Summary
ونحن تصف الأساليب عزل الكلاب العَدلات من الدم كله، ووضع تصور لتشكيل الصافية في العَدلات حية باستخدام مجهر الأسفار. ووصف أيضا بروتوكولات التحديد الكمي لتشكيل الصافية وهيستون سيتروليناتيد H3 التعبير (citH3) باستخدام مجهر الفلورة.
Abstract
ردا على غزو العوامل الممرضة، حرر العَدلات العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات)، وشبكات خارج الخلية للحمض النووي مزينة هيستونيس والبروتينات المضادة للميكروبات. الإفراط في تشكيل الصافي (نيتسيس) والإفراج عن citH3 خلال الانتان يرتبط بالخلل في الجهاز ووفيات في الفئران والبشر متعددة ولكن آثارها في الكلاب غير معروفة. وهنا، يصف لنا تقنية لعزل الكلاب العَدلات من الدم كله للمراقبة والقياس الكمي نيتوسيس. يتم فصل البلازما الغنية بالكريات البيض، التي تم إنشاؤها بواسطة الترسب ديكستران، وسائل الإعلام فصل التدرج الكثافة المتاحة تجارياً وجمعت المحببة لخلية العد واختبار جدوى. لمراقبة نيتسيس في الوقت الحقيقي في العَدلات الحية، الخلية بيرمينت والبقع إيمبيرمينت الحمض النووي الفلورسنت خلية تضاف إلى العَدلات المنشط أما بواسطة lipopolysaccharide (LPS) أو phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية). التغييرات في مورفولوجيا النووية وتشكيل صافي لاحظها مجهرية الأسفار على مر الزمن. في المختبر كذلك يتميز نيتوسيس co-كولوكاليزاتيون خالية من خلايا الحمض النووي (كفدنا)، ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) وهيستون سيتروليناتيد H3 (citH3) باستخدام بروتوكول تعديل مزدوج-إيمونولابيلينج. وكمياً موضوعيا تشكيل الصافية والتعبير citH3 باستخدام مجهر الأسفار، الشباك citH3-إيجابية الخلايا كمياً بشكل أعمى باستخدام البرمجيات المتاحة. هذا الأسلوب مقايسة محددة لتقييم القدرات في المختبر من العَدلات الكلاب البوليسية للخضوع نيتسيس.
Introduction
العَدلات هي المسؤولة عن الدفاع الأولية ضد غزو العوامل الممرضة لم تدم طويلاً المحببة. العَدلات، المعينين إلى موقع الإصابة، القضاء على الكائنات الحية الدقيقة التي البلعمه، وتحبب، وتوليد الأكسجين التفاعلية الأنواع (روس)1. وجود البكتيريا أو اندوتوكسينس، العَدلات الإصدار العَدلات خارج الخلية الفخاخ (شبكات)، تتألف من الكروماتين خارج الخلية مزينة هيستونيس والبروتينات الحبيبية مثل الاستاسي وميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات)2. على الرغم من أن شبكات لها خصائص مضادات الميكروبات لا غنى عنه، تزايد الأدلة التجريبية والسريرية تشير إلى أن تشكيل صافي مفرط خلال الانتان قد يؤدي إلى عدة الجهاز خلل ووفاة3،4، 5 , 6.
نظراً لأن شبكات قد تلعب دوراً الفيزيولوجية المرضية مشابهة في الكلاب، تصلح التدخلات العلاجية التي تمنع أو تقلل من تكوين شبكة استراتيجيات العلاج الرواية في الحيوانات التعفين. لهذا السبب، هناك حاجة لتقنية موثوقة لتقييم وتقدير حجم نيتسيس ومكونات صافي في الكلاب. سابقا قد تم تقييم صافي مكونات بما في ذلك الخلية الحرة الحمض النووي (كفدنا) ونوكليوسوميس في العَدلات الكلاب والبلازما من الكلاب السريرية7،،من89. استخدام فحوصات الأسفار، جوجس وليتيندري وجدت أن الكلاب الانتانية لديها مستويات أعلى من كفدنا من الكلاب صحية8. على الرغم من أن هذه التقنيات موضوعية للغاية والكمية، يتم قياس كفدنا ونوكليوسوميس كعلامات نيتسيس غير محددة نظراً لأنها يمكن أن يستمد من الخلايا نخرية خلاف العَدلات نيتوسينج. هنا يصف لنا أسلوب الذي يستخدم fluorescence الفحص المجهري لدراسة سلوك العيش نيتوسينج العَدلات. ونحن أيضا بالتفصيل بروتوكول تعديل استخدام مزدوج-إيمونولابيلينج لقياس ذاتي الشباك ومكوناتها، مثل الخطة الرئيسية للعمليات و citH3 في العَدلات الكلاب10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أقر جميع الأساليب الموصوفة هنا برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في جامعة كاليفورنيا، ديفيس (البروتوكول رقم: 18338).
