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Immunology and Infection

In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58083
Automatic Translation
1, 2
1Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Descriviamo i metodi per isolare canini neutrofili dal sangue intero e visualizzare formazione netta nei neutrofili dal vivo utilizzando la microscopia a fluorescenza. Sono anche descritti protocolli per quantificare la formazione netta e citrullinato istone H3 (citH3) espressione usando la microscopia di immunofluorescenza.

Abstract

In risposta ad agenti patogeni d'invasione, neutrofili rilasciare trappole extracellulari del neutrofilo (reti), che sono reti extracellulare del DNA decorato con gli istoni e proteine antimicrobiche. Eccessiva formazione netta (NETosis) e citH3 rilascio durante la sepsi è associato con più disfunzione dell'organo e la mortalità nei topi e nell'uomo ma le sue implicazioni nei cani sono sconosciuti. Qui, descriviamo una tecnica per isolare canini neutrofili dal sangue intero per l'osservazione e la quantificazione dei NETosis. Plasma leucocita-ricco, generato dalla sedimentazione del dextrano, è separato dai mezzi di comunicazione di commercialmente disponibile densità gradiente separazione e granulociti raccolti per conteggio e test di vitalità delle cellule. Per osservare in tempo reale NETosis dal vivo dei neutrofili, cellule permeante e macchie fluorescenti impermeant dell'acido nucleico cellulare vengono aggiunti ai neutrofili attivati da lipopolisaccaride (LPS) o phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA). Cambiamenti nella morfologia nucleare e formazione netta sono osservati nel corso del tempo da microscopia di fluorescenza. In vitro NETosis è ulteriormente caratterizzata da co-colocalizzazione di DNA libero (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) e citrullinato istone H3 (citH3) utilizzando un protocollo modificato di doppio-immunolabelling. Per quantificare oggettivamente formazione netta e citH3 espressione utilizzando la microscopia a fluorescenza, reti e cellule citH3-positive sono quantificate in un modo accecato utilizzando il software disponibile. Questa tecnica è un dosaggio specifico per valutare la capacità in vitro dei neutrofili canini di subire NETosis.

Introduction

I neutrofili sono di breve durati granulociti responsabili della iniziale difesa contro agenti patogeni d'invasione. Neutrofili, reclutati nel sito di infezione, eliminano microrganismi di fagocitosi, la degranulazione e la generazione di ossigeno reattivo (ROS) specie1. In presenza di batteri o endotossine, neutrofili rilascio dei neutrofili extracellulare trappole (reti), composto di cromatina extracellulare decorato con gli istoni e proteine granulari come elastasi e mieloperossidasi (MPO)2. Anche se le reti sono indispensabili proprietà antimicrobiche, crescenti evidenze sperimentali e cliniche suggerisce che troppo zelante formazione netta durante la sepsi può condurre a più organo disfunzione e morte3,4, 5 , 6.

Poiché le reti possono svolgere un simile ruolo patofisiologico nei cani, gli interventi terapeutici che prevenire o diminuiscono formazione netta possono servire da nuove strategie terapeutiche in animali settici. Per questo motivo, c'è la necessità di una tecnica affidabile valutare e quantificare i componenti netti nei cani e NETosis. NET componenti tra cui DNA libero (cfDNA) e nucleosomi sono state valutate in precedenza in neutrofili canini e plasma dai clinici cani7,8,9. Facendo uso delle analisi di fluorescenza, Goggs e Letendre trovato che settici cani hanno livelli elevati di cfDNA rispetto a cani sani,8. Anche se queste tecniche sono altamente oggettiva e quantitativa, misura di cfDNA e nucleosomi come marcatori di NETosis è non specifica, poiché essi possono essere derivate da cellule necrotiche diverso da NETosing neutrofili. Qui descriviamo una tecnica che utilizza la microscopia di fluorescenza per esaminare i comportamenti dei neutrofili NETosing dal vivo. Dettagliamo anche un protocollo modificato utilizzando double-immunolabeling soggettivamente quantificare le reti e i loro componenti quali MPO e citH3 in neutrofili canini10.

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Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la University of California, Davis e istituzionali cura degli animali (numero di protocollo: 18338).

