Summary
Se describen métodos para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera y visualizar la formación neta en vivo neutrófilos mediante microscopía de fluorescencia. También se describe son protocolos para cuantificar la formación neta y citrulinado histona H3 (citH3) expresión usando microscopia de la inmunofluorescencia.
Abstract
En respuesta a la invasión de patógenos, neutrófilos liberan trampas extracelulares neutrófilos (redes), que son redes extracelulares de ADN con las histonas y proteínas antimicrobianas. Formación de red excesiva (NETosis) citH3 liberación durante la sepsis se asocia con múltiples disfunción del órgano y la mortalidad en ratones y seres humanos y sus implicaciones en los perros son desconocidos. Aquí, describimos una técnica para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera para la observación y cuantificación de NETosis. Plasma rico en leucocitos, generado por sedimentación de dextrano, se separa por medios de separación gradiente de densidad disponible comercialmente y granulocitos recolectaron para la cuenta y las pruebas de viabilidad de la célula. Para observar en tiempo real NETosis en vivo neutrófilos, florescente de la célula y la célula impermeant ácido nucleico fluorescente manchas se agregan a neutrófilos activados por lipopolisacárido (LPS) o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). Con el tiempo se observan cambios en la morfología nuclear y formación de red por microscopía de fluorescencia. In vitro NETosis se caracteriza por co-colocalization sin células ADN de (cfDNA), mieloperoxidasa (MPO) y citrulinado histona H3 (citH3) utilizando un protocolo modificado de immunolabelling doble. Cuantificar objetivamente la neta formación y expresión de citH3 utilizando microscopía de fluorescencia, redes y células citH3-positivas se cuantifican de manera cegada utilizando software disponible. Esta técnica es un análisis específico para evaluar la capacidad en vitro de los neutrófilos caninos a NETosis.
Introduction
Neutrófilos son de breve duración granulocitos responsables de la defensa inicial contra los patógenos invasores. Neutrófilos, reclutados en el sitio de la infección, eliminan microorganismos por fagocitosis, degranulación y generación de oxígeno reactivo (ROS) las especies1. En presencia de bacterias y endotoxinas, neutrófilos liberación neutrófilo extracelular trampas (redes), compuestas de cromatina extracelular decoración con las histonas y las proteínas granulares como elastasa y mieloperoxidasa (MPO)2. Aunque redes tienen propiedades antimicrobianas indispensables, cada vez mayor evidencia experimental y clínica sugiere que entusiasta formación neta durante la sepsis puede llevar a múltiples órgano disfunción y muerte3,4, 5 , 6.
Porque las redes pueden desempeñar un papel patofisiológico similar en perros, las intervenciones terapéuticas que prevengan o disminuyen la formación de la red pueden servir como estrategias de tratamiento novedosas en animales sépticos. Por esta razón, hay una necesidad de una técnica confiable evaluar y cuantificar NETosis y componentes netos en perros. Componentes netos como nucleosomas ADN libre de células (cfDNA) han sido evaluados previamente en neutrófilos caninos y plasma de perros clínica7,8,9. Usando análisis de fluorescencia, Goggs y Letendre encontraron que perros sépticos tienen niveles más altos de cfDNA de perros sanos8. Aunque estas técnicas son altamente objetiva y cuantitativa, medición de la cfDNA y nucleosomas como marcadores de la NETosis no es específica ya que pueden derivar de células necróticas que no sean de NETosing neutrófilos. Aquí describimos una técnica que utiliza la microscopía de fluorescencia para examinar los comportamientos de los neutrófilos NETosing vivo. También detallamos un protocolo modificado usando doble inmunomarcación para cuantificar subjetivamente las redes y sus componentes como la MPO y citH3 en neutrófilos caninos10.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el institucional Animal cuidado y uso de la Universidad de California, Davis (protocolo número: 18338).
1. sangre
- Extraer 10 mL de sangre desde la vena cefálica o yugular utilizando una aguja de 21 G por la aspiración de la jeringa.
- Para evitar excesiva tensión de esquileo, retire la aguja de la jeringa antes de transferir la sangre en tubos con heparina sódica (USP 75). Invertir suavemente los tubos varias veces para asegurar una mezcla adecuada de anticoagulante y sangre. Busque evidencia de coágulos o agregados de glóbulos rojos antes de colocar las muestras en hielo.
2. neutrófilo aislamiento
- Diluir la sangre con anticoagulante con un volumen igual de solución salina helada de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) (pH 7.4, sin cationes divalentes). Transferencia de 8 mL de sangre diluida en un tubo cónico de 50 mL polipropileno, que contiene 25 mL de dextrano de 3% (de Leuconostoc spp. disuelto en la solución de cloruro de sodio 0.9%). Coloque el tubo verticalmente en temperatura ambiente durante 30 min permitir la agregación y sedimentación de los eritrocitos.
- Capa con cuidado 5 mL de plasma rico en leucocitos (figura 1) en la parte superior 5 mL de medio gradiente de densidad en un tubo de fondo redondo polipropileno 14 mL. Tenga cuidado de no mezclar los 2 soluciones11.
- Centrifugar los tubos a 400 x g con aceleración/desaceleración (A/D) set a 0 (sin freno) durante 30 min a temperatura ambiente.
- Utilizando 5 mL pipeta serológica recoge la capa de células granulocitos puenteando el plasma y capas de células mononucleares (PBMC) de sangre periférica (figura 1). Utilizar una pipeta nueva cada vez para minimizar la contaminación.
- Lugar 4 a 6 mL de la capa de células polymorphnuclear (PMN) en un tubo cónico de polipropileno 50 mL. Puesto que una pequeña cantidad de agregados de eritrocitos puede ser aspirada junto con la capa PMN, utilizar una pipeta serológica de 1 mL para eliminar suavemente los agregados de eritrocitos que se colocan en la parte inferior del tubo.
- Lisar los eritrocitos restantes con 20 mL de agua ultrapura fría. Invierta suavemente el tubo varias veces para 30 a 60 s para lisis adecuado antes de agregar un volumen igual de solución de cloruro de sodio 1,8% helada.
- Centrifugue a 112 x g durante 10 min a 4 ° C, sistema de A/D 0.
- Repita el paso de lisis de eritrocitos si aparece roja esta pelotilla. Descartar el sobrenadante con una pipeta serológica y suavemente Resuspender el precipitado en 100 μl de DPBS (dextrosa de 5 mM, 0,9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 y albúmina de suero bovino 1%, pH 7.3). Combinar todas las celdas resuspendidas y coloque en hielo.
- Realizar un recuento de células usando un analizador automatizado de la célula y verificar la cuenta por un hemocitómetro. Si es necesario, PMNs se concentran sobre un portaobjetos de vidrio con una Citocentrifuga (1.000 rpm, 5 min) y determinar el porcentaje de neutrófilos contando el número de neutrófilos en el número total de células.
- Determinar la viabilidad de los neutrófilos mediante la realización de una prueba de exclusión del azul tripán señalados por Strober et al. 12 aislamiento exitoso debe generar una viabilidad del 95 al 100% y neutrófilos deben ser mayores a 95%.
- Determinar la concentración de neutrófilos multiplicando el recuento celular total y la viabilidad porcentaje porcentajes neutrófilos. Aislamiento exitoso debe generar una concentración de neutrófilos de 1,5 a 6 x 106/ml.
- Diluir neutrófilos a una concentración final de 1 x 106/ml con DPBS que contiene dextrosa 5 mM, 0,9 mM MgCl2, 1,9 mM de CaCl2y seroalbúmina bovina al 1% con pH ajustado a 7.3.