1. جمع الدم
- رسم 10 مل دم أما في الاتجاه الرأسي أو جوجولار استخدام إبرة ز 21 بتطلع حقنه.
- لتجنب الضغط المفرط على القص، إزالة الإبرة من المحاقن قبل نقل الدم إلى tube(s) التي تحتوي على صوديوم الهيبارين (75 جامعة جنوب المحيط الهادئ). برفق عكس الأنابيب عدة مرات لضمان خلط كافية تخثر الدم والدم. التحقق من وجود أدلة من جلطات أو المجاميع الخلية الحمراء قبل وضع العينات في الثلج.
2-العَدلات العزلة
- تمييع الدم أنتيكواجولاتيد مع حجم متساوية من مخزنة الفوسفات المالحة المثلج دوبيككو (دببس) (الرقم الهيدروجيني 7.4، دون الكاتيونات ديفالينت). نقل 8 مل دم المخفف في أنبوب 50 مل مخروطية البوليبروبيلين التي تحتوي على 25 مل ديكستران 3 في المائة (من نستقه spp. المذابة في محلول كلوريد الصوديوم 0.9%). ضع الأنبوب رأسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للتجميع وترسب الكريات الحمراء.
- طبقة 5 مل بلازما الغنية بالكريات البيض (الشكل 1) بعناية على رأس 5 مل من كثافة وسائل الإعلام التدرج في أنبوب أسفل جولة 14 مل البوليبروبيلين. احرص على عدم خلط الحلول 211.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 400 x ز مع التسارع/التباطؤ (A/D) تعيين إلى 0 (لا الفرامل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام 5 مل بيبيت المصلية جمع طبقة الخلية المحببات بتجاوز بالبلازما والدم المحيطي طبقات الخلايا وحيدات النوى (PBMC) (الشكل 1). استخدام بيبيت من جديد في كل مرة للتقليل من التلوث.
- ضع 4 إلى 6 مل طبقة الخلايا بوليمورفنوكلير (المجنحة) في أنبوب 50 مل مخروطية البوليبروبيلين. منذ قد يستنشق كمية صغيرة من المجاميع كرات الدم الحمراء جنبا إلى جنب مع الطبقة المجنحة، استخدام بيبيت مصلية 1 مل لإزالة الركام كرات الدم الحمراء التي تمت تسويتها في الجزء السفلي من الأنبوب بلطف.
- الكريات الحمراء المتبقية مع 20 مل مياه الباردة عالي النقاوة. بلطف قلب الأنبوبة عدة مرات عن 30 إلى 60 ثانية لضمان ليسينج الكافية قبل إضافة وحدة تخزين متساوية من محلول كلوريد الصوديوم 1.8% المثلج.
- الطرد المركزي في 112 x ز 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، ومجموعة A/D إلى 0.
- كرر الخطوة تحلل كرات الدم الحمراء إذا ظهر هذا بيليه أحمر. تجاهل المادة طافية بعناية مع بيبيت مصلية ولطف ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من دببس (0.9 مم مجكل2، الدكستروز 5 مم والبومين المصل البقري 1%، 7.3 درجة الحموضة، 1.9 مم كاكل2 ). دمج كافة الخلايا ريسوسبينديد ووضع على الجليد.
- أداء عدد خلايا استخدام محلل خلية الآلي والتحقق من العدد من هيموسيتوميتير. إذا لزم الأمر، يركز بمنس على شريحة زجاج استخدام سيتوسينتريفوجي (1,000 لفة في الدقيقة، 5 دقيقة) وتحديد نسبة العَدلات بإحصاء عدد العَدلات من أصل العدد الإجمالي للخلايا.
- تحديد صلاحية العَدلات عن طريق إجراء اختبار استبعاد تريبان أزرق كما حددها ستروبر et al. 12 العزلة الناجحة ينبغي أن يعود جدوى من 95 إلى 100%، وينبغي أن يكون العَدلات أكثر من 95%.
- تحديد تركيز العَدلات بضرب عدد خلايا الكلي مع بقاء نسبة ونسبة العَدلات. العزل الناجحة ينبغي أن تسفر عن تركيز العَدلات من 1.5 إلى 6 × 106/mL.
- تمييع العَدلات بتركيز 1 × 106/mL نهائي مع دببس التي تحتوي على 0.9 مم مجكل2و 1.9 مم كاكل2، 5 ملم سكر العنب والبومين المصل البقري 1% مع تعديل إلى 7.3 درجة الحموضة.
3. فلوري مجهرية من العَدلات لايف
- مكان 200 إلى 400 ميكروليتر من العَدلات (1 × 106/mL) في كل بئر من بولي-L-يسين المغلفة صفيحة الثقافة 12-جيدا. السماح العَدلات على التمسك بالجزء السفلي من الآبار التي تفرخ الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تسمية الأحماض النووية مع 1 ميكرومتر واحد من اثنين الحمض النووي الأصباغ وأن البقع في الخلايا مع أغشية سالمة وأن البقع في الخلايا مع الأغشية المسامية (انظر الجدول للمواد)، لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تفعيل العَدلات مع 100 ميكروغرام/مل lipopolysaccharide (LPS) (O55كولاي . B5)، 100 نانومتر phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) كمراقبة إيجابية، أو ما يعادل حجم دببس كمراقبة سلبية لمدة 180 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- الحصول على الصور باستخدام التجارة والنقل (الإثارة: 470/22 نانومتر، الانبعاثات: 525/50 نانومتر) وقنوات "الأحمر تكساس" (الإثارة: 585/29 نانومتر، الانبعاثات: 628/32 نانومتر) المعني الفحص المجهري fluorescence في 40 X التكبير في النقاط الزمنية التالية: 30 و 90، 120 و 180 دقيقة.
4-صافي التقييم الكمي، والكشف عن مكونات صافي استخدام الفلورة
- بعناية وضع كشوف الغطاء بولي-د-يسين مغلفة بقطر 18 ملم في آبار لوحة الثقافة 12-جيدا. قم بتسمية الآبار على نحو ملائم.
- البذور 100 إلى 200 ميكروليتر من عزلة العَدلات (1 × 106/mL) مباشرة على كوفيرسليبس والسماح العَدلات على التمسك بكشوف الغطاء التي تفرخ الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تفعيل العَدلات كما هو موضح في 3.3. تحول دون تشكيل الصافية تقشير العَدلات مع 200 µΜ Cl-أميديني (15 دقيقة، 37 درجة مئوية) قبل التنشيط كما سبق وصف لي et al. 13 ضمان إدراج عنصر التحكم السليم مركبة ([دمس]) في التجربة.
- بعناية إزالة الغطاء كشوف بالملقط غرامة. طبقة ورقة بارافين فيلم أكثر من موقف أنبوبة الاختبار إنشاء الآبار الضحلة ووضع 2 إلى 3 قطرات 4% منهاج عمل بيجين في كل جيدا10. تسمية الآبار على نحو مناسب ولطف وضع كشوف الغطاء رأسا على عقب على الآبار مملوءة بمنهاج عمل بيجين. السماح للخلايا لتكون ثابتة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- تغسل الخلايا 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق، بنقلها من بئر واحدة إلى التالية.
- إذا كان لا يمكن إجراء إيمونولابيلينج بعد وقت قصير من تفعيل العَدلات والتثبيت، السماح بكشوف غطاء أن يكون الهواء المجفف بوضع كشوف غطاء الوجه إلى أعلى على قطعة من الورق امتصاص. يمكن تخزين كشوف غطاء ليصل إلى 1 في الأسبوع الوجه الأعلى في لوحة توسم 12-بئر ثقافة في 4 درجات مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل. تغسل الخلايا 3 مرات في دببس لمدة 1 دقيقة باستخدام نفس الأسلوب كما هو موضح في 4.4 قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
- إلى بيرميبيليزي الخلايا، بلطف وتكمن بكشف الغطاء رأسا على عقب على نسبة انخفاض قدرها 1% NP-40 لمدة 1 دقيقة باستخدام الأسلوب الموصوفة في 4.4. أغسل 3 مرات في دببس لمدة 1 دقيقة على الروك.
