Summary
우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.
Abstract
병원 균 침입에 대 한 응답, 중 성구 호 중구 extracellular 함정 (그물), 장식 된 히스톤과 항균 단백질 DNA의 세포 외 네트워크를 릴리스 합니다. 과도 한 네트워크 형성 (NETosis) 및 패 혈 증 동안 citH3 자료 여러 기관 역 기능 및 쥐와 인간 사망 관련 된 하지만 개 그 의미를 알 수 있습니다. 여기, 우리가 개 neutrophils 관찰과 NETosis의 정량화에 대 한 전체 혈액에서 분리 하는 기술을 설명 합니다. Dextran 침전에 의해 생성 된 백혈구 풍부한 플라즈마 상용 밀도 그라데이션 분리 미디어로 구분 되 고 granulocytes 수집 세포 수 및 생존 능력 테스트. 관찰 하기 위해 라이브 호 중구에서 실시간으로 NETosis, permeant 셀 및 셀 impermeant 형광 핵 산 얼룩 호 중구 활성화 lipopolysaccharide (LPS) 또는 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)에 추가 됩니다. 핵 형태학 및 NET 형성 변화는 시간이 지남에 형광 현미경 검사 법에 의해 관찰 된다. 생체 외에서 NETosis 공동-colocalization의 세포 없이 DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) 및 citrullinated 히스톤 H3 (citH3) 수정된 더블-immunolabelling 프로토콜을 사용 하 여 추가 특징 이다. 그물 그물 형성 및 citH3 식 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 객관적으로 계량을 하 고 citH3 양성 세포는 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 멀게 방식에서 계량. 이 기술은 체 외에서 의 용량 개 호 중구 NETosis을 평가 하는 특정 분석 결과 이다.
Introduction
호 중구는 짧은 granulocytes 병원 체 침입에 대 한 초기 방어에 대 한 책임. 먹어서, degranulation, 반응성 산소 종 (선생님)1세대에 의해 미생물을 제거 하는 호 중구, 감염의 사이트에 보충. 세균 또는 독, 있을 때 호 중구 릴리스 호 중구 extracellular 함정 (그물), extracellular chromatin의 구성된 장식 히스톤 elastase myeloperoxidase 같은 세분화 된 단백질 (MPO)2. 그물을가지고 있지만 필수적인 항균 속성, 패 혈 증 동안 불타 그물 형성 여러 장기 부전 및 죽음3,4, 으로 이어질 수 있습니다 제안 실험 및 임상 증거 증가 5 , 6.
그물 개에 유사한 병 태 생리 역할을 재생할 수 있습니다, 때문에 치료 개입을 방지 하거나 감소 그물 형성 정화 조 동물에 비 발한 치료 전략으로 봉사 할지도 모른다. 이러한 이유로, 평가 하 고 NETosis와 개에 있는 NET 구성 요소를 계량 하는 신뢰할 수 있는 기술에 대 한 필요가 있다. NET 구성 요소 셀 무료 DNA (cfDNA) 등 nucleosomes 개 호 중구 및 임상 개7,,89에서 플라즈마에 이전 평가 않았습니다. 형광 분석 실험을 사용 하 여, Goggs 및 Letendre 발견 정화 조 개 건강 개8보다 cfDNA의 더 높은 수준이 있다. 비록 이러한 기술은 매우 객관적이 고 정량적 인 NETosis의 표식으로 cfDNA 및 nucleosomes의 측정은 NETosing neutrophils 이외의 회 저 성 세포에서 파생 될 수 있기 때문에 일반적인입니다. 여기는 라이브 NETosing 호 중구의 행동 검사에 형광 현미경 검사 법을 활용 하는 기술에 설명 합니다. 우리는 또한 주관적으로 계량 그물과 MPO 등10개 호 중구에서 citH3 그들의 구성 요소를 더블-immunolabeling를 사용 하 여 수정 된 프로토콜을 선발.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법을 기관 동물 관리 및 사용, 데이비스가 주 대학에 위원회에 의해 승인 했다 (번호를 프로토콜: 18338).
1. 혈액 컬렉션
- 21g 바늘을 사용 하 여 주사기 포부에 의해 두 부 또는 jugular 정 맥에서 혈액 10 mL을 그립니다.
- 과도 한 전단 응력을 방지 하려면 나트륨 덤플링을 (75 USP)를 포함 하는 tube(s)로 혈액을 전송 하기 전에 주사기에서 바늘을 제거 합니다. 부드럽게 반전 튜브 몇 번 응고 제와 혈액의 적절 한 혼합 되도록. 혈전 또는 얼음에 샘플을 배치 하기 전에 레드 셀 집계를 확인 합니다.
2. 호 중구 절연
- 얼음 처럼 차가운 Dubecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) (pH 7.4, divalent 양이온 없이)의 동등한 양으로 anticoagulated 혈액 희석. 8 mL 희석된 혈액의 포함 ( Leuconostoc 종 0.9% 염화 나트륨 용액에 녹아 있는)에서 3 %dextran 25 mL 50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 관으로 전송 합니다. 튜브를 집계 및 적혈구의 침 강 30 분 동안 실내 온도에 똑바로 놓습니다.
- 신중 하 게 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브에 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL 위에 백혈구 풍부한 혈장 (그림 1)의 5 mL를 계층. 2 솔루션11혼합에 아닙니다 조심 하십시오.
- 400 x g 가속/감속을 실 온에서 30 분 동안 0 (브레이크) (A/D) 설정에서 튜브 원심
- 5 mL를 사용 하 여 혈 청 학적인 피펫으로 플라즈마 및 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 층 (그림 1)를 우회 하 여 granulocyte 셀 레이어를 수집 합니다. 오염을 최소화 하기 위해 새로운 피펫으로 각 시간을 사용 합니다.
- 폴 리 프로필 렌 50 mL 원뿔 튜브에 polymorphnuclear (PMN) 세포 층의 4 ~ 6 mL를 배치 합니다. 적은 양의 적혈구 집계 PMN 레이어와 함께 발음 될 수 있습니다, 이후 1 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 부드럽게 제거 적혈구 집계는 튜브의 하단에 정착.
- 차가운 초순 물 20 mL와 나머지 적혈구 lyse 부드럽게 여러 번 30 ~ 60 대 한 튜브를 반전 차가운 1.8% 염화 나트륨 해결책의 동일한 볼륨을 추가 하기 전에 적절 한 lysing 되도록 s.
- 4 ° C에서 10 분, 0 A/D 설정에 대 한 112 x g 에서 원심.
- 이 펠 릿 나타나는 붉은 경우 적혈구 세포 단계를 반복 합니다. 혈 청 학적인 피펫으로와 신중 하 게 상쾌한 삭제 하 고 부드럽게 DPBS (5 mM 포도 당, 0.9 m m MgCl2, 1.9 m m CaCl2 와 1% 소 혈 청 알 부 민, pH 7.3)의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend. 모든 resuspended 셀을 결합 하 고 얼음에.
- 자동된 세포 분석기를 사용 하 여 셀 수를 수행 하 고는 hemocytometer에 의해 카운트를 확인. 필요한 경우, cytocentrifuge (1000 rpm, 5 분)를 사용 하 여 유리 슬라이드에 PMNs 집중 하 고 셀의 총 수에서 호 중구의 수를 계산 하 여 호 중구의 비율을 결정.
- Strober 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 trypan 블루 제외 테스트를 수행 하 여는 호 중구의 생존 능력을 결정 12 성공적인 격리 95에서 100%는 생존을 산출 해야 한다 고 호 중구 95% 이상 이어야 한다.
- 백분율 생존 및 호 중구 백분율 총 세포 수로 호 중구의 농도 결정 합니다. 성공적인 격리 6 x 106/mL을 1.5에서 호 중구의 농도 양보 한다.
- 7.3으로 조정 하는 ph 5 mM 포도 당, 0.9 m m MgCl2, 1.9 m m CaCl2, 및 1% 소 혈 청 알 부 민을 포함 하는 DPBS와 호 중구 1 x 106/mL의 최종 농도에 희석.
3. 라이브 호 중구의 형광 현미경
- 폴 리-L-리 신의 각 음에 호 중구 (1 x 106/mL)의 400 μ 장소 200 12-잘 문화 플레이트 코팅. 30 분 동안 37 ° C에서 세포를 배양 하 여 우물의 바닥에 준수 호 중구 수 있습니다.
- 두 핵 산 염료 중 하나, 하나는 그대로 막 셀에 얼룩 및 투과성 멤브레인과 ( 재료의 표참조), 실 온에서 10 분에 대 한 셀에 얼룩 하나 1 μ M으로 핵 산을 라벨.
- 100 μ g/mL lipopolysaccharide (LPS) (E. 콜라이 O55와 호 중구 활성화. B5), 100 nM phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 긍정적인 통제, 또는 DPBS 180 분 37 ° c.에 대해 부정적인 컨트롤의 해당 볼륨
- 이미지는 GFP를 사용 하 여 (여기: 470/22 nm, 방출: 525/50 nm) 및 텍사스 레드 채널 (여기: 585/29 nm, 방출: 628/32 nm) 다음 시간 지점에서 40 배 확대에 형광 현미경 검사 법에: 30, 90, 120, 및 180 분.
4. NET 정량화 및 NET 구성 요소를 사용 하 여 면역 형광의 탐지
- 신중 하 게 12-잘 문화 접시의 우물에 18 m m 직경 폴 리-D-리 코팅 커버 전표를 놓습니다. 우물을 적절 하 게 레이블을 지정 합니다.
- 씨앗 100 ~ 200 μ는 coverslips에 직접 neutrophils (1 x 106/mL) 절연 고 30 분 동안 37 ° C에서 세포를 배양 하 여 커버 전표를 준수 호 중구.
- 3.3에 설명 된 대로 호 중구 활성화 합니다. 200 µΜ와 호 중구 pretreating 여 그물 형성 억제 Cl-amidine (15 분, 37 ° C) 리 외. 여 앞에서 설명한 활성화 이전 13 확인 적절 한 차량 제어 (DMSO)는 실험에 포함 됩니다.
- 조심 스럽게 잘 집게와 커버 슬립을 제거. 4%의 2 ~ 3 방울을 얕은 웰 스를 만드는 테스트 튜브 스탠드 위에 파라핀 필름 시트를 레이어 PFA 각 잘10. 우물을 적절 하 게 분류 하 고 부드럽게 PFA 가득 우물에 거꾸로 커버 슬립을 하다. 20 분 동안 실내 온도에 고정 수를 셀 수 있습니다.
- 한 음에서 다음 이동 하 여 3 회에서 5 분 동안 DPBS 셀을 씻어.
- Immunolabelling 호 중구 활성화 및 고정 후 수행할 수 없습니다, 경우 커버 전표 덮개 미 끄 러 짐 얼굴-최대 흡 광도 종이의 조각에 배치 하 여 건조 공기를 되도록 허용 합니다. 커버 슬립 추가 분석까지 4 ° C에서 이라는 12 잘 문화 접시에 최대 1 주 얼굴-최대 저장할 수 있습니다. 워시 DPBS 4.4 다음 단계로 진행 하기 전에에서 설명 된 대로 동일한 기술을 사용 하 여 1 분 동안에 3 번 셀.
- 세포를 permeabilize를 부드럽게 커버 슬립 거꾸로에 하다 NP-40는 기술을 사용 하 여 1 분 동안 4.4에서 설명 하는 1%의 드롭. DPBS 로커에 1 분 동안 3 번을 씻어.
- 임의로 숫자를 할당 하는 각 샘플 하 고는 coverslips를 따라 다이아몬드 포인트 마커를 사용 하 여.
- 준비 고 레이블 개별 접시 파라핀 영화 늘어서 (버퍼 차단) 필름에 5% 염소 혈 청의 100 ~ 200 μ를 배치 합니다. 블로킹 버퍼에는 coverslips를 거꾸로 누워. 로커에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 품 어
- DPBS 로커에 5 분 동안 3 번을 씻어.
- 1 차적인 항 체 희석 (1:400 토끼 polyclonal 안티-citrullinated 히스톤 H3 (citH3) 5% 염소 혈 청에서). 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 품 어
- DPBS 로커에 5 분 동안 3 번을 씻어.
