Summary
We beschrijven de methoden om te isoleren canine neutrofielen van volbloed en visualiseren van netto vorming in levende neutrofiele granulocyten met behulp van fluorescentie microscopie. Ook beschreven zijn protocollen te kwantificeren netto vorming en citrullinated Histon H3 (citH3)-expressie met immunofluorescentie microscopie.
Abstract
In reactie op de invasie ziekteverwekkers, vrijgeven neutrofielen neutrofiele extracellulaire vallen (netten), die de extracellulaire van DNA versierd met histonen en antimicrobiële eiwitten netwerken. Buitensporige netto vorming (NETosis) en citH3 release tijdens sepsis is gekoppeld aan meerdere orgaanstoornis en sterfte bij muizen en mensen, maar de implicaties ervan bij honden zijn onbekend. Hierin beschrijven we een techniek om te isoleren canine neutrofielen van volbloed voor observatie en kwantificering van NETosis. Leukocyten-rich plasma, gegenereerd door dextran sedimentatie, wordt gescheiden door verkrijgbare dichtheid verlopende scheiding media en granulocyten verzameld voor cel tellen en levensvatbaarheid testen. Om te zien hoe de realtime NETosis in levende neutrofielen, worden cel permeant en cel impermeant fluorescerende nucleïnezuur vlekken toegevoegd aan de neutrofielen geactiveerd door lipopolysaccharide (LPS) of phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA). Veranderingen in nucleaire morfologie en netto vorming worden waargenomen na verloop van tijd door fluorescentie microscopie. In vitro NETosis wordt verder gekenmerkt door co-colocalization van cel-gratis DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) en citrullinated Histon H3 (citH3) met behulp van een gemodificeerde dubbel-immunolabelling-protocol. Om objectief te kwantificeren netto vorming en citH3 expressie met behulp van fluorescentie microscopie, netten en citH3-positieve cellen worden gekwantificeerd in een geblindeerde wijze met behulp van beschikbare software. Deze techniek is een specifieke bepaling voor de evaluatie van de capaciteit in vitro van canine neutrofielen NETosis ondergaan.
Introduction
Neutrofielen zijn kortstondige granulocyten die verantwoordelijk is voor de eerste verdediging tegen invasie ziekteverwekkers. Neutrofiele granulocyten, gerekruteerd om de plaats van de infectie, elimineren micro-organismen door fagocytose, degranulatie en generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS)1. In aanwezigheid van bacteriën en endotoxines versierd neutrofielen release neutrofiele extracellulaire vallen (netten), samengesteld uit extracellulaire chromatine met histonen en korrelig eiwitten zoals elastase en myeloperoxidase (MPO)2. Netten weliswaar onmisbaar antimicrobiële eigenschappen, suggereert verhoging van experimentele en klinisch bewijs dat overijverige netto formatie tijdens sepsis tot meerdere orgel dysfunctie en dood3,4, leiden kan 5 , 6.
Omdat netten een soortgelijke pathofysiologische rol bij honden spelen kunnen, kunnen therapeutische ingrepen die ofwel voorkomen of verminderen van netto vorming dienen als roman behandelingsstrategieën in septische dieren. Om deze reden is er een behoefte aan een betrouwbare techniek voor het beoordelen en kwantificeren van NETosis en netto onderdelen bij honden. NETTO componenten zoals cel-gratis DNA (cfDNA) en nucleosomes zijn eerder geëvalueerd in canine neutrofielen en plasma van klinische honden7,8,9. Met behulp van fluorescentie testen, Goggs en Letendre gevonden dat septische honden hogere niveaus van cfDNA dan gezonde honden8 hebben. Hoewel deze technieken zeer objectieve en kwantitatieve zijn, is meting van cfDNA en nucleosomes als markeringen van NETosis niet-specifieke aangezien zij necrotische cellen dan NETosing neutrofiele granulocyten kunnen worden ontleend. Hier beschrijven we een techniek die gebruik maakt van fluorescentie microscopie te onderzoeken van de gedragingen van de neutrofiele granulocyten live NETosing. We detail ook een gewijzigde protocol, met behulp van dubbel-immunolabeling te subjectief kwantificeren netten en hun onderdelen zoals MPO en citH3 in canine neutrofielen10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité aan de Universiteit van Californië, Davis (protocol nummer: 18338).
1. de bloedinzameling
- Trekken 10 mL bloed ofwel de cephalic of jugular ader met behulp van een naald 21 G door spuit aspiratie.
- Om te voorkomen dat buitensporige schuifspanning, verwijder de naald van de spuit vóór de overbrenging van bloed in de sproeibuis(-buizen) met Natrium heparine (75 USP). Voorzichtig omkeren de buizen een paar keer om ervoor te zorgen dat voldoende mengen van antistollingsmiddel en bloed. Bewijs van stolsels of rode cel aggregaten controleren voordat het plaatsen van de monsters op ijs.
2. neutrofiele isolatie
- Verdun vertonen bloed met een gelijk volume ijskoude Dubecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) (pH 7.4, zonder divalente kationen). Pipetteer 8 mL verdunde bloed in een 50 mL polypropyleen conische buis met 25 mL van 3% dextran (vanaf Leuconostoc spp. opgelost in 0,9% natriumchlorideoplossing). Plaats de buis rechtop bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten dat aggregatie en sedimentatie van erytrocyten.
- Zorgvuldig laag 5 mL leukocyte-rich plasma (Figuur 1) op de top van 5 mL van de kleurovergang media dichtheid in een polypropyleen ronde-onderkant-buis van 14 mL. Wees voorzichtig niet te mengen van de 2 oplossingen11.
- Centrifugeer de buizen bij 400 x g met versnelling/vertraging (A/D) zijn ingesteld op 0 (geen rem) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Serologische Pipetteer met behulp van een 5 mL en verzamelen de cellaag granulocyt door het omzeilen van het plasma en de perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) lagen (Figuur 1). Gebruik een nieuwe Pipetteer telkens om te minimaliseren van verontreiniging.
- Plaats 4 tot en met 6 mL van de cellaag van de polymorphnuclear (PMN) in een polypropyleen conische tube van 50 mL. Omdat een kleine hoeveelheid erytrocyt aggregaten kan worden aanzuiging samen met de laag PMN, kunt een serologische 1 mL-pipet zachtjes verwijderen de erytrocyt aggregaten die aan de onderkant van de buis worden afgewikkeld.
- Lyse de resterende erythrocyten met 20 mL koud ultrazuiver water. Voorzichtig omkeren de buis meerdere keren voor 30 tot 60 s om te zorgen voor voldoende lysing alvorens toe te voegen een gelijk volume van ijskoude 1.8% natriumchloride-oplossing.
- Centrifugeer bij 112 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, A/D ingesteld op 0.
- Herhaal de erytrocyt lysis stap als deze pellet wordt rood weergegeven. Verwijder het supernatant zorgvuldig met een serologische Pipetteer en zachtjes resuspendeer de pellet in 100 µL van DPBS (5 mM dextrose, 0,9 mM MgCl2, 1.9 mM CaCl2 en 1% bovien serumalbumine, pH 7.3). Alle geresuspendeerde cellen combineren en plaats op ijs.
- Uitvoeren van een telling van de cel met behulp van een geautomatiseerde cel analyzer en bevestig de graaf door een hemocytometer. Indien nodig, PMNs concentreren op een glasplaatje met behulp van een cytocentrifuge (1000 rpm, 5 min) en het percentage van de neutrofielen bepalen door het aantal neutrofielen uit het totale aantal cellen te tellen.
- Bepalen van de levensvatbaarheid van de neutrofielen door een trypan blauw uitsluiting test uit te voeren zoals beschreven door Strober et al. 12 succesvolle isolatie moet een levensvatbaarheid van 95 tot 100% opleveren en neutrofielen groter moeten zijn dan 95%.
- Bepaal de concentratie van neutrofielen de cel totaal telling wordt vermenigvuldigd met de procentuele levensvatbaarheid en percentage neutrofiele granulocyten. Succesvolle isolatie moet toegeven een concentratie van neutrofielen 1.5 aan 6 x 106/mL.
- Neutrofielen naar een eindconcentratie van 1 x 106/mL met DPBS met 5 mM dextrose, 0,9 mM MgCl21.9 mM CaCl2en 1% bovien serumalbumine met pH aangepast aan 7.3 verdund.