3. fluorescente microscopia de neutrófilos energizados
- Chapa de 12 bien cultura con lugar 200 a 400 μL de neutrófilos (1 x 106/ml) en cada pocillo de una poli-L-lisina. Permiten neutrófilos a adherirse al fondo de los pozos por incubación de las células a 37 ° C durante 30 minutos.
- Etiqueta de ácidos nucleicos con 1 μM de uno de los dos tintes de ácido nucleico, que las manchas en las células con las membranas intactas y que las manchas en las células con membranas permeables (véase Tabla de materiales), por 10 min a temperatura ambiente.
- Activar neutrófilos con lipopolisacárido μg/mL 100 (LPS) (e. coli O55. B5), 100 nM forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) como control positivo, o un volumen equivalente de DPBS como control negativo de 180 min a 37 ° C.
- Adquisición de imágenes con la GFP (excitación: 470/22 nm, emisión: 525/50 nm) y Texas Red canales (excitación: 585/29 nm, emisión: 628/32 nm) en una microscopía de fluorescencia a 40 aumentos en los siguientes puntos de tiempo: 30, 90, 120 y 180 min.
4. red de cuantificación y detección de componentes netos mediante inmunofluorescencia
- Coloque con cuidado el cubreobjetos de 18 mm de diámetro revestido Poly-D-lisina en los pocillos de una placa de cultivo de 12 pozos. Etiquetar adecuadamente los pozos.
- Semilla 100 a 200 μL de aislados neutrófilos (1 x 106/ml) directamente sobre el cubreobjetos y deje neutrófilos a adherirse al cubreobjetos por incubación de las células a 37 ° C durante 30 minutos.
- Activar neutrófilos, como se describe en 3.3. Inhibir la formación de la red por pretratamiento de neutrófilos con 200 µΜ Cl-Amidina (15 min, 37 º C) antes de su activación, como se ha descrito por Li et al. 13 asegurar que el control de vehículo apropiado (DMSO) se incluye en el experimento.
- Remueva cuidadosamente el cubreobjetos con pinzas finas. Capa de una hoja de película de parafina sobre un soporte de tubo de ensayo para crear pozos poco profundos y 2 ó 3 gotas 4% PFA en cada pozo10. Etiquetar adecuadamente los pozos y Coloque suavemente el cubreobjetos boca abajo en los pozos llenos de PFA. Permitir que las células para ser fijado a temperatura ambiente durante 20 minutos.
- Lavar las células 3 veces de DPBS durante 5 minutos, moviéndolos de un pozo a otro.
- Si immunolabelling no puede realizarse poco después de la fijación y activación de neutrófila, permiten cubreobjetos ser secado colocando el cubreobjetos hacia arriba en un trozo de papel de absorbancia. Cubreobjetos pueden conservarse hasta 1 semana boca arriba en una placa con 12 pozos cultura a 4 ° C hasta su análisis posterior. Lavar las células 3 veces de DPBS durante 1 min, utilizando la misma técnica como se describe en 4.4 antes de proceder al siguiente paso.
- Para permeabilizar las células, Coloque suavemente el cubreobjetos boca abajo sobre una caída de 1% NP-40 para 1 min, utilizando la técnica descrita en 4.4. Lavar 3 veces de DPBS durante 1 min en un eje de balancín.
- Al azar asignar cada muestra a un número y utilice un marcador de punto de diamantes para etiquetar el cubreobjetos por consiguiente.
- Preparar y etiqueta de Petri individuales alineados con la película de parafina y 100 a 200 μL de 5% de suero de cabra en la película (tampón de bloqueo). Coloque el cubreobjetos boca abajo sobre el amortiguador de bloqueo. Colocar en un eje de balancín e incubar 1 h a 37 ° C.
- Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín.
- Diluir el anticuerpo primario (las histonas 1: 400 conejo policlonales anti-citrulinada H3 (citH3) en 5% de suero de cabra). Incubar las células en placas Petri marcada con película de parafina. Ponen boca abajo cada cubreobjetos en 50 a 100 μL de la solución de anticuerpo diluido. Colocar en un eje de balancín e incubar 1 h a 37° C.
- Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín.
- Diluida de anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo (1: 200) en el suero de cabra 5%. Incubar las células en placas Petri marcada con película de parafina. Ponen boca abajo cada cubreobjetos en 50 a 100 μL de la solución de anticuerpo diluido. Colocar en un eje de balancín e incubar 1 h a 37 ° C en la oscuridad.
- Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín en la oscuridad.
- Para la detección simultánea de mieloperoxidasa (MPO) seguir los siguientes pasos para un protocolo modificado doble inmunomarcación descrito por Li et al. 13
- Incubar las células en placas Petri marcada con película de parafina. Coloque cada cubreobjetos boca abajo sobre 100 a 200 μL de 10% conejo suero bajo suave balanceo (durante la noche, 4 ° C, en la oscuridad).
- Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín en la oscuridad.
- Incubar las células en cabra no conjugada de 50 μg/mL contra conejo Fab fragmentos por 2 h a temperatura ambiente en un eje de balancín en la oscuridad.
- Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín en la oscuridad.
- Diluir el anticuerpo primario (1: 200 conejo policlonales anti-humano MPO anticuerpo) en suero de cabra 5%. Incubar las células en placas Petri marcada con película de parafina. Ponen boca abajo cada cubreobjetos en 50 a 100 μL de la solución de anticuerpo diluido. Colocar en un eje de balancín e incubar 1 h a 37° C en la oscuridad.
- Diluir el anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo en 5% de suero de cabra e incubar como se indica en 4.8
- Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín en la oscuridad.
- Controles de interferencia deben elaborarse mediante la exclusión de incubación con cualquiera de los dos anticuerpos primarios en el segundo paso etiquetado inmune.
- ADN de la mancha con 300 nM de 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, diclorhidrato (DAPI) por 5 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Lavar 3 veces de DPBS durante 1 min en un eje de balancín en la oscuridad.
- Aplique una gota (50 μl) de antifade mountant sobre un portaobjetos de vidrio. Golpee suavemente el borde del cubreobjetos sobre un papel absorbente para eliminar el exceso de tampón antes de colocar el cubreobjetos con las células boca abajo. El medio de montaje debe formar una capa delgada entre el cubreobjetos y el portaobjetos de cristal. Para quitar las burbujas de aire, presione muy suavemente sobre el cubreobjetos con pinzas finas.
- Muestras curar durante la noche en la oscuridad a 4 ° C. El medio de montaje debe endurecerse para el análisis microscópico con lentes de inmersión. Almacenar las muestras en 4 ° C en la oscuridad.
5. neutrófilo trampa extracelular cuantificación
- Ciega a los operadores adquirir y analizar las imágenes de microscopio para las condiciones experimentales.
- Usando un microscopio de fluorescencia a 40 aumentos, tomar 10 imágenes al azar de diferentes regiones de cada cubreobjetos en un experimento bajo los respectivos canales. Asegúrese de que el tiempo de exposición, brillo y contraste de cada canal se mantienen constantes a lo largo de la adquisición de imágenes.
- Analizar las imágenes utilizando el software disponible como ImageJ (NIH). Identificar redes basadas en la localización de cfDNA, citH3 y MPO (Figura 3A, B). Cuantificar el número de neutrófilos en 10 campos al azar para cada condición experimental y redes. Números de redes publicado puede expresarse como un cociente (número de redes: número total de neutrófilos) para cada condición experimental.
- Para evaluar los efectos del tratamiento sobre la expresión de citH3 intracelular, contar el número de neutrófilos con citH3 intracelular y el número de neutrófilos sin citH3 intracelular en 10 campos al azar en 40 aumentos bajo los respectivos canales ( Figura 3, flechas rojas). Expresión intracelular de la citH3 se puede expresar como el cociente del número de neutrófilos con citH3 intracelular para el número de neutrófilos sin citH3 intracelular.