- 희석 이차 항 체는 5% 염소 혈 청에 fluorophore (1: 200)을 활용. 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 어둠 속에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어.
- 어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.
- Myeloperoxidase (MPO)의 동시 검출에 대 한 리 외. 에 설명 된 대로 수정된 더블 immunolabeling 프로토콜에 대 한 다음 단계에 따라 13
- 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 각 커버 슬립 거꾸로에 누워 10% 토끼의 100 ~ 200 μ 부드러운 락 (하룻밤, 4 ° C, 어둠 속에서)에서 혈 청.
- 어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.
- 셀 50 μ g/mL 결합형된 염소 안티 토끼 팹 어둠 속에서 로커에 실 온에서 2 h에 대 한 조각에 품 어.
- 어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.
- 1 차적인 항 체 (1: 200 토끼 polyclonal 항 인간의 MPO 항 체)에 5% 염소 혈 청을 희석. 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 어둠 속에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어.
- 5% 염소 혈 청에 fluorophore를 활용 된 이차 항 체를 희석 하 고 품 어 4.8에 설명 된 대로
- 어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.
- 간섭 제어 두 번째 면역 라벨 단계에서 어느 주 항 체를 가진 외피를 제외 하 여 준비 되어야 한다.
- 300 DNA를 얼룩 nM의 4' 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) 실 온에서 어둠 속에서 5 분.
- 어둠 속에서 로커에 1 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.
- 유리 슬라이드에 antifade mountant의 드롭 (~ 50 μ)을 적용 합니다. 부드럽게 거꾸로 셀으로 coverslip를 탑재 하기 전에 초과 버퍼를 제거 하는 흡수 성 종이에 coverslip의 가장자리를 누릅니다. 장착 매체는 coverslip와 유리 슬라이드 사이 얇은 층을 형성 한다. 공기 방울을 제거, 매우 부드럽게 누릅니다는 coverslip에 좋은 집게와.
- 4 ° c.에 어둠 속에서 하룻밤 치료 샘플 허용 장착 매체 집중 렌즈와 현미경 분석에 대 한 강화 해야 합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
5. 호 중구 Extracellular 함정 정량화
- 수집 하 고 분석 하는 실험 조건에 현미경 이미지 operator(s) 장 님.
- 40 X 확대에 형광 현미경을 사용 하 여, 걸릴 10 이미지 임의로 해당 채널에서 실험에서 각 coverslip의 다른 지구에서. 노출 시간, 밝기 및 대비 각 채널의 이미지의 인수에 걸쳐 일관성이 유지 됩니다 확인 하십시오.
- 사용 가능한 소프트웨어 ImageJ (NIH) 등을 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. CfDNA, citH3, MPO (그림 3A, B)의 공동 지역화에 따라 그물을 식별 합니다. 계량 그물과 각 실험 조건에 대 한 10 임의의 필드에서 호 중구의 수 있습니다. 그물의 숫자 발표 비율로 표현 될 수 있습니다 (그물의 번호: 호 중구의 총 수) 각 실험 조건에 대 한.
- 세포내 citH3 식에 치료 효과 평가 하려면 계산 세포내 citH3와 호 중구의 수와 각 채널 ( 에서 40 배 확대에 10 임의의 필드에서 세포내 citH3 없이 호 중구 수가 그림 3, 빨간색 화살표). 세포내 citH3 식 세포내 citH3 세포내 citH3 없이 호 중구의 수와 호 중구 수의 비로 나타낼 수 있습니다.