1. prelievo sangue

  1. Disegnare 10 mL di sangue da una vena cefalica o giugulare utilizzando un ago 21G dall'aspirazione di siringa.
  2. Per evitare un'eccessiva sollecitazione di taglio, rimuovere l'ago dalla siringa prima di trasferire il sangue in provette contenenti eparina sodica (75 USP). Capovolgere delicatamente le provette un paio di volte a garantire un'adeguata miscelazione di anticoagulante e sangue. Verifica l'evidenza di coaguli o aggregati di eritrociti prima di posizionare i campioni sul ghiaccio.

2. isolamento del neutrofilo

  1. Diluire il sangue anticoagulato con un volume uguale di tampone fosfato salino di gelida Dubecco (DPBS) (pH 7.4, senza cationi bivalenti). Trasferire 8 mL di sangue diluito in una provetta conica in polipropilene da 50 mL contenente 25 mL di 3% destrano (da Leuconostoc spp. sciolto in soluzione di cloruro di sodio 0,9%). Disporre il tubo verticalmente a temperatura ambiente per 30 min consentire l'aggregazione e la sedimentazione degli eritrociti.
  2. Con attenzione strato 5 mL di plasma leucocita-ricco (Figura 1) sulla cima di 5ml di media gradiente di densità in un tubo di turno-fondo 14 mL in polipropilene. Fare attenzione a non mescolare i 2 soluzioni11.
  3. Centrifugare le provette a 400 x g con accelerazione/decelerazione (A/D) impostato su 0 (nessun freno) per 30 min a temperatura ambiente.
  4. Utilizzando un 5ml pipetta sierologica raccogliere lo strato delle cellule del granulocyte bypassando il plasma e i livelli di sangue periferico (PBMC) di cellule mononucleate (Figura 1). Utilizzare una nuova pipetta ogni volta per minimizzare la contaminazione.
  5. Posto 4 a 6 mL di strato delle cellule del polymorphnuclear (PMN) in un tubo conico in polipropilene da 50 mL. Dal momento che una piccola quantità di aggregati di eritrociti può essere aspirata insieme al livello PMN, usare una pipetta sierologica da 1 mL per rimuovere delicatamente gli aggregati dell'eritrocito che sono depositati nella parte inferiore del tubo.
  6. Lisare gli eritrociti rimanenti con 20 mL di acqua distillata fredda. Capovolgere delicatamente la provetta più volte per 30 a 60 s per garantire adeguata lisi prima di aggiungere un volume uguale di soluzione di cloruro di sodio 1,8% ghiacciata.
  7. Centrifugare a 112 x g per 10 min a 4 ° C, A/D impostato a 0.
  8. Ripetere il passo di lisi degli eritrociti se questo pellet viene visualizzato in rosso. Scartare il surnatante con cura con una pipetta sierologica e delicatamente risospendere il pellet in 100 µ l di DPBS (destrosio di 5 mM, 0.9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 e 1% albumina di siero bovino, pH 7,3). Unire tutte le celle di sedimento e metterli su ghiaccio.
  9. Eseguire un conteggio delle cellule usando un analizzatore automatizzato delle cellule e verificare il conteggio di un emocitometro. Se necessario, concentrarsi PMNs su una lastra di vetro utilizzando una citocentrifuga (1.000 giri/min, 5 min) e determinare la percentuale dei neutrofili contando il numero di neutrofili rispetto al numero totale delle cellule.
  10. Determinare la fattibilità dei neutrofili eseguendo un test di esclusione del blu di trypan, come indicato dalla Strober et al. 12 isolamento successo dovrebbe produrre una redditività dal 95 al 100% e neutrofili dovrebbero essere superiori al 95%.
  11. Determinare la concentrazione dei neutrofili moltiplicando il conteggio totale delle cellule con la vitalità percentuale e la percentuale dei neutrofili. Isolamento di successo dovrebbe produrre una concentrazione dei neutrofili da 1,5 a 6 x 106/ml.
  12. Diluire i neutrofili a una concentrazione finale di 1 x 106/ml con DPBS contenente destrosio di 5 mM, 0.9 mM MgCl2, 1,9 mM di CaCl2e 1% di albumina di siero bovino con pH regolato a 7.3.

