сыворотки). Инкубируйте клетки в обозначенные Петри, облицованная пленкой парафина. Положите каждая крышка выскальзования вниз на 50 до 100 мкл раствора разбавленные антитела. Место на рокер и инкубировать 1 час при температуре 37° C.
  12. Вымойте 3 раза в DPBS 5 мин на рокер.
  13. Разбавить вторичное антитело проспряганное Флюорофор (1: 200) в 5% козьего сыворотки. Инкубируйте клетки в обозначенные Петри, облицованная пленкой парафина. Положите каждая крышка выскальзования вниз на 50 до 100 мкл раствора разбавленные антитела. Место на рокер и инкубировать 1 час при 37 ° C в темноте.
  14. Вымойте 3 раза в DPBS 5 мин на качалку в темноте.
  15. Для одновременного обнаружения миелопероксидаза (МПО) выполните следующие шаги для модифицированных двойной immunolabeling протокола, как описано в Li et al. 13
  16. Инкубируйте клетки в обозначенные Петри, облицованная пленкой парафина. Заложить каждый покрытие скольжения вниз на 100-200 мкл 10% кролик сыворотки под плавное покачивание (ночевка, 4 ° C, в темноте).
  17. Вымойте 3 раза в DPBS 5 мин на качалку в темноте.
  18. Инкубируйте клетки в 50 мкг/мл неконъюгированной коза анти кролик Fab фрагментов втечение 2 ч при комнатной температуре на качалку в темноте.
  19. Вымойте 3 раза в DPBS 5 мин на качалку в темноте.
  20. Разбавьте первичное антитело (1: 200 кролика polyclonal против человека MPO антитело) в 5% козьего сыворотки. Инкубируйте клетки в обозначенные Петри, облицованная пленкой парафина. Положите каждая крышка выскальзования вниз на 50 до 100 мкл раствора разбавленные антитела. Место на рокер и инкубировать 1 час при 37° C в темноте.
  21. Разбавить вторичное антитело проспряганное Флюорофор в 5% козьего сыворотки и инкубировать как описано в 4,8
  22. Вымойте 3 раза в DPBS 5 мин на качалку в темноте.
  23. Вмешательства управления должно быть подготовлено исключая инкубации с либо первичных антител на втором шаге иммунной маркировки.
  24. Пятно ДНК с 300 Нм 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, дигидрохлорид (DAPI) за 5 мин в темноте при комнатной температуре.
  25. Вымойте 3 раза в DPBS за 1 мин на качалку в темноте.
  26. Нанесите каплю (~ 50 мкл) из antifade mountant на стеклянное скольжение. Аккуратно нажмите края coverslip на чистую фильтровальную бумагу, чтобы удалить избыток буфера перед монтажом coverslip с клетками вниз головой. Средство установки должны составлять тонкого слоя между coverslip и стеклянное скольжение. Чтобы удалить пузырьки воздуха, очень осторожно нажмите на coverslip с тонкой щипцами.
  27. Разрешить образцы для лечения на ночь в темноте при 4 ° C. Средство установки следует затвердеть для микроскопического анализа с линзами погружения. Хранить образцы в 4 ° C в темноте.

5. нейтрофилов внеклеточного ловушку количественная оценка

  1. Слепой грузовое получения и анализа изображения микроскопа в экспериментальных условиях.
  2. С помощью микроскопа флуоресценции в 40 кратном, принять 10 изображений случайным образом из различных регионов каждого coverslip в эксперименте по соответствующим каналам. Убедитесь, что время экспозиции, яркости и контрастности каждого канала хранятся несогласованной приобретения изображений.
  3. Анализ изображений с помощью программного обеспечения таких как ImageJ (НИЗ). Идентифицировать сеток на основе совместного локализации cfDNA, citH3 и MPO (Рисунок 3А, B). Подсчитать количество сетей и нейтрофилов в 10 случайных полей для каждого экспериментальные условия. Номера сетки выпустила может быть выражено как соотношение (количество сетей: общее количество нейтрофилов) для каждого экспериментальные условия.
  4. Оценить эффекты лечения на внутриклеточную citH3 выражение, подсчитать количество нейтрофилов с внутриклеточной citH3 и количество нейтрофилов без внутриклеточных citH3 в 10 случайных полей при 40 кратном под соответствующие каналы ( Рисунок 3, красные стрелки). Внутриклеточных citH3 выражение может быть выражен как отношение числа нейтрофилов с внутриклеточной citH3 на количество нейтрофилов без внутриклеточных citH3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя этот протокол живых клеток, следователи могут наблюдать Ядерное словотолкование, целостность плазматической мембраны и присутствие cfDNA в живых нейтрофилов. Клетки impermeant ядерных краситель пятна ядер кислот красный в клетках с поврежденных клеточных мембран. Другой ячейки permeant краска, этикетки внутриклеточных нуклеиновых кислот в живых клеток с интактным плодным пузырем плазмы. Все неповрежденной нейтрофилов, независимо от их лечения, должен появиться зеленый и демонстрируют характерные lobulated ядер в 0-30 мин после стимуляции (рис. 2A). Ядер PMA-лечение нейтрофилов начинают терять их lobulated внешний вид, около 60 мин и продолжать decondense до выпуска cfDNA (рис. 2B). LPS, медленнее и более физиологичен стимулятор собак нейтрофилов, обычно не приводит к decondensation хроматина или NETosis до 90 мин после стимуляции (рис. 2B). 120 мин ПЛАСТИНОК и PMA-активированных нейтрофилов можно увидеть окружении cfDNA. По сравнению с ПЛАСТИНОК, больше PMA активации нейтрофилов теряют их целостности плазматической мембраны, как они запятнаны красный, краситель impermeant клеток (рис. 2 c). Кератоз нейтрофилов (DPBS управление) должны поддерживать lobulated ядер и нетронутыми плазматической мембраны на протяжении всего инкубационного периода (рисунок 2A-C).

NET компонентов, состоящий из cfDNA, citH3 и гранулы MPO обнаруживаются с помощью двойной immunolabeling протокола. Релиз сеток, определены на основе совместного локализации cfDNA, citH3 и МПО, в ответ на ПЛАСТИНКИ и PMA показаны на рисунке 3а и 3Б, соответственно. Нейтрофилы стимулируется ПЛАСТИНОК для 180 мин производят сеток дискретных веб как строительные леса в непосредственной близости от близлежащих нейтрофилов (рис. 3A). В противоположность этому ПМА активированных нейтрофилов производится огромное количество сетей, которые были заметно больше в области (рисунок 3B, D). Citrullination гистонов H3, катализируемые deiminase фермента peptidylarginine (PAD), является отличительной чертой NETosis. PMA, мощным стимулятором PAD, приводит в большее количество клеток, выражая внутриклеточных citH3, по сравнению с кератоз и LPS-стимулирует нейтрофилов (Рисунок 3E).

Figure 1
Рисунок 1: схема демонстрирует шаги собак нейтрофилов изоляции. Сначала разреженных гепаринизированным цельная кровь смешивается с 3% декстрана для оседания эритроцитов (РБК). Лейкоцитов богатые плазмы затем собирается и слоистых на равных объемах коммерчески доступных плотность градиента разделения средств массовой информации. После центрифугирования (400 x g, 30 мин) РБК гранулоцитов слой извлекается и остальные RBCs удаляются гипотонический лизис. После добавления 1,8% NaCl, гранулоциты закрученная вниз (112 x g, 5 мин) и высокомобильна в выделенный буфер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: представитель флуоресцентного изображения живых собак нейтрофилов. Изолированные нейтрофилов были активированы с ПЛАСТИНОК 100 мкг/мл, 100 Нм PMA, или эквивалентный объем Dubecco фосфат амортизированное saline (DPBS) как отрицательный контроль в общей сложности 180 мин нуклеиновых кислот в живой неповрежденной нейтрофилов окрашивали зеленый с использованием клеток permeant краска в то время как cfDNA и нейтрофилы с нарушенной мембран клеток были окрашенных красной краской клеток impermeant. (A, D) Все DPBS и LPS-лечение нейтрофилов сохранить нетронутыми клеточной мембраны с lobulated ядрами (звездочка). (A, E) Ядер PMA-активированных нейтрофилов начал проходить decondensation (стрелки). (B, F) 90 мин большинство ядер в LPS - или PMA-активированных нейтрофилов потеряли их lobulated вид (синие стрелки). (C) после 120 мин, все PMA-активированных нейтрофилов была проницаемой мембраны плазмы, окруженный cfDNA, хотя cfDNA видны окружающие небольшое количество ПЛАСТИНОК активированных нейтрофилов (стрелки). Кератоз нейтрофилов не производят cfDNA не скомпрометировали клеточной мембраны в любой момент времени (A-C). (A-B) Оригинальные 40 X увеличение. Шкалы бар = 100 µm. (D-F) 80 X увеличение. Шкалы бар = 30 мкм. эксперимент был реплицирован дважды из нейтрофилов, изолированных от 3 различных доноров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: NET формирования. (A-C) Представитель immunofluorescent изображения в vitro NET формирования. Изолированные нейтрофилов от одного донора были исправлены, permeabilized и витражи для ДНК (синий), миелопероксидаза (MPO, зеленый) и citrullinated гистонов H3 (citH3, красный) после стимуляции с ПЛАСТИНОК (A) 100 мкг/мл, (B) 100 Нм PMA или (C) DPBS 180 мин сеток, определенных совместно локализации cfDNA, MPO и citH3, являются изложенные (пунктирные линии) на (A) LPS - и (B) PMA-активированных нейтрофилов. Примеры внутриклеточных выражения citH3 обозначаются красными стрелками. (C) No Нетс ни внутриклеточных citH3 видны кератоз нейтрофилов. Шкалы бар = 100 мкм (D, E). Представитель box и столбик участки чистой формирования и внутриклеточных citH3 выражение в нейтрофилах, изолированных от 4 собаки. Поле простирается от 25тыс до 75-й процентили и усы промежуток от самых маленьких до наибольшее значение. LPS и PMA стимуляции привели к значительным (D) чистой формирования и выражения внутриклеточных citH3 (E), по сравнению с кератоз нейтрофилов. + представляет среднее. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы представляем здесь протокол наблюдать изменения в конформации и cfDNA версии ядра в живых собак нейтрофилов, используя permeant красителя клетки и клетки impermeant краситель. Основным преимуществом этот assay является, что он позволяет для реального времени обнаружения чистой формирования при микроскопии высокого разрешения в прямом нейтрофилов без фиксации клеток, таким образом, обеспечивая простой и ценный инструмент для наблюдения в vitro NET формирования. Поскольку этот assay не требует антитела для обнаружения чистых компонентов, он идеально подходит для изучения NETosis видов с ограниченным доступом вегетационных антител. Используя этот assay, авторы показали, что собак нейтрофилы проходят decondensation хроматина под ПЛАСТИНКИ или PMA стимуляции до NETosis13. Основным недостатком этого метода является, что он не является специфичным для NETosis. Потому что клетки impermeant краска также пятна нуклеиновых кислот в некротических клеток или нуклеиновых кислот, образующихся лизированных нейтрофилов, cfDNA или клеток impermeant положительных клеток может толковаться как сеток или NETosing нейтрофилов ложно. Кроме того специфика NETosis может быть увеличен путем включения PMA - или LPS-активированных нейтрофилов, которые являются предварительно обработанных с PAD4-ингибитор, Cl Амидины. Мы продемонстрировали здесь важность обеспечения стерильности и надлежащей обработки нейтрофилов на протяжении всего процесса изоляции как загрязнение и чистой силы может привести к в vitro некроза и lysis клетки. Мы также рекомендуем соблюдения надлежащей температуры во всем протоколам и предотвращения длительного (> 1 мин) гипотонический lysis. Чтобы подтвердить жизнеспособность изолированных нейтрофилов сверхурочных, испытания изоляции Трипановый синий, так и отрицательный контроль, состоящий из кератоз нейтрофилов настоятельно рекомендуется.