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Representative Results
라이브 셀 이미징의이 프로토콜을 사용 하 여, 조사 핵 형태학, 원형질 막 무결성과 생활 호 중구에서 cfDNA의 존재를 확인할 수 있습니다. 손상 된 세포 막에 포함 된 셀에 셀 impermeant 핵 염색 얼룩 핵 산 레드. 다른 셀 permeant 염료, 라벨 그대로 플라즈마 멤브레인과 살아있는 세포에서 세포내 핵 산. 그들의 치료에 모든 그대로 neutrophils 녹색 표시 되 고 자극 (그림 2A) 후 0 ~ 30 분 특성 lobulated 핵을 전시 한다. PMA 처리 호 중구의 핵 약 60 분 lobulated 그들의 모습을 잃게 되 고 cfDNA (그림 2B)의 출시 될 때까지 decondense를 계속 시작 합니다. LPS, 느리고 더 생리 흥분 제 개 호 중구의 일반적으로 되지는지 않습니다 chromatin decondensation 또는 NETosis에 90 분까지 자극 (그림 2B) 후. 120 분, LPS와 PMA 활성화 neutrophils 볼 수 있습니다 cfDNA에 의해 둘러싸여. LPS에 비해, 더 PMA 활성화 neutrophils 셀 impermeant 염료 (그림 2C)에 의해 레드 스테인드는 그들로 그들의 원형질 막 무결성 손실. Lobulated 핵과 잠복기 (그림 2A-C)에 걸쳐 그대로 플라즈마 막 unstimulated neutrophils (DPBS 제어) 유지 해야 합니다.
NET 구성 요소 cfDNA 구성 된, citH3 및 MPO과 립 이중 immunolabeling 프로토콜을 사용 하 여 검색 됩니다. CfDNA의 공동 지역화를 기반으로 하는 그물, 식별의 출시, citH3 및 LPS와 PMA MPO 각각 그림 3A 와 3B에 나와 있습니다. 180 분 LPS에 의해 자극된 호 중구 근처 neutrophils (그림 3A)에 가까운 근접에서 그물의 개별 웹 같은 건설 기계 생산. 반면에, PMA 활성화 호 중구 지역 (그림 3B, D)에 눈에 띄게 큰 있던 그물의 방대한 생산. Citrullination 히스톤 H3, 효소 peptidylarginine deiminase (패드)에 의해 촉매의 NETosis의 특징은. PMA, 패드의 강력한 자극 제 셀 표현 세포내 citH3 unstimulated와 LPS 자극 호 중구 (그림 3E)에 비해 높은 수 발생 합니다.
그림 1: 개 호 중구 분리의 단계를 보여주는 회로도. 적혈구 (RBC)의 침전에 대 한 3% dextran heparinized 전체 혈액 희석된 혼합 처음입니다. 백혈구-풍부한 혈장 수집 그리고 상용 밀도 그라데이션 분리 미디어의 동일 볼륨에 계층 이다. 원심 분리 (400 x g, 30 분), 다음 RBC granulocyte 레이어 추출 하 고 나머지 Rbc 침투성 세포에 의해 제거 된다. 1.8%의 추가 후에 NaCl, granulocytes 스핀 다운 (112 x g, 5 분)와 전용된 버퍼에서 resuspended. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 라이브 개 호 중구의 대표적인 형광 이미지. 격리 된 호 중구 100 µ g/mL LPS로 활성화 되었다, Dubecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 라이브 그대로 호 중구에서 180 분 핵 산의 총에 대 한 부정적인 제어로의 100 nM, PMA 또는 볼륨 셀 permeant를 사용 하 여 그린 스테인드 했다 염색 약 cfDNA 및 손상 된 세포 막과 호 중구 레드 셀 impermeant 염료와 스테인드 했다 하는 동안 (A, D) 모든 DPBS LPS 처리 neutrophils lobulated 핵 (별표)로 그대로 세포 막 유지. (A, E) PMA 활성화 호 중구의 핵 decondensation (화살촉)를 받아야 하기 시작 했다. (B, F) 90 분, LPS 또는 PMA 활성화 호 중구에서 대부분 핵 lobulated 모습 (파란색 화살표)을 잃었습니다. (C) 후 120 분, 모든 PMA 활성화 neutrophils 침투성 플라즈마 막 LPS 활성화 neutrophils (화살표)의 작은 수를 둘러싼 cfDNA를 볼 수 있는 하는 동안 cfDNA에 의해 포위 했다. Unstimulated 호 중구 cfDNA을 생성 하지 않았다도 아니다 세포 막 (A C) 언제 든 지 시간을 손상 했다. (A-B) 원래 40 X 확대. 눈금 막대 = 100 µ m. (D-F) 80 X 확대. 눈금 막대 = 30 µ m. 실험은 3 다른 기증자 로부터 격리 하는 호 중구에서 두 번 복제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 그물 형성. (A C) 체 외에 그물에서 형성의 대표적인 immunofluorescent 이미지. 단일 기증자 로부터 격리 된 호 중구 고정 했다, permeabilized 및 myeloperoxidase (MPO, 녹색) 및 citrullinated 히스톤 H3 dna (파란색), 물 (citH3, 빨간색) (A) 100 µ g/mL LPS, (B) 100으로 자극 후 PMA 또는 (C) DPBS nM 180 분에 대 한 그물, cfDNA, MPO 및 citH3, 공동 현지화로 식별 개요 (점선) (A) LPS-및 (B) PMA 활성화 호 중구에 있습니다. CitH3의 세포내 표현의 예는 빨간색 화살표로 표시 됩니다. (C) 그물도 세포내 citH3 unstimulated 호 중구에서 볼 수 있습니다. 눈금 막대 = 100 µ m. (D, E) 대표 상자와 수염 음모 그물 형성 및 세포내 citH3 식 4 개에서 분리 하는 호 중구에의. 상자 25번째 에서 75번째 백분위 확장 및 수염 스팬 작은에서 가장 큰 값을. 중요 한 (D) 그물 형성 (E) 세포내 citH3 식 unstimulated 호 중구에 비해 LPS와 PMA 자극 당하고. + 의미 하는 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
선물이 여기 생활 개 neutrophils 셀 permeant 염료와 셀 impermeant 염료를 사용 하 여에 핵 구조 및 cfDNA 출시를 프로토콜. 이 분석 결과의 주요 장점은 수 있다는 그물 형성의 실시간 탐지에 대 한 고해상도 현미경 셀 고정 없이 라이브 호 중구에 의해 따라서 관찰 하는 그물 형성 체 외에 는 간단 하 고 유용한 도구를 제공. 이 분석 결과 NET 구성 요소 검색에 대 한 항 체를 필요로 하지 않습니다, 때문에, 종의 항 체의 제한 된 가용성과 종에서 NETosis를 공부 하 고 이상적입니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 저자 개 호 중구에서 LPS 또는 PMA chromatin decondensation 받아야 시연 NETosis13이전 자극. 이 기술의 주요 단점은 특정 NETosis에 대 한는 것입니다. 셀 impermeant 염료는 또한 회 저 성 세포에서 핵 산 또는 lysed 호 중구에서 발표 하는 핵 산 얼룩, 때문에 cfDNA 또는 셀 impermeant 긍정적인 세포 그물 또는 NETosing neutrophils 잘못 해석 될 수 있다. 또는, PMA 또는 LPS 활성화 neutrophils PAD4 억제제, Cl-amidine와 청소용는 포함 하 여 NETosis의 특이성을 늘릴 수 있습니다. 우리가 시연 여기 무 균과 오염으로 격리 프로세스를 통해 호 중구의 적절 한 처리의 중요성 및 순전히 수 있다 생체 외에서 괴 사로 이어질 세력과 세포 세포의 용 해. 또한 좋습니다 프로토콜 내내 적절 한 온도 준수 하 고 장기화 방지 (> 1 분) 침투성 세포. 확인 하 고 격리 된 호 중구 초과의 생존, Trypan 블루 제외 테스트로 unstimulated 호 중구로 구성 된 부정적인 제어는 좋습니다.
