בשל התכנים שומנים גבוהה בדם, מאתגרת רקמת שומן להמחיש היסטולוגית בשיטות מסורתיות. Adipo-ברור הוא רקמה פינוי טכניקה המאפשרת תיוג חזקים, דימות ברזולוציה של פלורסנט הנפחי של רקמת שומן. כאן, אנו מתארים את שיטות הכנת הדוגמא, רעלני, מכתים, ניקוי של הרכבה עבור הדמיה.
רקמת שומן ממלאת תפקיד מרכזי אנרגיה הומאוסטזה ומתת הומיאותרמיות. הוא מורכב מסוגים שונים של adipocytes, וכן סימנים מקדימים adipocyte תאים חיסוניים, fibroblasts, כלי דם, עצבים תחזיות. למרות שליטה מולקולרית של התא סוג מפרט ואת האינטראקציה תאים אלה יש כבר יותר ויותר התחום, הבנה מקיפה יותר של תאים אלה שוכנות שומן יכולה להיות מושגת דמיין שלהם הפצה ואדריכלות לאורך כל הרקמה שלם. אימונוהיסטוכימיה קיימות גישות immunofluorescence לנתח היסטולוגיה אדיפוז להסתמך על סעיפים פרפין-מוטבע דק. עם זאת, חלקים דקים ללכוד רק חלק קטן של רקמה; כתוצאה מכך המסקנות עלולים להיות מוטים על ידי ניתוח מה החלק של רקמות. לכן פיתחנו של רקמת שומן פינוי טכניקה, Adipo-נקי, להתיר ויזואליזציה תלת-ממדית מקיפה דפוסי מולקולרית, תאית ברקמות adipose שלם. Adipo-ברור היה ממאמרו של iDISCO / iDISCO +, עם שינויים מסוימים שבוצעו כדי להסיר לחלוטין את השומנים מאוחסן ברקמות תוך שמירה על מורפולוגיה רקמה מקורית. בשילוב עם מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, נדגים כאן את השימוש בשיטת Adipo פנוי כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה הנפחי של רקמת שומן כולו.
עד לאחרונה, רקמת שומן היה יזום של כמו אוסף אמורפי של תאי שומן. במהלך העשורים האחרונים, ההבנה שלנו גדלה מתוחכמים יותר, עם שומן שהוכר להיות איבר מורכבים המכילים סוגים שונים של adipocytes, כמו גם סימנים מקדימים adipocyte, תאים חיסוניים, fibroblasts, להערכת ו עצבים תחזיות. אינטראקציות בין תאים אלה שוכנות שומן יש מבטאים את ההשפעות על רקמת שומן, הפיזיולוגיה organismal, פתופיזיולוגיה1. למרות מחקרים המתעוררים יש פרם חשוב המנגנונים המולקולריים שבבסיס אינטראקציות מסוימות, הבנה מקיפה דורש פרופילים מבניים אמין של הרקמה כולו בתלת מימד (3D).
הידע הנוכחי שלנו של רקמת שומן מורפולוגיה מבוססת במידה רבה על ניתוח היסטולוגית סעיפים דקים (5 μm) עם הדמיה ההגדלה גבוהה יחסית (יותר מ 10 X)2,3. עם זאת, גישה זו יש מספר מגבלות משמעותיות. מבנים filamentous הראשון, מורכבות כגון העצבים הסימפתטית, להערכת את, אשר ידועים תפקיד חשוב הפונקציה אדיפוז4,5,6,7, שקשה להעריך באמצעות סעיפים דקים. שנית, בשל צורתה לכאורה אמורפי ואת חוסר נציג יחידות המבניים להתמקד, קשה להעריך את רקמת שומן מבנים המבוססת רק על סעיף מכתים. שלישית, רקמת שומן יש תוכן שומנים בדם גבוהה מאוד, יצירת אתגרים בהשגת עקבי מקטעים טורי המתאימים לטיפול שיקום אנטומי תלת-ממד, שיטה המקובלת ללמוד כל המוח מורפולוגיה8. בהינתן הגורמים הללו, יש צורך בגישה כולה-הר זה יכול לספק לוויזואליזציה תלת-ממדית של דיפו אדיפוז כולו תוך השגת עדיין את הרזולוציה הסלולר.
נפחי הדמיה ממוחשבת של איבר שלם הוא מאתגר בשל ההשפעות טשטוש של פיזור אור. המקור העיקרי של פיזור אור ברקמות ביולוגיות נובע ממשקים השומנים-מימית. למרות מאמצי ההכחדה של פיזור על-ידי הסרת שומנים כבר מתמשך עבור מעל למאה שנה, היו מספר רב של החידושים האחרונים9. אחת השיטות ניקוי רקמות פיתח כזה היא מאופשר immunolabeling הדמיה תלת-ממדית של איברים הממס-והפנים (iDISCO / iDISCO +)10,11. עם זאת, רקמת שומן מהווה אתגר מסוים נתון רמה גבוהה של שומנים, ולכן, שינויים נוספים iDISCO / iDISCO + פרוטוקול נדרשים באופן מלא תמצית ליפידים תוך הגנה על הרקמה מפני קריסה. פרוטוקול ששונה שפיתחנו, כעת נקרא Adipo-נקי, מעסיקה מבוססת על מתנול/דיכלורומתאן delipidation של רקמת שומן כדי להשיג שקיפות אופטימלית מתאים דימות ברזולוציה גבוהה הנפחי12. כי delipidation צעד בעיקר מרווה endogenously הביע פלורסנט חלבונים כמו GFP ו- RFP, ויזואליזציה של חלבונים כזאת חייבת להיות מושגת על ידי immunolabeling. בסך הכל, פרוטוקול זה פשוט וחזק יכול להיות מיושם ללמוד רקמות ברמת הארגון של תאי שומן-תושב, עקיבה השושלת adipocyte ובתאים, מורפוגנזה אדיפוז במהלך הפיתוח.
Adipo-ברור היא שיטה פשוטה וחזק שהבהרת רקמת שומן, אשר ניתן בקלות לבצע התקנה במעבדה רגילה. לעומת שיטות ניקוי ממס מבוסס אחרות כגון iDISCO / iDISCO10,11,12, פנוי Adipo ממוטבת במיוחד לניקוי רקמת שומן ורקמות אחרות עם תכולת שומן גבוהה. הצעד delipidation לחלוטין מסיר ש…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים כריסטינה שממוקמים טאו טונג, אליסון צפון, מרכז המשאבים Bioimaging באוניברסיטת רוקפלר לקבלת סיוע ותמיכה. אנו מודים גם Xiphias ג ‘ נרל אלקטריק ז’ו לעריכת הסרט. עבודה זו נתמכה על ידי האדם הגבול המדע תוכנית הארגון (PC).
1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |