Summary
全血からの犬好中球を分離し、蛍光顕微鏡を用いたライブ好中球におけるネットの形成を視覚化する方法について述べる。ネット形成とシトルリン化ヒストン H3 を定量化するプロトコルについて述べる、蛍光顕微鏡を用いた (citH3) 式。
Abstract
病原体の侵入に対し、好中球は DNA のヒストンと抗菌タンパク質の細胞ネットワークである好中球細胞外トラップ (網) をリリースします。過剰なネット形成 (NETosis) 敗血症時に citH3 リリースは複数の臓器障害とマウスとヒトの死亡率に関連付けられて、その犬への影響が知られています。ここで、観察及び定量化 NETosis の全血から犬の好中球を分離する手法について述べる。デキストランの沈降によって生成された白血球リッチ プラズマが市販の密度勾配分離メディアで区切られ、顆粒球の収集細胞数および生存率試験。ライブの好中球におけるリアルタイムの NETosis を観察するには、側の透過物のセルとセルの非透過性蛍光核酸の汚れはリポ多糖 (LPS) またはホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) のいずれかを活性化好中球に追加されます。核の形態とネット形成の変化は、時間をかけて蛍光顕微鏡で観察します。体外NETosis co-3p324 細胞遊離 DNA (cfDNA)、ミエロペルオキシダーゼ (MPO)、シトルリン化ヒストン H3 (citH3) 変更された二重 immunolabelling プロトコルを使用してが特徴です。ネット形成と蛍光顕微鏡を使用して citH3 式を客観的に定量化するネットし、citH3 陽性細胞が利用可能なソフトウェアを使用して盲検の方法で定量化します。この手法は、特定検定犬の好中球の体外容量 NETosis を受けることに。
Introduction
好中球が顆粒球短命の病原体の侵入に対する最初の防衛を担当です。伝染のサイトに募集、好中球は貪食、脱顆粒反応と活性酸素種 (ROS)1の生成による微生物を排除します。細菌やエンドトキシンの存在下で好中球リリース好中球細胞外トラップ (ネット)、細胞のクロマチンの構成は (MPO)2ヒストンとエラスターゼとペルオキシダーゼのような顆粒内蛋白で装飾されています。ネットでは、不可欠な抗菌特性を持っていますが、実験と臨床の証拠が増えている敗血症時にあまりに熱心なネット形成が複数臓器不全と死3,4、につながる可能性があります。5,6。
ネットは、犬同様の病態生理学的役割を再生可能性があります、ために、ネットの形成を減少または防ぐ治療上の介在は敗血症動物における新しい治療戦略として役立つかもしれない。このため、信頼性の高い手法を評価し、NETosis と犬の NET コンポーネントを数値化するために必要があります。NET コンポーネント (cfDNA) DNA ヌクレオソームなどは以前犬の好中球および臨床犬7,8,9からプラズマで評価されています。蛍光アッセイを使用して、ゴッグスと Letendre 発見健康犬8より cfDNA のハイレベルがある浄化槽犬。これらの技術は高度に客観的・定量的な NETosis のマーカーとして cfDNA とヌクレオソームの測定が非特異的 NETosing 好中球以外壊死細胞から得られるので。ここで好中球 NETosing ライブの挙動を調べる蛍光顕微鏡を利用した手法について述べる。また、ネットと MPO など犬の好中球10citH3 コンポーネントを主観的に定量化する二重反応を使用して修正されたプロトコルの詳細します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアとカリフォルニア大学デービス校利用委員会によって承認された (プロトコル番号: 18338)。
1. 採血
- 21 G 針を用いた注射器吸引頭部または頸静脈いずれかから 10 mL の血液を描画します。
- 過剰な剪断応力を避けるためには、血液をヘパリン ナトリウム (75 USP) を含む尿管に転送する前に注射器から針を削除します。やさしく数回チューブを転倒させる抗凝固剤と血液の適切な混合を確実にします。氷の上にサンプルを置く前に血栓や赤血球凝集体の証拠を確認します。
2. 好中球の隔離
- 冷たい Dubecco のリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) (pH 7.4、二価のカチオン類なし) の等量と高血圧症血液を希釈します。(0.9% 塩化ナトリウム溶液中に溶けてロイコノ ストック属属) から 3% デキストランの 25 mL を含む 50 mL ポリプロピレン円錐管に希釈血液を 8 mL を転送します。集計と赤血球の沈降を許可する 30 分間室温で直立管を配置します。
- 5 mL 14 mL ポリプロピレン製丸底チューブで密度勾配メディアの上にレイヤー白血球・血漿 (図 1) の 5 mL の慎重に。2 ソリューション11を混在させないよう注意します。
- 400 x g加速/減速を室温で 30 分間 0 (ブレーキなし) (A/D) セットでチューブを遠心します。
- 血清ピペット 5 mL を使用してプラズマと末梢血単核球 (PBMC) の層 (図 1) をバイパスすることにより顆粒細胞層を収集します。汚染を最小限にするたびに新しいピペットを使用します。
- 核 (PMN) 細胞層の 4 に 6 mL を 50 mL ポリプロピレン円錐管に配置します。赤血球集合体の少量は、多形核白血球層と共に吸気可能性があります、ので管の底で決済している赤血球凝集体を取り除きます 1 mL の血清ピペットを使用します。
- 冷たい純水 20 mL と残りの赤血球を溶解させます。複数回 30 〜 60 のチューブを軽く反転冷たい 1.8% 塩化ナトリウム溶液の等しい量を追加する前に適切な溶解を確認します。
- 4 ° C で 10 分間、0 A/D セット 112 x gで遠心分離機します。
- このペレットが赤表示されている場合は、赤血球溶解手順を繰り返します。血清ピペットを使い、慎重に上澄みを廃棄し、優しく DPBS (デキスト ロース 5 mM、0.9 mM MgCl2、1.9 mM CaCl2および 1% ウシ血清アルブミン、pH 7.3) を 100 μ l 添加でペレットを再懸濁します。すべての再懸濁細胞を組み合わせるし、氷の場所します。
- 自動細胞分析装置を使用してセル数を数えるため、検定によって数を確認してください。必要に応じて、(1,000 rpm, 5 min) の収集を使用してスライド ガラスに Pmn を集中し、セルの合計数のうち好中球の数をカウントすることによって好中球の割合を決定します。
- Stroberらに従ってトリパン ブルー色素排除試験を実行することによって好中球の生存を確認します。12 100 %95 から、生存率をもたらすべきである分離を成功させると、好中球が 95% 以上にする必要があります。
- % 生存率と好中球 % 総セル数を掛けることによって好中球の濃度を決定します。分離を成功させるは、6 x 106/mL に 1.5 から好中球濃度を得られるはず。
- Ph 7.3 に調整 5 mM デキスト ロース、0.9 mM MgCl2、1.9 mM CaCl2、および 1% ウシ血清アルブミンを含む DPBS で 1 x 106/mL の最終的な集中に好中球を希釈します。
3. ライブ好中球蛍光顕微鏡
- 多 L リジンの各ウェルに好中球 (1 x 106/mL) 400 μ L に場所 200 コーティング 12 ウェル培養プレートです。アドロイに 30 分の 37 ° C で井戸の底に付着する好中球を許可します。
- 1 μ m の 2 つの核酸の染料の一つ、汚れをそのまま膜細胞の 1 つ、1 つは細胞透過性膜 (材料の表を参照してください)、室温で 10 分間で汚れ、核酸のラベルを付けます。
- 100 μ g/mL リポ多糖 (LPS) (大腸菌O55 と好中球をアクティブにします。B5)、100 nM ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 肯定的な制御または 37 ° C で 180 分のネガティブ コントロールとして DPBS の相当量として
- GFP を使用して画像を取得 (励起: 470/22 nm、発光: 525/50 nm) とテキサス赤チャンネル (励起: 585/29 nm、発光: 628/32 nm) 次の時点で 40 倍の倍率で蛍光顕微鏡: 30、90、120、180 分。
4 純数量および蛍光抗体法を用いた純成分の検出
- 12 ウェル培養プレートのウェルに 18 mm 直径ポリ-D-リジン コーティング カバー スリップを慎重に配置します。井戸に適切にラベルを付けます。
- 種子の 100 に 200 μ L は、カバーガラスの上に直接好中球 (1 × 106/mL) を分離し、37 ° C、30 分で細胞を培養によってカバー スリップを遵守する好中球を許可します。
- 3.3 で説明したように、好中球をアクティブにします。200 µΜ と好中球を前処理によるネットの形成を阻害する Cl-アミジン (15 分、37 ° C) 李らによって前述の活性化の前に13実験で適切な車両制御 (DMSO) が含まれていることを確認してください。
- 微細鉗子でカバー スリップを慎重に取り外します。浅い井戸を作成し 4% の 2 〜 3 滴を配置するテスト チューブ スタンドにパラフィン フィルム シートを層ごとよく10の PFA。井戸に適切にラベルを付けるし、優しく PFA で満たされた井戸の上に逆さまカバー スリップを横たわっていた。20 分間室温で固定します。
- 次に 1 つの井戸から移動して 3 回 5 分 DPBS のセルを洗浄します。