셀 스며들 지 않는 핵 산 염료에 의해 감지 하는 cfDNA NETosis에 대 한 특정 하지 않습니다, 때문에 우리는 그물 형성 체 외에서 고 개 호 중구에서 세포내 citH3 식 측정에 대 한 이중-immunolabeling 프로토콜을 개발 했다. 호 중구 extracellular 공간으로 cfDNA와 citH3 MPO 같은 세분화 된 단백질을 출시, cfDNA, citH3, MPO의 공동 지역화에 따라 NET 정량화는 더 구체적인 cfDNA, nucleosomes 등 DNA MPO 복잡 한 다른 분석 실험에 비해 14. 개 단백질 cross-react 항 체의 한정 된 가용성으로 인해 사용 하는 다른 종 (토끼)에서 시작 되는 1 차 항 체. 잔여 무료 바인딩 사이트 착 과정의 어느 단계에서 2 차 항 체에 의해 1 차 항 체의 캡처를 방지 하려면 우리는 먼저 무료 바인딩 사이트 포화 결합형된 Fab 조각 뒤 토끼 혈 청 활용. 이 절차의 1 개의 중요 한 단계 면역 글로불린 및 관심의 두 번째 단백질의 검출을 방해할 수 있는 놀라 우 파편의 초과 바인딩 방지 하기 위해 적절 한 세척 하는 것입니다. 일반적인 바인딩 및 방해를 최소화 하기 위해 1 차 및 이차 항 체의 다른 희석을 테스트 것이 좋습니다. Immunolabelling 단계 중에서 2 차 항 체 그것의 1 차 항 체에 결속 되도록 조사 2 다른 컨트롤을 두 번째 immunolabelling 단계에서 어느 1 차적인 항 체를 제외를 포함 해야 합니다. 비 특정 바인딩 두 이차 항 체에서 신호 감지 될 때 발생 합니다.
히스톤 citrullination 또는 효소 peptidylarginine deminase 4 (PAD4)에 의해 촉매 탈 쥐와 인간15,16NETosis 박테리아 관련에 필수적 이다. 이 분석 결과 사용 하 여, 개에 NETosis LPS 유발도에서는 히스톤 H3 citrullination 패드13확인할 수 있었습니다. PAD4 활성화 하 여 NETosis을 유도 하는 관심의 자극 여부를 테스트 하려면 PMA 또는 칼슘 ionophore, A2318717처럼 알려진된 PAD4 활성 제를 사용 하 여 긍정적인 컨트롤의 포함을 하는 것이 좋습니다. 호 중구 쇼 부정적인 긍정적인 컨트롤 샘플에서 citH3에 대 한 얼룩, 결과 충분 한 긍정적인 얼룩 때까지 프로토콜 개정 해야 합니다. Unstimulated 호 중구 또는 Cl-amidine 패드 억제제로 치료 하는 호 중구로 구성 된 생물 부정적인 컨트롤의 포함을 좋습니다.
뚜렷한 그물 구조의 정확한 식별이이 기술을 사용 하 여 도전적 될 수 있다. NETotic 이벤트의 과소 이어질 수 있는 여러 인접 한 호 중구에서 발표 하는 그물 구조의 병합이 특히 광범위 한 NETosis와 어려운 될 수 있습니다. 이 분석 결과의 결과 개 호 중구에 사용 하기 위해 검증 되지 아직 cytometry 또는 ELISA, 같은 다른 더 객관적인 분석으로 상관 될 수 있습니다. Confluent 그물 구조 형성을 피하기 위해, 조사자 셀의 낮은 농도 시드할 수 있습니다. 또는, 총 보육 시간 감소 광범위 한 NETosis 및 그물 구조의 병합 피할 수 있다. 저자의 경험에 따라 다른 종에서 NETosis를 조사 하기 위해이 프로토콜을 사용할 수 있지만 호 중구 응답 LPS 또는 PMA는 종 중에서 크게 달라질 수 있습니다.
개 그물의 발견 NETosis 미생물 감염과 질병 면역 중재 동안 타고 난 면제의 보존된 메커니즘입니다 강조 표시 합니다. 여기에 제시 된 분석 실험은 개와 다른 종에 있는 NETosis의 연구에 대 한 유용한 도구가 될 수 있습니다. 패 혈 증 유발 NETosis의 더 나은 이해는 패 혈 증에 대 한 새로운 치료 전략의 개발에 추가 연구를 촉진 한다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
해당 작가 모리스 동물 재단 (D15CA-907)에 의해 투자 되었다. 연구 캘리포니아 대학, 데이비스, 말 건강 센터 및 동반자 동물 건강을 위한 센터에서 기금에 의해 지원 되었다 (2016-24-F). 저자는 비디오와 함께 그녀의 지원에 대 한 수치와 응이 구 엔 그녀의 지원에 대 한 지 나 Ng를 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
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