Потому что cfDNA обнаружены клетки непроницаемый нуклеиновой кислоты красителями не является специфичным для NETosis, мы разработали двойной immunolabeling протокол для количественной оценки в vitro NET формирования и внутриклеточных citH3 выражение в собачьей нейтрофилов. Нейтрофилы освобождают гранулированных белки как MPO наряду с cfDNA и citH3 во внеклеточное пространство, NET количественной оценки, основанные на сотрудничестве локализации cfDNA, citH3 и MPO является более конкретным по сравнению с другими анализов, например cfDNA, нуклеосом или комплекса ДНК-MPO 14. из-за ограниченного наличия антител, которые cross-react с собак белков, мы использовали первичного антитела, которые исходят от другого вида (кролик). Для предотвращения захвата первичных антител остаточного свободного привязки сайтов на вторичные антитела на любом шаге процесса окрашивания, мы впервые использовали сыворотки кролика, следуют неконъюгированной Fab фрагментов для насыщения свободного привязки сайтов. Один важный шаг этой процедуры заключается в обеспечении адекватного стирки для предотвращения избыточного связывания иммуноглобулинов и Fab фрагментов, которые могут мешать обнаружения второго протеина интереса. Мы также рекомендуем тестирование различных разведениях первичных и вторичных антител к минимуму неспецифического связывания и помех. Чтобы гарантировать, что вторичные антитела от либо immunolabelling шаг связывает специально для его основного антитела, следователи должны включать 2 различных элементов управления, которые исключают либо основное антитело на втором шаге immunolabelling. Неспецифическая связывание происходит при обнаружении сигналы от обоих вторичные антитела.

Гистона citrullination или дезаминирование, катализируемые фермента peptidylarginine deminase 4 (PAD4), имеет важное значение в связанных бактерии NETosis в мышах и людях15,16. С помощью этого анализа, мы смогли определить, что LPS-индуцированной NETosis у собак также требует гистонов H3 citrullination PAD13. Чтобы проверить ли стимулятор интерес вызывает NETosis, PAD4 активации, мы рекомендуем включение положительных элементов управления с помощью известных активаторов PAD4 как PMA или кальция ionophore, A2318717. Если нейтрофилы показать негативные пятная для citH3 в положительных контрольных образцов, протокол должен быть пересмотрен до тех пор, пока достаточно положительный пятнать это привело. Мы также рекомендуем включение биологических негативный контроль, состоящий из кератоз нейтрофилов или нейтрофилов, лечили ингибитором PAD, Cl Амидины.

Точная идентификация отдельных сетей структуры может быть сложным, используя эту технику. Это может быть особенно трудным в образцах с обширной NETosis, как слияние сети структур, освобожден из нескольких прилегающих нейтрофилов может привести к недооценке NETotic событий. Результаты этого анализа могут быть соотнесены с другими более объективных анализов как проточной цитометрии или ELISA, которые еще не были одобрены для использования в собачьей нейтрофилов. Чтобы избежать формирования структуры вырожденная чистой, следователи могут семена более низкой концентрации клеток. Кроме того уменьшается время всего инкубации можно избежать обширные NETosis и слияние чистых структур. Хотя этот протокол может использоваться для изучения NETosis в других видов, основываясь на опыте авторов, нейтрофильные реакции ПЛАСТИНОК или PMA может варьироваться среди видов.

Обнаружение сетей в собак подчеркивается, что NETosis является сохранение механизмом врожденного иммунитета во время микробной инфекции и заболевания иммунной системы. Анализы, представленные здесь может быть ценным инструментом для изучения NETosis собак и других видов. Лучшее понимание сепсиса индуцированной NETosis облегчит дальнейшие исследования в целях разработки стратегий Роман лечения сепсиса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Соответствующего автора финансировался Фондом животных Моррис (D15CA-907). Исследование было поддержано средств из университета Калифорнии, Дэвис, центр для Equine здоровья и центра по охране здоровья животных компаньон (2016-24-F). Авторы хотели бы признать Джина нг за помощь с фигурами и Нгуен Nghi за помощь с видео.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma 31392 Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS GE Life Sciences 17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285801 With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136 Without divalent cations
E. coli O55:B5 InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S11368 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7578 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40 Pierce 28324
Poly-D-Lysine coated coverslips neuVitro H-12-pdl 12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments Jackson ImmunoResearch 111-007-003 Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody Dako A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  3. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  4. Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
  5. Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
  6. Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
  7. Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
  8. Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
  9. Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
  11. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  12. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
  13. Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
  14. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  15. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  16. Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
  17. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 138 иммунофлуоресценции сепсис гранулоцитарный изоляции гистонов citrullination peptidylarginine deiminase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, R. H. L., Tablin, F. In… More

Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58083, doi:10.3791/58083 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter