Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo
Summary
A causa del contenuto elevato del lipido, tessuto adiposo è stato impegnativo per visualizzare usando i metodi istologici tradizionali. Adipo-Clear è un tessuto tecnica che permette di etichettatura robusto e imaging fluorescente volumetrica ad alta risoluzione del tessuto adiposo di compensazione. Qui, descriviamo i metodi per la preparazione del campione, pretrattamento, colorazione, compensazione e montaggio per l’imaging.
Abstract
Tessuto adiposo gioca un ruolo centrale nell’omeostasi energetica e termoregolazione. Esso è composto da diversi tipi di adipociti, così come precursori degli adipociti, cellule immunitarie, fibroblasti, vasi sanguigni e le proiezioni del nervo. Sebbene il controllo molecolare di specifica del tipo di cellula e come interagiscono queste cellule sono state sempre più delineate, una comprensione più completa di queste cellule adiposo-residente si può visualizzare la loro distribuzione e architettura durante l’intero tessuto. Approcci attuali di immunoistochimica e immunofluorescenza per analizzare l’istologia adiposa si basano su sezioni sottili di paraffina. Tuttavia, sezioni sottili catturano solo una piccola porzione di tessuto; di conseguenza, le conclusioni possono essere prevenute da quale parte del tessuto è analizzato. Abbiamo quindi sviluppato un tessuto adiposo compensazione tecnica, Adipo-Clear, per consentire la completa visualizzazione tridimensionale di modelli cellulari e molecolari in tessuti adiposi interi. Adipo-Clear è stato adattato da iDISCO / iDISCO +, con specifiche modifiche apportate a rimuovere completamente il lipido immagazzinato nel tessuto, preservando la morfologia del tessuto nativo. In combinazione con microscopia di fluorescenza di luce-foglio, dimostriamo qui l’uso del metodo Adipo-Clear per ottenere immagini ad alta risoluzione volumetriche di un intero del tessuto adiposo.
Introduction
Fino a poco tempo, il tessuto adiposo fu concepito come un insieme amorfo di cellule adipose. Negli ultimi decenni, la nostra comprensione è cresciuta più sofisticato, con grasso ora riconosciuta per essere un organo complesso contenente diversi tipi di adipociti, così come precursori degli adipociti, cellule immunitarie, fibroblasti, il sistema vascolare e proiezioni del nervo. Interazioni tra queste cellule adiposo residenti hanno pronunciato effetti sul tessuto adiposo e organismal fisiologia e patofisiologia1. Anche se gli studi emergenti hanno dipanato importanti meccanismi molecolari alla base di determinate interazioni, una comprensione più completa richiede affidabile analisi strutturale del tessuto intero in tre dimensioni (3D).
Nostra attuale conoscenza della morfologia del tessuto adiposo è in gran parte basata sull’analisi istologica di sezioni sottili (5 μm) con formazione immagine relativamente ad alto ingrandimento (più di 10 volte)2,3. Tuttavia, questo approccio presenta diverse limitazioni significative. Prime, intricate strutture filamentose quali nervi simpatici e il sistema vascolare, che sono conosciuti per svolgere un ruolo importante nella funzione adiposa4,5,6,7, sono difficili da valutare attraverso sezioni sottili. In secondo luogo, grazie alla sua forma apparentemente amorfo e la mancanza di unità strutturali rappresentativi di concentrarsi su, è difficile apprezzare il tessuto adiposo strutture basate solo sulla sezione macchiatura. In terzo luogo, il tessuto adiposo ha un contenuto di lipidi molto alta, la creazione di sfide nell’ottenere sezioni di serie coerente che sono adatte per 3D ricostruzione anatomica, un metodo convenzionale utilizzato per studiare il cervello intero morfologia8. Considerati questi fattori, c’è un grande bisogno di un approccio di intero-monta che può fornire una visualizzazione 3D di un intero deposito adiposo ottenendo ancora cellulare ad alta risoluzione.
Imaging 3D volumetrico di un intero organo è impegnativo a causa degli effetti di oscuramento della dispersione della luce. Delle principali fonti di dispersione della luce nei tessuti biologici proviene da interfacce del lipido-acquosa. Anche se gli sforzi per eliminare dispersione rimuovendo i lipidi sono in corso da oltre un secolo, ci sono stati un gran numero di recenti innovazioni9. Un tale metodo di recente sviluppato del tessuto-schiarimento è abilitato immunolabeling imaging 3D degli organi solvente-deselezionata (iDISCO / iDISCO +)10,11. Tuttavia, il tessuto adiposo presenta una sfida particolare, data il suo alto livello di lipidi e di conseguenza, ulteriori modifiche per il iDISCO / iDISCO + protocollo sono necessaria per estrarre completamente i lipidi, proteggendo il tessuto dal collasso. Il protocollo modificato che abbiamo sviluppato, ora chiamato Adipo-Clear, impiega basate su metanolo/diclorometano delipidizzazione del tessuto adiposo per ottenere trasparenza ottima per imaging volumetrico ad alta risoluzione12. Perché la delipidizzazione passo in gran parte placa in modo endogeno espresse proteine fluorescenti come GFP e RFP, visualizzazione di tali proteine dovrà essere raggiunti da immunolabeling. Nel complesso, questo protocollo semplice e robusto può essere applicato per studiare organizzazione di livello del tessuto delle cellule adiposo-residente, l’analisi di lignaggio di cellule progenitrici degli adipociti e adiposa morfogenesi durante lo sviluppo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipo-Clear è un metodo semplice e robusto per l’eliminazione del tessuto adiposo, che può essere facilmente eseguito in una configurazione di laboratorio regolari. In confronto ad altri metodi di schiarimento solvente come iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear è particolarmente ottimizzata per la rimozione del tessuto adiposo e altri tessuti con alto contenuto di grassi. Il passo di delipidizzazione rimuove completamente i …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Christina Pyrgaki, Tao Tong e Alison North da centro di risorse di Bioimmagini presso la Rockefeller University per assistenza e supporto. Ringraziamo anche Xiphias Ge Zhu per l’editing di film. Questo lavoro è stato supportato da Human Frontier Science programma organizzazione (PC).
Materials
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
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