3. fluorescente microscopia di neutrofili dal vivo

  1. Posto da 200 a 400 μL di neutrofili (1 x 106/ml) in ciascun pozzetto della poli-L-lisina 12-pozzetti cultura piatto rivestito. Consentire i neutrofili ad aderire al fondo dei pozzetti incubando le cellule a 37 ° C per 30 min.
  2. Etichetta di acidi nucleici con 1 μM di uno dei due acidi nucleici coloranti, uno che le macchie in cellule con membrane intatte e uno che le macchie in cellule con membrane permeabili (Vedi Tabella materiali), per 10 min a temperatura ambiente.
  3. Attivare i neutrofili con il lipopolysaccharide di 100 μg/mL (LPS) (e. coli O55. B5), 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) come controllo positivo, o un equivalente volume di DPBS come controllo negativo per 180 min a 37 ° C.
  4. Acquisire immagini utilizzando la GFP (eccitazione: 470/22 nm, emissione: 525/50 nm) e canali di Texas Red (eccitazione: 585/29 nm, emissione: 628/32 nm) su un microscopio a fluorescenza a 40 ingrandimenti presso i seguenti punti di tempo: 30, 90, 120 e 180 min.

4. netto quantificazione e l'individuazione delle componenti netti mediante immunofluorescenza

  1. Posizionare con attenzione il coprioggetto 18 mm diametro poli-D-lisina rivestito nei pozzetti di una piastra di coltura 12-pozzetti. Etichettare correttamente i pozzi.
  2. Seme 100 a 200 μL di isolato neutrofili (1 x 106/ml) direttamente sulle lamelle e consentire i neutrofili ad aderire al coprioggetto incubando le cellule a 37 ° C per 30 min.
  3. Attivare i neutrofili come descritto al punto 3.3. Inibiscono la formazione netta pretrattando i neutrofili con µΜ 200 Cl-amidine (15 min, 37 ° C) prima dell'attivazione come precedentemente descritto da Li et al. 13 assicurarsi che il controllo del proprio veicolo (DMSO) è incluso nell'esperimento.
  4. Rimuovere con cautela i vetrini con una pinzetta. Strato un foglio di pellicola di paraffina sopra un cavalletto di provetta creare pozzi poco profondi e inserire 2 o 3 gocce di 4% PFA in ogni ben10. Etichettare correttamente i pozzetti e appoggialo delicatamente con il coprioggetto upside-down sui pozzi di PFA-riempito. Consentire alle cellule di essere fissato a temperatura ambiente per 20 min.
  5. Lavare le cellule 3 volte in DPBS per 5 min, spostandoli da un pozzetto per il prossimo.
  6. Se immunolabelling non può essere eseguita subito dopo la fissazione e l'attivazione del neutrofilo, consentire vetrini coprioggetto essere essiccato inserendo i vetrini a faccia in su un pezzo di carta di assorbanza. Vetrini possono essere conservati per fino a 1 settimana a faccia in su in una piastra di coltura di 12-pozzetti etichettati a 4 ° C fino a ulteriori analisi. Lavare le cellule 3 volte in DPBS per 1 min, utilizzando la stessa tecnica come descritto in 4.4 prima di procedere al passaggio successivo.
  7. Per permeabilize le cellule, appoggiare delicatamente il vetrino coprioggetto capovolta su una goccia di 1% NP-40 per 1 min, utilizzando la tecnica descritta in 4.4. Lavare 3 volte in DPBS per 1 minuto su un agitatore meccanico.
  8. Assegnare ogni campione a un numero e utilizzare un indicatore di punte di diamante per etichetta di conseguenza i coprioggetti in modo casuale.
  9. Preparare ed etichetta individuale di Petri allineato con il film di paraffina e 100 a 200 μL di siero di capra del 5% sulla pellicola (tampone di arresto). Posare i coprioggetti upside-down sul tampone bloccante. Mettere su un rocker e incubare per 1h a 37 ° C.
  10. Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico.
  11. Diluire l'anticorpo primario (istone di 1: 400 coniglio policlonale anti-citrullinated H3 (citH3) nel 5% di siero di capra). Incubare le cellule in piastre di Petri con etichetta allineato con il film di paraffina. Appoggiare ogni vetrino coprioggetto upside-down sul 50 a 100 μL della soluzione di anticorpo diluito. Mettere su un rocker e incubare per 1h a 37° C.
  12. Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico.
  13. Diluire anticorpo secondario coniugato con un fluoroforo (1: 200) in siero di capra 5%. Incubare le cellule in piastre di Petri con etichetta allineato con il film di paraffina. Appoggiare ogni vetrino coprioggetto upside-down sul 50 a 100 μL della soluzione di anticorpo diluito. Posto su un rocker e Incubare 1h a 37 ° C al buio.
  14. Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico al buio.
  15. Per il rilevamento simultaneo del myeloperoxidase (MPO) seguire i seguenti passi per un protocollo modificato Doppio immunolabeling come descritto da Li et al. 13
  16. Incubare le cellule in piastre di Petri con etichetta allineato con il film di paraffina. Appoggiare ogni vetrino coprioggetto upside-down su 100 e 200 μL di 10% coniglio siero sotto dolce dondolo (durante la notte, 4 ° C, al buio).
  17. Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico al buio.
  18. Incubare le cellule in capra non coniugata di 50 μg/mL anti-coniglio Fab frammenti per 2 h a temperatura ambiente su un rocker nel buio.
  19. Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico al buio.
  20. Diluire l'anticorpo primario (1: 200 coniglio anti-umani MPO anticorpi policlonali) in siero di capra 5%. Incubare le cellule in piastre di Petri con etichetta allineato con il film di paraffina. Appoggiare ogni vetrino coprioggetto upside-down sul 50 a 100 μL della soluzione di anticorpo diluito. Posto su un rocker e Incubare 1h a 37° C al buio.
  21. Diluire l'anticorpo secondario coniugato ad un fluoroforo in siero di capra del 5% e incubare come descritto in 4.8
  22. Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico al buio.
  23. Controlli di interferenza devono essere preparati da escluse incubazione con entrambi gli anticorpi primari nel secondo passaggio immunitario-etichettatura.
  24. Macchia di DNA con 300 nM di 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, dicloridrato (DAPI) per 5 min al buio a temperatura ambiente.
  25. Lavare 3 volte in DPBS per 1 minuto su un rocker nel buio.
  26. Applicare una goccia (~ 50 μl) del montante antifade su una lastra di vetro. Picchiettare delicatamente il bordo del coverslip su una carta assorbente per rimuovere il tampone in eccesso prima di montare il vetrino coprioggetto con le cellule upside-down. Il mezzo di montaggio dovrebbe formare uno strato sottile tra il vetrino coprioggetto e il vetrino. Per rimuovere le bolle d'aria, premere molto delicatamente il vetrino coprioggetti con una pinzetta.
  27. Permetta che i campioni curare una notte al buio a 4 ° C. Il mezzo di montaggio dovrebbe indurire per analisi microscopiche con lenti ad immersione. Conservare i campioni a 4 ° C al buio.

5. del neutrofilo trappola extracellulare quantificazione

  1. Accecare gli operatori di acquisire e analizzare le immagini del microscopio alle condizioni sperimentali.
  2. Usando un microscopio a fluorescenza a 40 ingrandimenti, prendere 10 immagini in modo casuale da varie regioni di ogni vetrino coprioggetti in un esperimento sotto i rispettivi canali. Assicurarsi che il tempo di esposizione, la luminosità e il contrasto di ogni canale sono mantenuti costante durante l'acquisizione di immagini.
  3. Analizzare le immagini utilizzando il software disponibile come ImageJ (NIH). Identificare le reti basate su co-localizzazione di cfDNA, citH3 e MPO (Figura 3A, B). Quantificare il numero delle reti e dei neutrofili in 10 campi casuali per ogni condizione sperimentale. Numeri di reti rilasciato può essere espressa come rapporto (numero di reti: numero totale dei neutrofili) per ogni condizione sperimentale.
  4. Per valutare gli effetti del trattamento sull'espressione intracellulare citH3, contare il numero dei neutrofili con citH3 intracellulare e il numero dei neutrofili senza citH3 intracellulare in 10 campi casuali a 40 ingrandimenti sotto i rispettivi canali ( Figura 3, frecce rosse). Espressione citH3 intracellulare può essere espresso come il rapporto tra numero dei neutrofili con citH3 intracellulare al numero di neutrofili senza citH3 intracellulare.

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Representative Results

Usando questo protocollo dell'imaging di cellule vive, gli investigatori possono osservare la morfologia nucleare, l'integrità della membrana del plasma e la presenza di cfDNA vivente dei neutrofili. Un colorante nucleare impermeant cella macchie acidi nuclei rosso in cellule con membrane cellulari danneggiate. Un altro colorante cellulare-permeante, etichette sugli acidi nucleici intracellulare in cellule vive con le membrane intatte di plasma. Tutti i neutrofili intatti, indipendentemente dalla loro trattamenti, dovrebbero apparire verdi e presentano i caratteristici nuclei lobulated a 0 a 30 min dopo stimolazione (Figura 2A). I nuclei dei neutrofili PMA-trattati cominciano a perdere il loro aspetto lobulato da circa 60 min e continuano a decondense fino al rilascio di cfDNA (Figura 2B). LPS, uno stimolante più lento e più fisiologico dei neutrofili canini, in genere non provocare decondensazione della cromatina o NETosis fino a 90 min dopo stimolazione (Figura 2B). 120 min, neutrofili LPS - e PMA-attivato possono essere veduti circondato da cfDNA. Rispetto ai LPS, neutrofili più-PMA attivato perdono la loro integrità della membrana plasmatica come sono macchiati rosso dal colorante impermeant cella (Figura 2). Neutrofili non stimolati (controllo DPBS) dovrebbero mantenere i nuclei lobulated e membrana plasmatica intatta per tutto il periodo di incubazione (Figura 2A-C).

NET componenti composto da cfDNA, citH3 e MPO granuli vengono rilevati utilizzando il protocollo doppio immunolabeling. Rilascio di reti, identificato basato sulla co-localizzazione di cfDNA, citH3 e MPO, in risposta ai LPS e PMA sono mostrati in Figura 3A e 3B, rispettivamente. Neutrofili stimolati da LPS per 180 min producono discreti web-come scaffold di reti in prossimità vicini neutrofili (Figura 3A). Al contrario, i neutrofili attivati dal PMA prodotte grandi quantità di reti che erano notevolmente più grandi nella zona (Figura 3B, D). Citrullination degli istoni H3, catalizzata dall'enzima peptidylarginine deiminasi (PAD), è un segno distintivo di NETosis. PMA, un potente stimolante del PAD, si traduce in un maggior numero di cellule che esprimono citH3 intracellulare rispetto ai neutrofili non stimolati e LPS-stimolata (Figura 3E).

Figure 1
Figura 1: un diagramma schematico che illustrano la procedura di isolamento del neutrofilo canino. Sangue intero eparinizzato diluito in primo luogo è mescolato con 3% destrano per sedimentazione dei globuli rossi (RBC). Plasma leucocita-ricco è poi raccolti e a strati su volumi uguali di media separazione gradiente di densità disponibili in commercio. Dopo centrifugazione (400 x g, 30 min), lo strato di RBC-granulociti è estratta e il RBCs rimanenti vengono rimossi da Lisi ipotonica. Dopo l'aggiunta del 1,8% NaCl, granulociti sono filati giù (112 x g, 5 min) e risospesi in tampone dedicata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: immagini rappresentative fluorescente dei neutrofili canini live. Neutrofili isolati sono stati attivati con 100 µ g/mL LPS, 100 nM PMA o equivalente volume di soluzione tampone fosfato di Dubecco (DPBS) come controllo negativo per un totale di 180 min. sugli acidi nucleici in neutrofili intatti dal vivo erano macchiate verde con l'utilizzo di un cellulare-permeante tintura, mentre cfDNA e dei neutrofili con membrane cellulari compromessi erano macchiati di rosso con un colorante cellulare-impermeant. (A, D) Neutrofili DPBS e LPS-trattati tutti mantenuto una membrana intatta delle cellule con i nuclei lobulated (asterisco). (A, E) I nuclei dei neutrofili attivati dal PMA cominciarono a subire decondensazione (frecce). (B, F) 90 min, maggior parte dei nuclei dei neutrofili LPS - o PMA-attivato avevano perso loro aspetto lobulato (frecce Blue). (C) dopo 120 min, tutti i neutrofili attivati dal PMA hanno avuti membrane permeabili al plasma circondate da cfDNA mentre cfDNA potrebbe essere visto che circonda un piccolo numero di neutrofili LPS-attivato (frecce). Neutrofili non stimolati non hanno prodotto cfDNA né avevano compromesso la membrana cellulare in qualsiasi momento (A-C). (A-B) Originale 40 X ingrandimento. Barra della scala = 100 µm. (D-F) 80 X ingrandimento. Barra della scala = 30 µm. esperimento è stato replicato due volte da neutrofili isolati da 3 diversi donatori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: formazione netta. (A-C) Immunofluorescente immagini rappresentative di in vitro NET formazione. Neutrofili isolati da un singolo donatore sono stati corretti, permeabilizzate e macchiato per DNA (blu), myeloperoxidase (MPO, verde) e citrullinato istone H3 (citH3, rosso) dopo stimolazione con LPS (A), 100 µ g/mL, (B) 100 nM PMA o DPBS (C) 180 min. reti, identificate da co-localizzazione di cfDNA, MPO e citH3, sono delineate (linee tratteggiate) su (A) LPS - e (B) PMA-attivazione dei neutrofili. Esempi di espressione intracellulare di citH3 sono indicati dalle frecce rosse. (C) No reti né citH3 intracellulare sono visti nei neutrofili non stimolati. Barra della scala = 100 µm (D, E) rappresentante casella e whisker piazzole di formazione netta ed espressione intracellulare citH3 in neutrofili isolati da 4 cani. La casella si estende da 25th a 75th percentili e baffi spaziano dal più piccolo al più grande valore. LPS e stimolazione di PMA ha provocato significativi formazione netta (D) ed (E) citH3 intracellulare espressione rispetto ai neutrofili non stimolati. + significa che rappresenta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Presentiamo qui un protocollo per osservare i cambiamenti nella conformazione e cfDNA i nuclei dei neutrofili canini vivente utilizzando un colorante permeante cella sia un colorante impermeant cella. Il vantaggio principale di questo test è che permette per il rilevamento in tempo reale di formazione netta di microscopia ad alta risoluzione nei neutrofili dal vivo senza fissazione delle cellule, di conseguenza, fornendo uno strumento semplice e prezioso per l'osservazione in vitro formazione netta. Poiché questo test non richiede gli anticorpi per il rilevamento di componenti di rete, è ideale per studiare NETosis in specie con limitata disponibilità di anticorpi specifici della specie. Usando questa analisi, gli autori hanno dimostrato che i neutrofili canini subiscono decondensazione della cromatina sotto LPS o PMA stimolazione prima del NETosis13. Un grande svantaggio di questa tecnica è che non è specifico per NETosis. Perché il colorante impermeant cella macchie anche acidi nucleici nelle cellule necrotiche o acidi nucleici rilasciati dai neutrofili lisati, cellule impermeant-positive cfDNA o cella potrebbero essere erroneamente interpretate come neutrofili reti o NETosing. In alternativa, la specificità del NETosis può essere aumentata mediante l'inclusione dei neutrofili attivati di PMA o LPS che sono pretrattati con l'inibitore di PAD4, Cl-ammidine. Abbiamo dimostrato qui l'importanza di garantire la sterilità e la corretta gestione dei neutrofili durante tutto il processo di isolamento come contaminazione e forze pura possono portare a necrosi in vitro e lisi di cella. Si consiglia inoltre di rispettare le temperature adeguate durante i protocolli e prevenire prolungato (> 1 min) Lisi ipotonica. Per confermare la vitalità degli straordinari neutrofili isolati, un test di esclusione del Trypan Blue, nonché un controllo negativo costituito da neutrofili non stimolati è altamente raccomandato.

Poiché cfDNA rilevato dalle tinture dell'acido nucleico cellulare impermeabile non è specifico per NETosis, abbiamo sviluppato un protocollo di Doppio-immunolabeling per quantificare in vitro formazione netta e l'espressione intracellulare citH3 canini dei neutrofili. Appena i neutrofili rilasciano proteine granulari come MPO insieme a cfDNA e citH3 nello spazio extracellulare, netto quantificazione basata sulla co-localizzazione di cfDNA, citH3 e MPO è più specifico rispetto ad altri dosaggi come cfDNA, nucleosomi o complesso DNA-MPO 14. a causa della limitata disponibilità di anticorpi che cross-reagiscono con le proteine canini, abbiamo usato gli anticorpi primari che provengono da un'altra specie (coniglio). Per evitare la cattura di anticorpi primari di siti di legame libero residuo su anticorpi secondari in ogni passo del processo di colorazione, abbiamo utilizzato prima del siero di coniglio seguito da frammenti Fab non coniugati a saturare i siti di legame libero. Un passaggio fondamentale di questa procedura è quello di garantire adeguate per la pulizia per evitare attriti in eccesso di immunoglobuline e frammenti Fab che possono interferire con il rilevamento della seconda proteina di interesse. Si consiglia inoltre di testare diverse diluizioni di anticorpi primari e secondari per ridurre al minimo le interferenze e legame non specifico. Per garantire che gli anticorpi secondari da entrambe le operazioni immunolabelling si lega specificamente alla sua anticorpo primario, gli investigatori dovrebbero includere 2 diversi controlli che escludono o anticorpo primario nel secondo passaggio immunolabelling. Legame non specifico si verifica quando vengono rilevati segnali da entrambi gli anticorpi secondari.

Istone citrullination o deaminazione, catalizzata dall'enzima peptidylarginine deminase 4 (PAD4), è essenziale in batteri-collegato NETosis in topi e gli esseri umani15,16. Usando questa analisi, siamo stati in grado di determinare che LPS indotta NETosis in cani richiede anche dell'istone H3 citrullination da PAD13. Per verificare se lo stimolante di interesse induce NETosis da PAD4 attivazione, si consiglia l'inserimento di controlli positivi utilizzando noti attivatori PAD4 come PMA o ionoforo, A2318717. Se i neutrofili mostrano negativi macchiando per citH3 nei campioni di controllo positivo, il protocollo dovrà essere rivisti prima una macchiatura positiva sufficiente è condotto. Si consiglia inoltre l'inclusione di controlli negativi biologici costituiti da neutrofili non stimolati o neutrofili trattati con l'inibitore PAD, Cl-ammidine.

Accurata identificazione della struttura di reti distinta può essere difficile utilizzando questa tecnica. Questo può essere particolarmente difficile nei campioni con vasto NETosis, come la fusione delle strutture netti rilasciati dai neutrofili adiacenti più può condurre a sottovalutazione degli eventi NETotic. Risultati di questo test possono essere correlati con altri dosaggi più obiettive come la citometria a flusso o ELISA, che non sono ancora stati convalidati per l'uso nei neutrofili canini. Per evitare la formazione di struttura netta confluente, gli investigatori possono seminare una concentrazione più bassa delle cellule. In alternativa, diminuendo il tempo totale di incubazione può evitare ampia NETosis e fusione delle strutture di rete. Anche se questo protocollo può essere usato per studiare NETosis in altre specie, sulla base dell'esperienza degli autori, alla risposta dei neutrofili LPS o PMA può variare notevolmente tra le specie.

La scoperta delle reti nei cani evidenzia che NETosis è un meccanismo conservato dell'immunità innata durante l'infezione microbica e malattia immune-mediata. I saggi qui presentati possono essere un prezioso strumento per lo studio della NETosis in cani ed in altre specie. Una migliore comprensione di NETosis indotta da sepsi faciliterà l'ulteriore ricerca nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche per sepsi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

L'autore corrispondente è stato finanziato dalla Fondazione di animale Morris (D15CA-907). Lo studio è stato sostenuto dall'Università di California, Davis, centro per la salute equina e centro per la salute animale compagno (2016-24-F). Gli autori desidera ringraziare Geena Ng per la sua assistenza con le figure e Nghi Nguyen per la sua assistenza con il video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma 31392 Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS GE Life Sciences 17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285801 With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136 Without divalent cations
E. coli O55:B5 InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S11368 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7578 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40 Pierce 28324
Poly-D-Lysine coated coverslips neuVitro H-12-pdl 12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments Jackson ImmunoResearch 111-007-003 Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody Dako A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306

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References

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<em>In Vitro</em> Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza
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Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58083, doi:10.3791/58083 (2018).

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