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Representative Results
Utilizando este protocolo de imágenes de células vivas, los investigadores pueden observar la morfología nuclear, la integridad de la membrana plasmática y la presencia de cfDNA en neutrófilos de vida. Un colorante nuclear impermeant celular tiñe ácidos núcleos rojo en células con membranas celulares dañadas. Otro tinte celular-permeant, etiquetas de los ácidos nucleicos intracelulares en células vivas con membranas intactas de plasma. Los neutrófilos intactas, independientemente de sus tratamientos, deben aparecen verdes y exhiben los característica núcleos lobulados en 0 a 30 minutos después del estímulo (figura 2A). Núcleos de los neutrófilos tratados con PMA comienzan a perder su apariencia lobulada por alrededor de 60 min y continuar a decondense hasta el lanzamiento de cfDNA (figura 2B). LPS, un estimulante más lento y más fisiológico de neutrófilos caninos, por lo general no lleva a decondensation de la cromatina o NETosis hasta 90 min después del estímulo (figura 2B). Por 120 min, neutrófilos activados por LPS y PMA pueden verse rodeado de cfDNA. En comparación con LPS, neutrófilos más-PMA activado pierden su integridad de membrana plasmática se tiñen de rojo por el tinte impermeant celular (figura 2). Sin estimular neutrófilos (DPBS control) deben mantener núcleos lobulados y membrana intacta durante todo el período de incubación (figura 2A-C).
NET componentes de cfDNA, citH3 y gránulos MPO se detectan utilizando el protocolo de doble inmunomarcación. Lanzamiento de redes, identificado basado en la localización de cfDNA, citH3 y MPO, en respuesta a LPS y PMA se muestran en la Figura 3A y 3B, respectivamente. Neutrófilos estimulados por LPS durante 180 minutos producen discretos como andamios de redes en proximidad cercana a neutrófilos cercanas (Figura 3A). Por el contrario, neutrófilos activados PMA producen grandes cantidades de redes que eran perceptiblemente más grandes en área (figura 3B, D). Citrullination de histonas H3, catalizada por la enzima peptidylarginine deiminase (PAD), es un sello de NETosis. PMA, un potente estimulante de la almohadilla, se traduce en un mayor número de células que expresan citH3 intracelular, en comparación con los neutrófilos sin estimular y estimulados por LPS (figura 3E).
Figura 1: un diagrama que demuestra los pasos de aislamiento neutrófilo canino. Diluida sangre entera heparinizada se mezcla primero con 3% de dextrano para sedimentación de glóbulos rojos (RBC). Plasma rico en leucocitos es recogido y capas en volúmenes iguales de los medios de separación gradiente de densidad disponible comercialmente. Tras centrifugación (400 x g, 30 min), la capa de RBC-granulocitos se extrae y se eliminan los hematíes restantes por lisis hipotónica. Después de la adición de 1,8% NaCl, granulocitos son girar hacia abajo (112 x g, 5 min) y se resuspendió en buffer dedicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imágenes fluorescentes representativas de neutrófilos caninos vivo. Neutrófilos aislados fueron activados con LPS μg/mL 100, 100 nM PMA o equivalente volumen de Dulbecco tamponada con fosfato solución salina (DPBS) como control negativo para un total de 180 minutos los ácidos nucleicos en vivo intactos neutrófilos estaban teñidos de verde con el uso de un celular-permeant colorante mientras que cfDNA y neutrófilos con compromiso de las membranas celulares se tiñeron de rojo con un tinte impermeant celular. (A, D) Todos tratados con DPBS y LPS de neutrófilos mantuvieron una membrana celular intacta con núcleos lobulados (asterisco). (A, E) Los núcleos de los neutrófilos activados PMA comenzaron a experimentar la decondensation (flecha). (B, F) Por 90 min, más núcleos en los neutrófilos activados por LPS o PMA habían perdido su aspecto lobulado (flecha azul). (C) después de 120 minutos, los neutrófilos activados PMA tenían membranas permeables de plasma rodeadas por cfDNA mientras que cfDNA se podía ver alrededor de un pequeño número de neutrófilos activados por LPS (flechas). Sin estimular los neutrófilos no produjo cfDNA ni han comprometido la membrana de la célula en cualquier momento (A-C). (A-B) Original 40 X aumentos. Barra de escala = 100 μm. (D-F) 80 aumentos. Barra de escala = 30 μm. experimento fue replicado dos veces de neutrófilos aislados de 3 diferentes donantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: red formación. (A-C) Imágenes representativas inmunofluorescentes en vitro red formación. Neutrófilos aislados de un solo donante se fijaron, permeabilized y teñidos para DNA (azul), mieloperoxidasa (MPO, verde) y citrulinado histona H3 (citH3 rojo) después de la estimulación con LPS de (A) 100 μg/mL, (B) 100 nM PMA o (C) DPBS 180 min redes, identificadas por co-localización de MPO, cfDNA y citH3, son contorneadas (líneas punteadas) sobre (A) LPS y neutrófilos (B) activada por PMA. Ejemplos de expresión intracelular de citH3 están indicados por flechas rojas. (C) No redes ni citH3 intracelular se observan neutrófilos sin estimular. Barra de escala = 100 μm. (D, E) representante de caja y bigotes parcelas de neta formación y expresión de citH3 intracelular en neutrófilos aislados de 4 perros. El cuadro se extiende desde el 25th hasta 75 percentiles deth y bigotes abarcan desde el más pequeño al más grande valor. LPS y el PMA estímulo dio lugar a significativo (D) red formación y expresión de citH3 intracelular (E) en comparación con los neutrófilos sin estimular. + significa que representa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Presentamos aquí un protocolo para observar los cambios en núcleos conformación y cfDNA comunicado en vida canina neutrófilos utilizando un colorante florescente de la célula y un tinte impermeant del celular. La principal ventaja de este ensayo es que permite para la detección en tiempo real de formación red por microscopía de alta resolución en vivo neutrófilos sin fijación de la célula, por lo tanto, proporciona una herramienta sencilla y valiosa para la observación en vitro de neta formación. Puesto que este ensayo no requiere de anticuerpos para la detección de componentes de red, es ideal para estudiar la NETosis en especies con limitada disponibilidad de anticuerpos específicos. Usando este análisis, los autores demostraron que neutrófilos caninos someterse a decondensation de la cromatina en LPS o PMA estimulación antes NETosis13. Un gran inconveniente de esta técnica es que no es específico para la NETosis. Porque el tinte impermeant celular también manchas de ácidos nucleicos en células necróticas o ácidos nucleicos de neutrófilos sometidas a lisis, cfDNA o celular células impermeant positivo podrían interpretarse falsamente como neutrófilos redes o NETosing. Alternativamente, se puede aumentar la especificidad de la NETosis incluyendo neutrófilos activados PMA o LPS que son pretratados con el inhibidor de 4, Cl-AMIDINO. Aquí demostramos la importancia de garantizar la esterilidad y manejo adecuado de los neutrófilos durante el proceso de aislamiento como contaminación y fuerzas pura pueden conducir a necrosis en vitro y lisis de la célula. También se recomienda cumplir con las temperaturas adecuadas a través de los protocolos y prevención prolongada (> 1 min) lisis hipotónica. Para confirmar la viabilidad de las horas extraordinarias de neutrófilos aislados, se recomienda una prueba de exclusión azul de tripano, así como un control negativo de neutrófilos sin estimular.