- 直後に、好中球の活性化と固定 immunolabelling を実行できない場合は、カバー スリップの顔アップ吸収紙の上に配置することによって乾燥空気になるカバー スリップを許可します。さらに詳しい分析まで最大 1 週間 4 ° C でラベルの 12 ウェル培養プレートの表側のカバー スリップを格納できます。3 回の次のステップに進む前に 4.4 で説明されているように同じ技術を使用して 1 分の DPBS セルを洗浄します。
- セルを permeabilize 優しくカバー スリップ逆さまに置く 4.4 で説明されている手法を使用して 1 分の NP 40 1% のドロップ。ロッカー上で 1 分間 DPBS で 3 回を洗います。
- ランダムに各サンプルの数を割り当てる、ダイヤモンド ポイント マーカーを使用して、それに応じて、coverslips にラベルを付けます。
- 準備とラベル個々 ペトリ皿パラフィン フィルムと並び、(バッファー ブロッキング) フィルムに 5% ヤギ血清の 100 に 200 μ L を配置します。ブロック バッファーに、coverslips を逆さまに横たわっていた。ロッカー上に配置し、37 ° C で 1 時間インキュベート
- ロッカー上で 5 分間、3 回に DPBS 洗ってください。
- 一次抗体の希釈 (1: 400 ウサギ ポリクローナル抗シトルリン化ヒストン H3 (citH3) 5% ヤギ血清中)。パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。希釈液の 50 に 100 μ L の各カバー スリップを逆さまに横たわっていた。ロッカー上に配置し、37 ° C で 1 時間インキュベート
- ロッカー上で 5 分間、3 回に DPBS 洗ってください。
- 二次抗体の希釈は 5% ヤギ血清に蛍光体 (レバレッジ) に共役。パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。希釈液の 50 に 100 μ L の各カバー スリップを逆さまに横たわっていた。ロッカーに置き、暗闇の中で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
- 暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。
- ミエロペルオキシダーゼ (MPO) の同時検出 Li et al.によって説明するよう変更された二重反応プロトコルの次の手順に従います13
- パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。各カバー スリップ逆さまに置く 10% ウサギの 100 に 200 μ L 穏やかな揺動 (一晩、4 ° C、暗闇の中で) の下で血清。
- 暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。
- 50 μ g/mL 非ヤギ抗うさぎ Fab フラグメント暗闇の中のロッカーに室温で 2 時間のセルを孵化させなさい。
- 暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。
- 一次抗体 (1: 200 ウサギ ポリクローナル抗 MPO 抗体) 5% ヤギ血清を希釈します。パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。希釈液の 50 に 100 μ L の各カバー スリップを逆さまに横たわっていた。ロッカーに置き、暗闇の中で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
- 5% ヤギ血清に蛍光標識二次抗体を希釈し、前述の 4.8 を孵化させなさい
- 暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。
- 干渉コントロールを作成するには、免疫ラベルの 2 番目の手順でいずれかの一次抗体の孵化を除きます。
- 300 で DNA を染色 nM の 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole、塩酸 (DAPI) 室温で暗闇の中で 5 分間。
- 暗闇の中のロッカーに 1 分の DPBS で 3 回を洗います。
- スライド ガラスに antifade フィルターとフィルターのドロップ (~ 50 μ l) を適用します。そっと逆さま coverslip 細胞とをマウントする前に余分なバッファーを削除する吸収紙の上のカバーガラスの端をタップします。メディアをマウントする必要があります、coverslip とスライド ガラスの薄い層を形成します。空気の泡を削除するには、非常を軽く押して、coverslip 微細鉗子で。
- 4 ° C で暗闇の中で一晩治すためサンプルを許可します。浸漬レンズと顕微鏡分析のためメディアをマウントを強化してください。暗闇の中で 4 ° C にサンプルを格納します。
5. 好中球細胞外トラップ定量化
- 盲目のオペレーターの集録および実験条件に顕微鏡画像を解析します。
- それぞれのチャンネルの下の実験で各 coverslip の異なった地域からランダムに 10 の画像を取る蛍光顕微鏡を使用すると、40 倍の倍率で。露出時間、明るさおよび各チャンネルのコントラスト画像の取得で一貫して保持されますを確認します。
- 利用可能なソフトウェア ImageJ (NIH) などを使用して画像を分析します。CfDNA、citH3、MPO (図 3 a, B) の共局在に基づくネットを識別します。ネットと各実験条件の 10 のランダムなフィールドにおける好中球の数を定量化します。リリース ネットの数字は比率として表現できます (ネット数: 好中球の合計数) 各実験条件のため。
- 細胞内 citH3 式の治療効果を評価するには、細胞内 citH3 と好中球の数とそれぞれのチャンネルで (の下で 40 倍の倍率で 10 のランダムな分野で細胞内 citH3 なしの好中球の数を数える図 3、赤い矢印)。細胞内 citH3 式は、細胞 citH3 細胞内 citH3 なしの好中球の数と好中球数の比として表現できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
生きているセルイメージ投射のこのプロトコルを使用すると、調査官は核形態、プラズマ膜の完全性と生活の好中球における cfDNA の存在を観察できます。セルの非透過性核色素の汚れ破損した細胞膜と細胞内核酸を赤。別セル側の透過物の色素は、そのまま細胞膜と細胞の細胞内の核酸をラベル付けします。その治療に関係なく、すべてのままの好中球が緑表示し、刺激 (図 2 a) 後 0 に 30 分で特徴的な葉状核を展示します。PMA 処理好中球の核は、約 60 分葉状の外見を失い、cfDNA (図 2 b) のリリースまで脱凝縮したり続けますし始めます。LP、犬好中球のより遅くより生理学的覚醒剤通常されませんクロマチン decondensation または NETosis で 90 分まで電気刺激を与える (図 2 b)。120 分まで、LPS と PMA 活性化好中球は cfDNA に囲まれて見ることができます。LP と比べるより PMA 活性化好中球によって、セル非透過性色素 (図 2) によって赤を染みとの膜の整合性が失われます。葉状の核と (図 2 a・ C) は培養期間を通してそのまま膜処理好中球 (DPBS コントロール) を維持します。
NET コンポーネントを cfDNA から成る、citH3 と MPO 顆粒は二重反応プロトコルを使用してを検出しました。CfDNA の共局在に基づく識別ネットのリリース、citH3 と LPS および PMA で MPO はそれぞれ図 3 a 、3 b、表示しています。180 分の LPS によって刺激された好中球は、近くに好中球 (図 3 a) 近くにネットの離散の web のような足場を生成します。対照的に、PMA 活性化好中球は領域 (図 3 b, D) は著しく大きい、ネットの膨大な量を作り出した。のヒストン H3、触媒酵素原因タンパク質 (PAD) によるシトルリンが NETosis の特徴。PMA、パッドの強力な興奮剤は、些細と LPS 刺激による好中球 (図 3E) と比較して細胞内の citH3 を発現する細胞数の増加の結果します。
図 1: 犬の好中球の隔離の手順を示す図。希薄化後のヘパリン血中赤血球 (RBC) の堆積の 3% デキストラン混合最初。白血球・血漿は収集し、市販密度勾配分離メディアの平等なボリューム上に階層化します。以下の遠心分離 (400 × g、30 分)、赤血球顆粒層を抽出し、残り赤血球が低張性換散によって削除されます。1.8% の添加後食塩、顆粒球の (112 x g、5 分) スピンダウンし、専用バッファーで再停止されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ライブの犬好中球の代表的な蛍光イメージ。分離された好中球が 100 μ g/mL LPS で活性化、Dubecco のリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 180 分ライブそのままの好中球における核酸の合計はネガティブ コントロールとしての 100 nM、PMA またはそれと同等のボリューム、セル-側の透過物を用いた緑色に染まっていたcfDNA および危険にさらされた細胞膜と好中球細胞非透過性の色素で赤染色中に色素。(A, D)すべての DPBS と LPS 処理好中球は、葉状の核 (アスタリスク) そのまま細胞膜を維持されます。(A ・ E)PMA 活性化好中球の核 decondensation (矢印) を受けるようになった。(B, F)90 分でほとんど組合または PMA 活性化好中球核は葉状外見 (青い矢印) を失っていた。(C) 後 120 分、すべて PMA 活性化好中球は透過性膜周囲の少数組合活性化好中球 (矢印) の cfDNA を見ることができる間、cfDNA に囲まれています。些細好中球 cfDNA を生成していないも任意の時点 (A ~ C) で細胞膜を侵害していた。(B)オリジナル 40 X 倍率。スケールバー = 100 μ m. (D-F) 80 倍の倍率。スケール バー = 30 μ m. 実験 3 に異なるドナーから分離された好中球から 2 回レプリケートされました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ネット形成します。(A ~ C)体外ネット形成の代表的な蛍光イメージ。単一ドナーから分離された好中球を修正しました、グリセリン、ミエロペルオキシダーゼ (MPO、緑) とシトルリン化ヒストン H3 の DNA (青)、染色 (citH3、赤) 100 (B) (A) 100 μ g/mL lps 刺激後 PMA または (C) DPBS nM180 分ネット、cfDNA、citH3 との共局在によって識別されるが (A) リポ多糖および (B) PMA 活性化好中球の概説 (点線)。CitH3 の細胞内の式の例は、赤い矢印で示されます。(C) いかなるネットも細胞内の citH3 は些細好中球に見られます。スケールバー = 100 μ m. (D, E) 代表的なボックス、ウィスカのプロット ネット形成と 4 匹の犬から分離された好中球における細胞内 citH3 式。75th百分位数に 25回まで、ボックス、ひげにまたがる最小から最大値に。LPS および PMA 刺激結果重要な (D) ネット形成と些細好中球に比べて (E) 細胞内 citH3 式。+ 意味を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
セル側の透過物色素と細胞の非透過性染料を使用して生活の犬好中球の核形態と cfDNA リリースで変化を観察するためのプロトコルをご紹介します。このアッセイの主な利点は、できるネット形成のリアルタイム計測セル固定せずライブ好中球における高分解能顕微鏡によってしたがって、体外ネット形成を観察するためのシンプルで貴重なツールを提供します。以来、このアッセイは、NET コンポーネントの検出のための抗体を必要としない、種特異的な抗体の限られた供給に種の NETosis の勉強に最適です。この試金を使用して、著者を示した犬の好中球が組合又は PMA クロマチン decondensation を受ける前に NETosis13刺激。この手法の主な欠点は、それが NETosis のために特定ではないです。セルの非透過性色素は、壊死細胞の核酸または核酸分離好中球からリリースも汚れ、ために、cfDNA またはセルの非透過性陽性細胞はネットまたは NETosing の好中球として誤って解釈でした。また、その PAD4-阻害剤の Cl アミジンと前処理、PMA または LPS 活性化の好中球を含むによって NETosis の特異性を強化できます。我々 は不妊と汚染分離プロセス全体で好中球の適正な取扱いを確保することの重要性を示すと純粋な力することができます体外壊死につながるし、セル換散。プロトコルを通じて適正温度の遵守お勧めし、長期化を防止する (> 1 分) 低張性換散。分離された好中球超過の生存を確認、処理好中球から成るネガティブ コントロールと同様に、トリパン ブルー排除テストは強く推奨します。
細胞不浸透性核酸色素によって検出された cfDNA は、NETosis のために特定できないため我々 は体外ネット形成と犬の好中球における細胞内 citH3 発現を定量化するための二重反応プロトコルを開発しました。好中球は細胞外空間に cfDNA と citH3 と一緒に MPO のような顆粒内蛋白をリリース、cfDNA、citH3、MPO の共局在に基づく純の定量化は具体的 cfDNA、ヌクレオソーム DNA MPO 複合体など他の試金に比べると14. 犬のタンパクと交差反応する抗体の限定のため我々 は別の種 (ウサギ) を起源として一次抗体を使用します。一次抗体二次抗体染色のプロセスのいずれかの手順で上の残留無料結合部位でのキャプチャを防ぐため、まず無料の結合部位を飽和させる非 Fab 断片続いてウサギ血清を利用しました。このプロシージャの 1 つの重要なステップは、免疫グロブリンと Fab 断片の関心の 2 番目のタンパク質の検出を妨げる可能性があります余分な結合を防ぐために十分な洗浄を確保することです。非特異的な結合との干渉を最小限に抑えるため第一次および二次抗体の異なる希釈率のテストをお勧めします。いずれかの immunolabelling ステップから二次抗体がその一次抗体にバインドされていることを確保するため、捜査官は 2 番目の immunolabelling ステップでいずれかの一次抗体を除外 2 の別のコントロールを含める必要があります。非固有のバインドは、両方の二次抗体からの信号が検出されたときに発生します。
ヒストン シトルリンまたは脱アミノ化、触媒酵素ペプチジルアルギニンデイミナーゼ deminase 4 (その PAD4) による細菌関連付けられている NETosis マウスとヒトの15,16に不可欠です。この試金を使用して、犬の LPS 誘導性 NETosis もパッド13ヒストン H3 シトルリンが必要ことを確認することができました。興味の刺激その PAD4 の活性化による NETosis を誘導するかどうかをテストするのには、PMA またはイオノフォア、A2318717のような知られているその PAD4 のアクティベーターを使用して肯定的なコントロールを含めることをお勧めします。好中球を示す否定的な肯定的な制御サンプルの citH3 染色、プロトコルは十分な陽性の結果まで改正後する必要があります。また、安静時の好中球や好中球 Cl アミジン パッド阻害剤で治療から成る生物のネガティブ コントロールを含めることをお勧めします。
この手法を使用して個別のネット構造の正確な同定は難しい。NETotic イベントの過小評価につながることができます複数の隣接する好中球からリリース ・ ネット構造物の融合、豊富な NETosis のサンプルでは特に困難できます。このアッセイの結果犬の好中球で使用するために検証されていないフローサイトメトリーや ELISA のような他のより客観的アッセイと相関しています。合流のネット構造の形成を避けるためには、研究者は細胞の低濃度を播くことができます。また、合計インキュベーション時間を短縮に、広範な NETosis とネット構造物の結合を回避できます。このプロトコルは、著者の経験に基づいて、他の種で NETosis を調査する使用できますが LP または PMA に好中球刺激応答が種大きく変化することができます。
犬のネットの発見は、NETosis が細菌感染や免疫介在性疾患の中に生得の免除の節約されたメカニズムであることを強調表示します。ここで紹介するアッセイは、犬および他の種の NETosis の研究のための貴重なツールをすることができます。敗血症による NETosis のよりよい理解は敗血症の新しい治療戦略の開発に更なる研究を促進します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
対応する著者モリス動物財団 (D15CA-907) によって資金を供給されました。研究は、カリフォルニア大学、デービス、馬の健康センター、コンパニオン動物保健センターからの資金によって支えられました (2016-24-F)。著者は、数字とギー グエンについて彼女のビデオで彼女の援助ジーナ Ng を認めたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Molecular weight 450,000 – 650,000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285801 | With divalent cations |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190136 | Without divalent cations |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes |
| SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes |
| Surface-Amps NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Poly-D-Lysine coated coverslips | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm diameter |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Specificity: IgG (H+L) |
| Anti- Myeloperoxidase antibody | Dako | A0398 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
- Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
- Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
- Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S.
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
- Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).