3. fluorescent microscopie van levende neutrofiele granulocyten
- Plaats 200 tot 400 μL van neutrofiele granulocyten (1 x 106/mL) in elk putje van een poly-L-lysine gecoat 12-well cultuur plaat. Het toestaan van neutrofielen vast te houden aan de onderkant van de putten door de cellen bij 37 ° C gedurende 30 minuten aan het broeden.
- Label nucleic zuren met 1 μM één van de twee kleurstoffen van de nucleïnezuur, die in cellen met intact membranen vlekken en één die in cellen met een permeabele membraan vlekken (Zie Tabel of Materials), gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Activeren van neutrofiele granulocyten met 100 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) (E. coli O55. B5), 100 nM phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) als positieve controle of gelijkwaardige hoeveelheid DPBS als negatieve controle voor 180 min bij 37 ° C.
- Verwerven van beelden met behulp van het GFP (excitatie: 470/22 nm, emissie: 525/50 nm) en Texas Red kanalen (excitatie: 585/29 nm, emissie: 628/32 nm) op een fluorescentie microscopie bij 40 X vergroting op de volgende tijdstippen: 30, 90, 120 en 180 min.
4. netto kwantificering en opsporing van netto onderdelen met behulp van immunofluorescentie
- Zorgvuldig plaats 18 mm diameter Poly-D-lysine gecoat cover slips in de putjes van de plaat van een 12-well cultuur. Label de putjes op de juiste manier.
- Zaad 100 tot 200 μL van neutrofiele granulocyten (1 x 106/mL) direct op de coverslips geïsoleerd en toestaan van neutrofielen vast te houden aan de hoes glijdt door het broeden van de cellen bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Activeren neutrofielen zoals beschreven in punt 3.3. NETTO vorming afremmen door de voorbehandeling van neutrofiele granulocyten met 200 µΜ Cl-amidine (15 min, 37 ° C) vóór activering zoals eerder beschreven door Li et al. 13 zorg ervoor dat het juiste voertuig besturingselement (DMSO) is opgenomen in het experiment.
- Verwijder voorzichtig cover slips met een fijne Tang. Een blad van paraffine film over een reageerbuis stand maken van ondiepe putten en plaats 2 tot 3 druppels van 4% in lagen PFA in elke goed10. Label de putjes op de juiste manier en de cover glijdt zachtjes ondersteboven te leggen op de PFA gevulde putten. Toestaan dat cellen vast te stellen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- De cellen in DPBS voor 5 minuten, 3 keer wassen door ze uit een put te verplaatsen naar de volgende.
- Als immunolabelling kan niet worden uitgevoerd kort na neutrofiele activering en fixatie, toestaan cover slips als lucht gedroogd door het plaatsen van de cover slips gezicht-up op een stuk papier van absorptie. Cover slips kunnen maximaal 1 week gezicht-omhoog in een gelabelde 12-well cultuur plaat bij 4 ° C tot verdere analyse worden opgeslagen. Wassen van de cellen 3 keer in DPBS voor 1 min met gebruikmaking van dezelfde techniek, zoals beschreven in 4.4 voordat u verdergaat met de volgende stap.
- Als u wilt permeabilize cellen, zachtjes Leg de cover slip ondersteboven op een daling van 1% NP-40 voor 1 min met behulp van de techniek in 4.4 beschreven. 3 keer wassen in DPBS voor 1 min op een rocker.
- Willekeurig toewijzen van elk monster aan een nummer en gebruik een diamant punt marker op het etiket van de coverslips dienovereenkomstig.
- Bereiden en label individuele petrischalen bekleed met paraffine film en plaatsen van 100 tot 200 μL van 5% geit serum op de film (blokkeerbuffer). Leg de coverslips ondersteboven op de buffer met blokkerend. Plaats op een rocker en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- 3 keer wassen in DPBS voor 5 min op een rocker.
- Verdun het primaire antilichaam (1:400 konijn polyklonale anti-citrullinated Histon H3 (citH3) in 5% geit serum). Incubeer de cellen in gelabelde petrischalen bekleed met paraffine film. Leg elk cover-slip ondersteboven op 50 tot 100 μl van de verdunde antilichaam-oplossing. Plaats op een rocker en incubeer gedurende 1 uur bij 37° C.
- 3 keer wassen in DPBS voor 5 min op een rocker.
- Verdunde secundair antilichaam geconjugeerd met een fluorophore (1:200) in serum van 5% geit. Incubeer de cellen in gelabelde petrischalen bekleed met paraffine film. Leg elk cover-slip ondersteboven op 50 tot 100 μl van de verdunde antilichaam-oplossing. Plaats op een rocker en Incubeer 1 uur bij 37 ° C in het donker.
- 3 keer wassen in DPBS voor 5 min op een rocker in het donker.
- Volg de volgende stappen voor een gemodificeerde dubbele immunolabeling-protocol, zoals beschreven door Li et al. voor gelijktijdige opsporing van myeloperoxidase (MPO) 13
- Incubeer de cellen in gelabelde petrischalen bekleed met paraffine film. Leg elk cover-slip ondersteboven op 100-200 μl van 10% konijn serum onder zachte wiegen (overnachting, 4 ° C, in het donker).
- 3 keer wassen in DPBS voor 5 min op een rocker in het donker.
- Incubeer de cellen bij 50 μg/mL-unconjugated geit, anti-konijn Fab fragmenten gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een rocker in het donker.
- 3 keer wassen in DPBS voor 5 min op een rocker in het donker.
- Verdun primair antilichaam (1:200 konijn polyclonal anti-menselijke MPO antilichaam) in 5% geit serum. Incubeer de cellen in gelabelde petrischalen bekleed met paraffine film. Leg elk cover-slip ondersteboven op 50 tot 100 μl van de verdunde antilichaam-oplossing. Plaats op een rocker en Incubeer 1 uur bij 37° C in het donker.
- Verdun secundair antilichaam geconjugeerd met een fluorophore in 5% geit serum en incubeer zoals beschreven in 4.8
- 3 keer wassen in DPBS voor 5 min op een rocker in het donker.
- Interferentie controles moeten worden opgesteld door met uitzondering van incubatie met ofwel primaire antilichamen in de tweede stap van de immuun-etikettering.
- Vlekken van DNA met 300 nM van 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) gedurende 5 min. in het donker bij kamertemperatuur.
- 3 keer wassen in DPBS voor 1 min op een rocker in het donker.
- Een druppel (~ 50 µl) van de toepassing van antifade inbedmiddel op een glasplaatje. Tik zachtjes op de rand van het dekglaasje aan op een absorberend papier te verwijderen overtollige buffer voordat het dekglaasje aan met de cellen ondersteboven monteren. Het medium montage moet vormen een dunne laag tussen het dekglaasje aan en het glasplaatje. Als u wilt verwijderen van luchtbellen, heel zachtjes druk op het dekglaasje aan met een fijne Tang.
- Toestaan van monsters te genezen 's nachts in het donker bij 4 ° C. Het medium van de montage moet harden voor microscopische analyse met immersie-lenzen. Monsters opslaan in 4 ° C in het donker.
5. neutrofiele extracellulaire Trap kwantificering
- Blind de exploitant(en) verwerven en analyseren van de beelden van de Microscoop aan de experimentele omstandigheden.
- Het gebruiken van een fluorescentie Microscoop op 40 X vergroting, neem 10 beelden willekeurig uit verschillende regio's van elke dekglaasje aan in een experiment onder de respectieve kanalen. Ervoor dat de belichtingstijd, de helderheid en het contrast van elk kanaal consistent de overname van afbeeldingen worden gehouden.
- Het analyseren van de beelden met behulp van beschikbare software zoals ImageJ (NIH). Identificeren van netten op basis van co lokalisatie van cfDNA, citH3 en MPO (figuur 3A, B). Het aantal netten en neutrofielen in 10 willekeurige velden voor elke experimentele voorwaarde te kwantificeren. Nummers van netten uitgebracht kan worden uitgedrukt als een ratio (aantal netten: totaal aantal neutrofielen) voor elke experimentele voorwaarde.
- Om de effecten van de behandeling op de intracellulaire citH3 expressie, tellen het aantal neutrofielen met intracellulaire citH3 en aantal neutrofielen zonder intracellulaire citH3 in 10 willekeurige velden bij 40 X vergroting onder de respectieve kanalen ( Figuur 3, rode pijlen). Intracellulaire citH3 expressie kan worden uitgedrukt als de verhouding van het aantal neutrofielen met intracellulaire citH3 aan het aantal neutrofielen zonder intracellulaire citH3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol voor levende cellen imaging, kunnen onderzoekers observeren de nucleaire morfologie, de plasma membraan integriteit en de aanwezigheid van cfDNA in levende neutrofiele granulocyten. Een cel impermeant nucleaire kleurstof vlekken kernen zuren rode in cellen met beschadigde celmembranen. Een andere cel-permeant kleurstof, etiketten intracellulaire nucleic zuren in levende cellen met een intact plasma membraan. Alle intact neutrofielen, ongeacht hun behandelingen, moeten worden groen weergegeven en vertonen de karakteristieke lobulated kernen op 0 tot 30 min na stimulatie (figuur 2A). Kernen van PMA-behandelde neutrofielen beginnen te verliezen hun lobulated verschijning door ongeveer 60 min en blijven decondense tot de release van cfDNA (figuur 2B). LPS, een langzamer en meer fysiologische stimulans van canine neutrofielen, meestal niet leidt tot decondensation van de chromatine of NETosis tot 90 min na stimulatie (figuur 2B). Door 120 min, te LPS - en PMA-geactiveerde neutrofielen zien omgeven door cfDNA. Ten opzichte van LP's, verliezen meer-PMA geactiveerd neutrofielen hun plasma membraan integriteit als ze zijn rood gekleurd door de cel impermeant kleurstof (figuur 2C). Ongestimuleerde neutrofiele granulocyten (DPBS control) moeten handhaven lobulated kernen en intact plasmamembraan gedurende de incubatietijd (figuur 2A-C).
NETTO componenten bestaande uit cfDNA, worden citH3 en MPO korrels gedetecteerd met behulp van de dubbele immunolabeling-protocol. Release van netten, geïdentificeerd op basis van co lokalisatie van cfDNA, citH3 en MPO, in reactie op LP's en PMA zijn weergegeven in figuur 3A en 3B, respectievelijk. Neutrofielen gestimuleerd door LPS voor 180 min produceren discrete web-achtige steigers van netten in de directe nabijheid van nabijgelegen neutrofiele granulocyten (figuur 3A). In tegenstelling, PMA-geactiveerde neutrofielen geproduceerd enorme hoeveelheden van netten die aanzienlijk groter in het gebied (figuur 3B, D waren). Citrullinatie van histones H3, gekatalyseerd door het enzym ontstaan deiminase (PAD), is een kenmerk van NETosis. PMA, een krachtige stimulans voor PAD, resulteert in een hoger aantal cellen uiten van intracellulaire citH3 ten opzichte van ongestimuleerde en LPS-gestimuleerd neutrofiele granulocyten (3E figuur).
Figuur 1: een schematisch diagram aan te tonen de stappen van canine neutrofiele isolatie. Verdunde EDTA bloed wordt eerst gemengd met 3% dextran voor sedimentatie van rode bloedcellen (RBC). Leukocyten-rich plasma is vervolgens verzameld en gelaagde op gelijke hoeveelheid commercieel beschikbare dichtheid verlopende scheiding media. Na centrifugeren (400 x g, 30 min), de RBC-granulocyt-laag wordt geëxtraheerd en de resterende RBC worden verwijderd door hypotone lysis. Na toevoeging van 1,8% NaCl, granulocyten worden gesponnen beneden (112 x g, 5 min) en geresuspendeerde in speciale buffer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger fluorescerende beelden van levende canine neutrofielen. Geïsoleerde neutrofielen werden geactiveerd met 100 µg/mL LPS, 100 nM PMA of een vergelijkbare hoeveelheid Dubecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) als negatieve controle voor een totaal van 180 min. Nucleic acids in levende intact neutrofielen werden gekleurd groen met behulp van een cel-permeant kleurstof terwijl cfDNA en neutrofielen met gecompromitteerde celmembranen waren rood met een cel-impermeant kleurstof gekleurd. (A, D) DPBS - en LPS-testgroep neutrofielen alle onderhouden een intact celmembraan met lobulated kernen (sterretje). (A, E) De kernen van PMA-geactiveerde neutrofielen begon te decondensation (pijlpunten) ondergaan. (B, F) 90 min, hadden meeste kernen in neutrofielen LPS - of PMA-geactiveerde verloren hun lobulated verschijning (blauwe pijlpunten). (C) na 120 min, alle PMA-geactiveerde neutrofielen had permeabele plasma membranen omgeven door cfDNA, terwijl cfDNA zagen rond van een klein aantal LPS-geactiveerde neutrofiele granulocyten (pijlen). Ongestimuleerde neutrofielen cfDNA niet produceren noch celmembraan op elk tijdstip (A-C) in gevaar had gebracht. (A-B) Originele 40 X vergroting. Schaal bar = 100 µm. (D-F) 80 X vergroting. Schaal bar = 30 µm. Experiment is gerepliceerd tweemaal van neutrofielen geïsoleerd van 3 verschillende donoren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: netto vorming. (A-C) Representatieve immunefluorescentie beelden van in vitro NET vorming. Geïsoleerde neutrofielen van een enkele donor werden vastgesteld, permeabel en gekleurd voor DNA (blauw), myeloperoxidase (MPO, groene) en citrullinated Histon H3 (citH3, rode) na stimulatie met (A) 100 µg/mL LPS, (B) 100 nM PMA of (C) DPBS 180 min. zijn netten, geïdentificeerd door co lokalisatie van MPO, cfDNA en citH3, overzicht (stippellijnen) op (A) LPS- en (B) PMA-geactiveerde neutrofiele granulocyten. Voorbeelden van intracellulaire uitdrukking van citH3 worden aangegeven door rode pijlen. (C) geen netten noch intracellulaire citH3 worden gezien in ongestimuleerde neutrofiele granulocyten. Schaal bar = 100 µm. (D, E) vertegenwoordiger vak en friemeltje percelen netto vorming en intracellulaire citH3 expressie in neutrofielen geïsoleerd van 4 honden. Het vak loopt vanaf de 25th naar 75th percentielen en snorharen span van de kleinste tot de grootste waarde. LP's en PMA stimulatie resulteerde in aanzienlijke netto vorming van (D) en (E) intracellulaire citH3 expressie ten opzichte van ongestimuleerde neutrofiele granulocyten. + vertegenwoordigt betekenen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij presenteren hier een protocol om te zien hoe de veranderingen in kernen bevleesdheid en cfDNA release in levende canine neutrofiele granulocyten met behulp van zowel een cel permeant kleurstof en een cel impermeant kleurstof. Het belangrijkste voordeel van deze test is dat het mogelijk voor real-time detectie van netto vorming door high-resolution microscopie in levende neutrofielen zonder cel fixatie, daarom bieden een eenvoudige en waardevolle tool maakt voor de naleving van de in vitro netto vorming. Aangezien deze bepaling geen antilichamen voor het opsporen van netto onderdelen vereist, is het ideaal voor het bestuderen van NETosis in soorten met beperkte beschikbaarheid van soortspecifieke antilichamen. Met behulp van deze test, de auteurs aangetoond dat honden neutrofielen ondergaan chromatine decondensation onder LPS of PMA stimulatie vóór NETosis13. Een groot nadeel van deze techniek is dat er geen specifiek voor NETosis. Omdat de cel impermeant kleurstof ook vlekken nucleic zuren in necrotische cellen of nucleic zuren lysed neutrofielen verlost, kon cfDNA of cel impermeant-positieve cellen ten onrechte beschouwd als netten of NETosing neutrofiele granulocyten. U kunt ook kan de specificiteit van de NETosis worden verhoogd door met inbegrip van PMA - of LPS-geactiveerde neutrofiele granulocyten die zijn voorbehandeld met de PAD4-remmer, Cl-amidine. We hier laten zien worden voor partnerschapsmechanismen steriliteit en correcte afhandeling van neutrofielen gedurende het proces van isolement als verontreiniging en enorme krachten kunnen leiden tot necrose in vitro en lysis van de cel. Wij raden ook voldoen aan de passende temperaturen gedurende de protocollen en voorkoming van langdurige (> 1 min) hypotone lysis. Om te bevestigen de levensvatbaarheid van geïsoleerde neutrofielen overuren, zijn een Trypan blauw uitsluiting test, alsmede een negatieve controle uit van ongestimuleerde neutrofielen sterk aanbevolen.
Omdat cfDNA gedetecteerd door cel-ondoordringbare nucleïnezuur kleurstoffen niet specifiek voor NETosis is, ontwikkelden we een dubbel-immunolabeling-protocol voor het kwantificeren van in vitro netto vorming en intracellulaire citH3 expressie in canine neutrofiele granulocyten. Zoals neutrofielen granulaire eiwitten zoals MPO samen met cfDNA en citH3 in de extracellulaire ruimte loslaat, is netto kwantificering op basis van co lokalisatie van cfDNA, citH3 en MPO specifieker in vergelijking met andere testen zoals cfDNA, nucleosomes of DNA-MPO complex 14. als gevolg van de beperkte beschikbaarheid van antilichamen die met canine eiwitten cross-react, gebruikten we primaire antilichamen die afkomstig van een andere soort (konijn zijn). Om te voorkomen dat vastleggen van primaire antilichamen door residuele gratis bandplaatsen op secundaire antilichamen in elke stap van het proces van kleuring, we eerst konijnenserum gevolgd door unconjugated Fab fragmenten te verzadigen de gratis bandplaatsen gebruikt. Een kritieke stap van deze procedure is om voldoende wassen om te voorkomen dat overtollige binding van immunoglobulinen en Fab fragmenten die met de detectie van de tweede proteïne van belang interfereren kunnen. We raden ook aan het testen van verschillende verdunningen van het primaire en secundaire antilichamen om niet-specifieke binding en storingen te minimaliseren. Om ervoor te zorgen dat de secundaire antilichamen van beide immunolabelling stap bindt specifiek aan haar primair antilichaam, dient de onderzoekers 2 verschillende besturingselementen die ofwel primair antilichaam in de tweede stap van het immunolabelling uitsluiten. Niet-specifieke binding treedt op als signalen uit beide secundaire antilichamen worden gedetecteerd.
Histon Citrullinatie of deamination, gekatalyseerd door het enzym ontstaan deminase 4 (PAD4), is van essentieel belang in bacteriën-geassocieerde NETosis in muizen en mens15,16. Met behulp van deze test, konden we om te bepalen dat de LPS-geïnduceerde NETosis bij honden ook Histon H3 Citrullinatie door PAD13vereist. Om te testen of de stimulerende middelen van belang NETosis door activering van de PAD4 induceert, is het raadzaam de opneming van positieve controles met behulp van bekende PAD4 activators zoals PMA of de calcium-ionophore, A2318717. Als neutrofielen Toon negatieve kleuring voor citH3 in de positieve controlemonsters, moet het protocol worden herzien voordat tot een voldoende positieve kleuring is geleid. We raden ook aan de opneming van biologische negatieve controles uit ongestimuleerde neutrofiele granulocyten ofwel neutrofielen behandeld met de PAD-remmer, Cl-amidine.
Nauwkeurige identificatie van verschillende netten structuur kan lastig zijn met behulp van deze techniek. Dit kan bijzonder moeilijk in monsters met een uitgebreide NETosis, zoals het samenvoegen van netto structuren vrijgelaten uit meerdere aangrenzende neutrofielen tot de onderschatting van NETotic gebeurtenissen leiden kan. Resultaten van deze test kunnen worden gecorreleerd met andere objectievere assays zoals stroom cytometry of ELISA, die nog niet is gevalideerd voor gebruik in canine neutrofiele granulocyten. Voorkom vorming van confluente netto structuur, kunnen onderzoekers zaad een lagere concentratie van cellen. U kunt ook kunt verminderen de totale incubatietijd uitgebreide NETosis en het samenvoegen van netto structuren vermijden. Hoewel dit protocol kan worden gebruikt om te onderzoeken NETosis in andere soorten, op basis van de ervaring van de auteurs, kan neutrofiele reactie op LP's of PMA sterk variëren tussen de soorten.
De ontdekking van netten bij honden benadrukt dat NETosis een geconserveerde mechanisme van aangeboren immuniteit tijdens microbiële infectie en immuun-gemedieerde ziekte. De hier gepresenteerde tests kunnen een waardevol hulpmiddel voor de studie van NETosis in honden en andere soorten. Een beter begrip van sepsis-geïnduceerde NETosis zal verder onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën voor sepsis vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De overeenkomstige auteur werd gefinancierd door de Stichting dier Morris (D15CA-907). De studie werd gesteund door fondsen van de Universiteit van Californië, Davis, Center voor de gezondheid van de paarden en Center for Companion Animal Health (2016-24-F). De auteurs wil erkennen Geena Ng voor haar hulp bij de cijfers en Nghi Nguyen voor haar hulp bij de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S.
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).