Porque no es específico para NETosis cfDNA detectado por colorantes ácidos nucleicos celulares impermeables, hemos desarrollado un protocolo de doble inmunomarcación para cuantificar en vitro de neta formación y expresión de citH3 intracelular en neutrófilos caninos. Como neutrófilos liberan proteínas granulares como MPO junto con cfDNA y citH3 en el espacio extracelular, neta cuantificación basada en la localización de cfDNA, citH3 y MPO es más específica en comparación con otros ensayos como cfDNA, nucleosomas o complejo ADN-MPO 14. debido a la limitada disponibilidad de los anticuerpos que cruz-reaccionan con las proteínas caninas, utilizamos anticuerpos primarios que se originan de otra especie (conejo). Para evitar la captura de anticuerpos primarios por sitios de unión libre residual en los anticuerpos secundarios en cada paso del proceso de tinción, primero utilizamos suero de conejo, seguido de fragmentos Fab no conjugadas para saturar los sitios de unión libre. Un paso crítico de este procedimiento es adecuado lavarse para evitar atascamiento exceso de inmunoglobulinas y fragmentos Fab que pueden interferir con la detección de la segunda proteína de interés. También se recomienda probar diferentes diluciones de los anticuerpos primarios y secundarios para minimizar interferencias y el atascamiento no específico. Para asegurarse de que los anticuerpos secundarios de cualquier paso de immunolabelling se une específicamente a su anticuerpo primario, los investigadores deben incluir 2 controles diferentes que excluyen cualquier anticuerpo primario en el segundo paso de immunolabelling. Unión no específica ocurre cuando se detectan las señales de ambos anticuerpos secundarios.
Histona citrullination o desaminación, catalizada por la enzima peptidylarginine deminase 4 (4), es esencial en la NETosis bacterias asociadas en ratones y seres humanos15,16. Usando este análisis, hemos podido determinar que NETosis inducida por LPS en perros requiere también una histona H3 citrullination PAD13. Para probar si el estimulante de interés induce NETosis por activación 4, recomendamos la inclusión de controles positivos utilizando activadores conocidos de 4 PMA como el ionóforo de calcio, A2318717. Si los neutrófilos muestran negativos para citH3 en las muestras de control positivo, el protocolo debe ser revisado hasta que una suficiente coloración positiva es resultada. También recomendamos la inclusión de controles negativos biológicos consisten en neutrófilos sin estimular o neutrófilos tratados con el inhibidor de la almohadilla, Cl Amidina.
La identificación precisa de la estructura de redes distinta puede ser difícil utilizar esta técnica. Esto puede ser particularmente difícil en las muestras con NETosis extensa, como la fusión de las estructuras de red de múltiples adyacentes neutrófilos puede llevar a la subestimación de eventos NETotic. Resultados de este ensayo pueden ser correlacionados con otros ensayos más objetivas como citometría de flujo o ELISA, que no han sido validados para su uso en neutrófilos caninos. Para evitar la formación de estructura neta confluente, los investigadores pueden sembrar una menor concentración de células. Alternativamente, disminuir el tiempo de incubación total puede evitar extenso NETosis y fusión de las estructuras de red. Aunque este protocolo se puede utilizar para investigar NETosis en otras especies, basados en la experiencia de los autores, neutrófilo respuesta a LPS o PMA puede variar grandemente entre especies.
El descubrimiento de redes en perros destaca que NETosis un mecanismo conservado de la inmunidad innata durante la infección microbiana y enfermedad inmune-mediada. El análisis presentados aquí pueden ser una herramienta valiosa para el estudio de la NETosis en perros y otras especies. Una mejor comprensión de la NETosis inducida por la sepsis facilitará la investigación adicional en el desarrollo de estrategias del novedoso tratamiento para sepsis.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El autor fue financiado por la Morris Animal Foundation (D15CA-907). El estudio fue apoyado por fondos de la Universidad de California, Davis, centro de salud equina y centro de salud de animales de compañía (2016-24-F). Los autores desean reconocer Geena Ng su asistencia con las figuras y Nghi Nguyen para su ayuda con el video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
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