- عشوائياً تعيين كل عينة لعدد واستخدام علامة نقطة الماس لتسمية كوفيرسليبس تبعاً لذلك.
- إعداد وأطباق بتري الفردي تسمية اصطف مع الفيلم البارافين ومكان 100 إلى 200 ميكروليتر من مصل الماعز 5% على الفيلم (حجب المخزن المؤقت). تكمن في كوفيرسليبس رأسا في المخزن المؤقت حظر. مكان على الروك واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
- أغسل 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق في الروك.
- تضعف جسم الأولية (1: 400 الأرنب سيتروليناتيد مكافحة [بولكلونل] هيستون H3 (citH3) في مصل الماعز 5%). احتضان الخلايا في أطباق بتري المسمى اصطف مع الفيلم البارافين. وضع كل كشف الغطاء رأسا على 50 إلى 100 ميكروليتر من الحل جسم المخفف. مكان على الروك واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
- أغسل 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق في الروك.
- مترافق مخفف من الجسم المضاد الثانوي إلى فلوروفوري (1: 200) في مصل الماعز 5%. احتضان الخلايا في أطباق بتري المسمى اصطف مع الفيلم البارافين. وضع كل كشف الغطاء رأسا على 50 إلى 100 ميكروليتر من الحل جسم المخفف. مكان على الروك واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية في الظلام.
- أغسل 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق على الروك في الظلام.
- للكشف عن ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) المتزامنة اتبع الخطوات التالية لوضع بروتوكول تعديل إيمونولابيلينج مزدوجة كما وصفها لي et al. 13
- احتضان الخلايا في أطباق بتري المسمى اصطف مع الفيلم البارافين. وضع كل كشف الغطاء رأسا على عقب على 100 إلى 200 ميكروليتر من الأرانب 10% مصل تحت هزاز لطيف (بين عشية وضحاها، 4 درجة مئوية، في الظلام).
- أغسل 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق على الروك في الظلام.
- احتضان خلايا في 50 ميكروغرام/مل unconjugated الماعز الأرنب المضادة القوات المسلحة البوروندية وشظايا ح 2 في درجة حرارة الغرفة على الروك في الظلام.
- أغسل 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق على الروك في الظلام.
- تضعف جسم الأولية (1: 200 أرنب [بولكلونل] الإنسان المضادة الخطة الرئيسية للعمليات جسم) في مصل الماعز 5%. احتضان الخلايا في أطباق بتري المسمى اصطف مع الفيلم البارافين. وضع كل كشف الغطاء رأسا على 50 إلى 100 ميكروليتر من الحل جسم المخفف. مكان على الروك واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية في الظلام.
- تضعف جسم الثانوي مترافق فلوروفوري في مصل الماعز 5% واحتضان كما هو موضح في 4.8
- أغسل 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق على الروك في الظلام.
- وينبغي إعداد ضوابط التدخل باستثناء الاحتضان مع أما الأجسام الأولية في الخطوة الثانية الوسم المناعي.
- وصمة عار الحمض النووي مع 300 نانومتر من 4 ', 6-دياميديون-2-فينيليندولي، هيدروكلوريد (DAPI) لمدة 5 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل 3 مرات في دببس لمدة 1 دقيقة على الروك في الظلام.
- تطبيق قطره (~ 50 ميكروليتر) من مونتانت أنتيفادي إلى شريحة زجاج. اضغط برفق حافة ساترة على ورقة ماصة لإزالة الزائدة المخزن المؤقت قبل تركيب ساترة مع الخلايا رأسا على عقب. وينبغي أن تشكل المتوسطة تصاعد طبقة رقيقة بين ساترة والشريحة الزجاجية. لإزالة فقاعات الهواء، بلطف جداً اضغط على ساترة مع الملقط غرامة.
- تسمح العينات لعلاج بين عشية وضحاها في الظلام في 4 درجات مئوية. وينبغي أن تتصلب المتوسطة المتصاعدة للتحليل المجهري مع عدسات الغمر. تخزين العينات في 4 درجات مئوية في الظلام.
5-العَدلات خارج الخلية فخ الكمي
- أعمى منقولة اكتساب وتحليل صور المجهر للظروف التجريبية.
- استخدام مجهر الأسفار في 40 X التكبير، تأخذ الصور 10 عشوائياً من مناطق مختلفة من كل ساترة في تجربة تحت القنوات الخاصة بكل منها. ضمان الإبقاء زمن التعرض للضوء والسطوع والتباين لكل قناة ثابتاً في الحصول على الصور.
- تحليل الصور باستخدام البرمجيات المتاحة مثل إيماجيج (المعاهد الوطنية للصحة). التعرف على شبكات استناداً إلى الترجمة المشارك كفدنا، citH3، والخطة الرئيسية للعمليات (الشكل 3 أ، ب). التحديد الكمي للعدد من شبكات والعدلات في 10 حقول عشوائية لكل حالة تجريبية. أرقام شباك صدر يمكن التعبير عنها كنسبة (عدد من شبكات: إجمالي عدد العَدلات) لكل حالة تجريبية.
- لتقييم آثار المعالجة على التعبير citH3 داخل الخلايا، عد عدد العَدلات مع citH3 داخل الخلايا وعدد العَدلات دون citH3 داخل الخلايا في 10 حقول عشوائية في 40 X التكبير تحت كل القنوات ( 3 الرقم، الأسهم الحمراء). ويمكن التعبير عن التعبير citH3 داخل الخلايا كالنسبة عدد العَدلات مع citH3 داخل الخلايا لعدد العَدلات دون citH3 داخل الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول لتصوير الخلايا الحية، يمكن مراقبة المحققين مورفولوجيا النووية وسلامة غشاء البلازما ووجود كفدنا في العَدلات الحية. صبغة خلية نووية إيمبيرمينت البقع الأحماض نويات حمراء في الخلايا التي تحتوي على أغشية الخلايا التالفة. تسميات أخرى صبغ الخلية بيرميانت، الأحماض النووية داخل الخلايا في الخلايا الحية مع أغشية سالمة البلازما. ينبغي أن تظهر خضراء العَدلات سليمة كافة، بغض النظر عن هذه العلاجات، ويحمل نواة لوبولاتيد المميزة في 0 إلى 30 دقيقة بعد التحفيز (الشكل 2A). تبدأ نويات العَدلات تعامل سلطة النقد الفلسطينية تفقد مظهرها لوبولاتيد بحوالي 60 دقيقة، ولا تزال ديكوندينسي حتى الإفراج عن كفدنا (الشكل 2). لبس، منبه أبطأ وأكثر الفسيولوجية للكلاب العَدلات، عادة لا ينتج ديكوندينسيشن الكروماتين أو نيتسيس حتى 90 دقيقة بعد التحفيز (الشكل 2). قبل 120 دقيقة، يمكن رؤية لبس وسلطة النقد الفلسطينية تفعيل العَدلات محاطة كفدنا. مقارنة للبس، تفقد أكثر من سلطة النقد الفلسطينية تفعيل العَدلات سلامتهم غشاء البلازما كما أنها ملطخة الأحمر بصبغة إيمبيرمينت الخلية (الشكل 2). وينبغي الحفاظ على unstimulated العَدلات (دببس التحكم) نوى لوبولاتيد وغشاء البلازما سليمة طوال فترة الحضانة (الشكل 2 أ-ج).
صافي مكونات تتألف من كفدنا، citH3، وحبيبات الخطة الرئيسية للعمليات يتم الكشف عن استخدام بروتوكول إيمونولابيلينج مزدوجة. الإفراج عن شبكات، حددت استناداً إلى الترجمة المشارك من كفدنا، citH3، والخطة الرئيسية للعمليات، في استجابة للبس وسلطة النقد الفلسطينية ويبين الشكل 3 ألف و 3 باء، على التوالي. إنتاج العَدلات تحفزها لبس لمدة 180 دقيقة منفصلة السقالات ويب مثل الناموسيات بالقرب من العَدلات القريبة (الشكل 3A). وفي المقابل، العَدلات المنشط سلطة النقد الفلسطينية أنتجت كميات هائلة من الشباك التي كانت أكبر بشكل ملحوظ في المنطقة (الشكل 3، د). سيترولينيشن هيستونيس H3، تحفزها ديميناسي بيبتيديلارجينيني إنزيم (PAD)، السمة مميزة نيتسيس. سلطة النقد الفلسطينية، حافز قوي للوحة، ينتج عدد أكبر من الخلايا معربا عن citH3 داخل الخلايا بالمقارنة مع العَدلات unstimulated وحفز على لبس (الرقم 3E).
رقم 1: الرسم تخطيطي يدل على الخطوات لعزل العَدلات الكلاب. أولاً مختلطة المخفف هيبارينيزيد الدم كله مع ديكستران 3% لترسيب خلايا الدم الحمراء (RBC). ثم جمع البلازما الغنية بالكريات البيض والطبقات على كميات متساوية من وسائط فصل التدرج الكثافة المتاحة تجارياً. عقب الطرد المركزي (400 x ز، 30 دقيقة)، يتم استخراج الطبقة ربك المحببات وتتم إزالتها كرات الدم الحمراء المتبقية التي تحلل ناقص التوتر. بعد إضافة 1.8 ٪ كلوريد الصوديوم، نسج أسفل (112 x ز، 5 دقيقة) المحببة وحراكه في المخزن المؤقت المخصص. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الصور الفلورية الممثل من العَدلات الكلاب حية. تم تفعيل العَدلات معزولة مع 100 ميكروغرام/مل لبس، حجم 100 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية، أو ما يعادلها من الفوسفات مخزنة المالحة دوبيككو (دببس) كمراقبة سلبية لما مجموعة 180 دقيقة من الأحماض النووية في العَدلات سليمة حية كانت الملون الأخضر مع استخدام خلية بيرمينت صبغ بينما كفدنا والعدلات مع أغشية الخلية الشبهة كانت الملون الأحمر مع صبغة خلية إيمبيرمينت. (أ، د) العَدلات دببس ولبس تعامل جميع الحفاظ غشاء الخلية سليمة مع نويات لوبولاتيد (العلامة النجمية). (أ، ه) بدأت نواة العَدلات المنشط PMA الخضوع ديكوندينسيشن (رؤوس الأسهم). (ب، و) 90 دقيقة، قد فقدوا معظم الأنوية في لبس أو سلطة النقد الفلسطينية تفعيل العَدلات مظهرها لوبولاتيد (رؤوس الأسهم الزرقاء). (ج) بعد 120 دقيقة، كان جميع العَدلات المنشط PMA نفاذية الأغشية البلازمية محاطة كفدنا بينما يمكن النظر كفدنا المحيطة بعدد صغير من لبس تفعيل العَدلات (الأسهم). لا تنتج كفدنا العَدلات unstimulated كما قد يثير الشبهة غشاء الخلية في أي وقت (أ-ج). (أ-ب) 40 الأصلي X التكبير. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (د-و) 80 X التكبير. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. التجربة تم تكرارها مرتين من العَدلات المعزولة من ثلاث جهات مانحة مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تكوين NET. (أ-ج) صور إيمونوفلوريسسينت الممثلة في المختبر صافي تكوين. العَدلات معزولة من مانح واحد تم إصلاحها وبيرميبيليزيد والملون للحمض النووي (الأزرق)، ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات، الأخضر) وهيستون سيتروليناتيد H3 (citH3، أحمر) بعد التحفيز مع (أ) 100 ميكروغرام/مل لبس، (ب) 100 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية أو (ج) دببس للحد الأدنى 180 هي شبكات، حددها التعريب المشارك كفدنا، والخطة الرئيسية للعمليات و citH3، أوجز (الخطوط المنقطة) على لبس (A)--والعدلات (ب) تنشيط سلطة النقد الفلسطينية. وترد أمثلة التعبير داخل الخلايا و citH3 بالأسهم الحمراء. وتعتبر شبكات (ج) لا ولا citH3 داخل الخلايا في العَدلات أونستيمولاتيد. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (د، ه) الممثل المربع والخط الطولي قطع تشكيل الصافية والتعبير citH3 داخل الخلايا في العَدلات المعزولة من الكلاب 4. المربع تمتد من 25ال 75ال مقاييس النسبة المئوية وشعيرات تمتد من أصغر إلى أكبر قيمة. لبس وتحفيز سلطة النقد الفلسطينية أدت إلى تشكيل الصافي (د) كبيرة والتعبير داخل الخلايا citH3 (ه) بالمقارنة مع العَدلات unstimulated. + يعني يمثل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن الحاضرين هنا بروتوكولا لمراقبة التغييرات في الإصدار نويات المطابقة وكفدنا في العَدلات الكلاب الحية باستخدام صبغة بيرميانت خلية وصبغة إيمبيرميانت خلية. والميزة الرئيسية لهذا التحليل أنه يسمح للكشف عن تكوين NET في الوقت الحقيقي بالفحص المجهري عالية الدقة في العَدلات العيش دون تثبيت الخلية، وبالتالي، توفير أداة بسيطة وثمينة لمراقبة تشكيل الصافي في المختبر . حيث لا يتطلب هذا التحليل الأجسام المضادة للكشف عن مكونات صافي، أنها مثالية لدراسة نيتسيس في الأنواع ذات التوافر المحدود للأجسام المضادة إبلاغها. باستخدام هذا الفحص، أظهر الكتاب خضوع العَدلات الكلاب ديكوندينسيشن الكروماتين تحت لبس أو سلطة النقد الفلسطينية التحفيز قبل نيتسيس13. عيب رئيسي لهذا الأسلوب أنه ليس محدد نيتسيس. لأنه أيضا بقع الصبغ خلية إيمبيرمينت الأحماض النووية في الخلايا نخرية أو أطلق سراحهم من العَدلات تفكيك الأحماض النووية، يمكن أن تفسر كفدنا أو خلية من خلايا إيمبيرمينت إيجابية زورا كشبكات أو نيتوسينج العَدلات. وبدلاً من ذلك، يمكن زيادة خصوصية نيتسيس بما في ذلك سلطة النقد الفلسطينية أو لبس تفعيل العَدلات التي هي pretreated مع PAD4-مثبط، Cl-أميديني. أثبتنا هنا أهمية ضمان العقم والتعامل الصحيح مع العَدلات طوال عملية العزل كالتلوث وقوات محض يمكن أن تؤدي إلى نخر في المختبر وتحلل الخلية. كما نوصي بالامتثال إلى درجات حرارة كافية في جميع أنحاء البروتوكولات ومنع لفترات طويلة (> 1 دقيقة) تحلل ناقص التوتر. للتأكد من استمرارية العمل الإضافي العَدلات معزولة، يوصي بشدة اختبار استبعاد تريبان الأزرق، فضلا عن عنصر تحكم سلبية التي تتكون من العَدلات أونستيمولاتيد.
للكشف عنها بواسطة الحمض النووي خلية كتيمة الأصباغ كفدنا ليست محددة نيتوسيس، قمنا بتطوير بروتوكول مزدوجة-إيمونولابيلينج للقياس الكمي في المختبر تشكيل الصافية والتعبير citH3 داخل الخلايا في العَدلات الكلاب البوليسية. كما حرر العَدلات البروتينات الحبيبية مثل الخطة الرئيسية للعمليات جنبا إلى جنب مع كفدنا و citH3 في الفضاء خارج الخلية، صافي الكمي استناداً إلى الترجمة المشارك كفدنا، citH3، والخطة الرئيسية للعمليات أكثر تحديداً بالمقارنة إلى فحوصات أخرى مثل كفدنا أو نوكليوسوميس أو الحمض النووي-الخطة الرئيسية للعمليات المعقدة 14-نظراً لمحدودية عدد الأجسام المضادة التي كروسريكت مع البروتينات الكلاب، قمنا باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي تنشأ من نوع آخر (الأرنب). لمنع التقاط الأجسام الأولية بمواقع الربط الحرة المتبقية على الأجسام المضادة الثانوية في أي خطوة من عملية المصبوغة، نحن أولاً استخدمت المصل أرنب تليها unconjugated شظايا القوات المسلحة البوروندية تشبع مواقع الربط المجاني. خطوة حاسمة واحدة من هذا الإجراء هو ضمان الغسيل كافية لمنع ملزمة الزائدة المناعية، والقوات المسلحة البوروندية الشظايا التي قد تتداخل مع الكشف عن البروتين الثاني للفائدة. كما نوصي باختبار تخفيف مختلف الأجسام الأولية والثانوية للتقليل من الربط غير محدد والتدخلات. للتأكد من أن الأجسام المضادة الثانوية من أي خطوة إيمونولابيلينج بربط على وجه التحديد جسم الأولية، ينبغي أن تشمل المحققين 2 عناصر التحكم المختلفة التي تستبعد أي جسم الأولية في الخطوة الثانية إيمونولابيلينج. الملزمة الخاصة بعدم تحدث عندما يتم الكشف عن إشارات من الأجسام المضادة الثانوية على حد سواء.
هيستون سيترولينيشن أو ديمينيشن، تحفزها الإنزيم بيبتيديلارجينيني ديميناسي 4 (PAD4)، أمر ضروري في نيتسيس المرتبطة بالبكتيريا في الفئران والبشر15،16. باستخدام هذا الفحص، تمكنا من تحديد أن نيتسيس المستحثة بلبس في الكلاب يتطلب أيضا سيترولينيشن H3 هستون بلوح من13. لاختبار ما إذا كانت المنشطة لمصلحة يدفع نيتسيس بتنشيط PAD4، نوصي بإدراج عناصر إيجابية باستخدام المنشطات PAD4 المعروفة مثل سلطة النقد الفلسطينية أو إيونوفوري الكالسيوم، A2318717. إذا العَدلات تظهر سلبية تلطيخ ل citH3 في عينات مراقبة إيجابية، يجب تنقيح البروتوكول حتى تلطيخ إيجابية كافية هو نجم. نوصي أيضا بإدراج عناصر سلبية البيولوجية تتكون من العَدلات unstimulated أو تعامل مع مثبط لوحة، Cl-أميديني العَدلات.
يمكن أن يكون تحديا تحديد دقيق لهيكل شبكات متميزة باستخدام هذا الأسلوب. هذا يمكن أن يكون صعوبة خاصة في العينات مع نيتسيس واسعة النطاق، دمج الهياكل صافي صدر من العَدلات المتاخمة متعددة يمكن أن يؤدي إلى التقليل أحداث نيتوتيك. قد ترتبط نتائج هذا التحليل مع غيرها فحوصات أكثر موضوعية مثل التدفق الخلوي أو أليسا، الذي لم يصادق بعد للاستخدام في العَدلات الكلاب البوليسية. لتجنب تشكيل بنية صافية المتلاقية، أن بذور المحققين بتركيز أقل من الخلايا. بدلاً من ذلك، يمكن تجنب تقليل وقت الحضانة مجموع نيتسيس واسعة النطاق ودمج الهياكل الصافية. على الرغم من أن يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق نيتسيس في الأنواع الأخرى، استناداً إلى خبرة المؤلفين، يمكن أن تختلف استجابة العَدلات للبس أو سلطة النقد الفلسطينية إلى حد كبير فيما بين الأنواع.
اكتشاف شبكات في الكلاب يسلط الضوء على أن نيتوسيس إليه مصانة من الحصانة الفطرية خلال العدوى الميكروبية والمرض المناعي بوساطة. فحوصات المعروضة هنا يمكن أن يكون أداة قيمة لدراسة نيتسيس في الكلاب وغيرها من الأنواع. فهم أفضل نيتسيس الناجم عن الانتان ستيسر إجراء مزيد من البحوث في تطوير استراتيجيات علاجية مبتكرة للانتان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
صاحب المقابلة كانت تموله "مؤسسة الحيوان موريس" (D15CA-907). الدراسة تدعمها الأموال من جامعة كاليفورنيا، ديفيس، ومركز "الصحة الخيول" ومركز "الصحة الحيوانية رفيق" (2016-24-F). الكتاب يود أن ينوه نغ جينا لمساعدتها مع الأرقام ونهى نغوين لمساعدتها مع الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S.
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).
