Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제
Summary
높은 지질 콘텐츠로 인해 지방 조직 전통적인 조직학 방법을 사용 하 여 시각화를 도전 하고있다. Adipo 분명 강력한 라벨 및 지방이 많은 직물의 고해상도 체적 형광 이미징 기술을 삭제 하는 조직 이다. 여기, 샘플 준비, 전처리, 얼룩, 지우기, 및 이미징에 대 한 설치 방법을 설명 합니다.
Abstract
지방 조직 에너지 항상성 및 체온 조절에 중심 역할을 한다. 그것은 다른 유형의 adipocytes, 뿐 아니라 체형 선구자, 면역 세포, 섬유 아 세포, 혈관 및 신경 예측 구성 됩니다. 셀 형식 지정의 분자 제어 하 고 이러한 세포의 상호 작용 점점 입각, 비록이 지방 주민 세포의 보다 포괄적인 이해 그들의 배포 아키텍처를 시각화 하 여 달성 될 수 있다 통해 전체 조직. 기존 immunohistochemistry 면역 형광 접근 지방 조직학 분석을 얇은 파라핀 포함 된 섹션에 의존 합니다. 그러나, 얇은 섹션 조직;의 작은 부분만 캡처 그 결과, 결론 조직의 어떤 부분을 분석 하 여 편견 수 있습니다. 따라서 전체 adipose 조직에 분자 및 세포 패턴의 포괄적인 3 차원 시각화를 허용 기법, Adipo-명확 하 고, 삭제 하는 지방 조직 개발 했습니다. Adipo 클리어 iDISCO에서 적응 / iDISCO +, 특정 수정에 게 완전히 제거 하는 기본 조직 형태를 유지 하면서 조직에 저장 된 지질. 함께 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 여기는 전체 지방 조직의 고해상도 체적 이미지를 Adipo Clear 메서드를 사용 하 여를 설명 합니다.
Introduction
최근까지, 지방이 많은 직물 지방 세포의 비정 질 컬렉션으로의 잉태 했다. 지난 몇 년간 우리의 이해 지금 adipocytes, 체형 선구자의 종류, 면역 세포, 섬유 아 세포, 맥 관 구조, 및 신경 예측을 포함 하는 복잡 한 기관 수를 인식 하는 지방으로 더 정교한 성장 했습니다. 이 지방 주민 세포 간의 상호 작용 효과 지방 조직 및 organismal 생리학 및 이상1발음 있다. 신흥 연구 기본 특정 상호 작용 하는 중요 한 분자 메커니즘 unraveled 있다, 하지만 더 포괄적인 이해 안정적인 구조 프로 파일링 3 차원 (3D)에 전체 조직의 필요 합니다.
지방이 많은 직물 형태학의 우리의 현재 지식은 기반 상대적으로 높은 확대 화상 진 찰 (10 X) 가진 얇은 단면도 (5 μ m)의 조직학 분석2,3. 그러나,이 방법은 몇 가지 중요 한 제한이 있다. 첫째, 복잡 한 등 교감 신경 맥 관 구조, 많은 기능4,5,,67에 중요 한 역할을 알려져 있습니다 filamentous 구조는 평가 하기 어려운 통해 얇은 섹션입니다. 둘째, 겉보기 무 조직 모양 및 대표적인 구조 단위에 초점의 부족, 그것은 지방 조직 구조 섹션 얼룩에 기반으로 감사 어렵다. 셋째, 지방 조직 취득 3D 해 부 재건, 전체 두뇌 형태학8을 연구 하는 데 사용 하는 기존의 방법에 대 한 적합 한 일관 된 직렬 섹션에 과제를 만드는 매우 높은 지질 내용을 있습니다. 이러한 요소를 감안할 때, 아직도 세포 해상도 달성 하면서 전체 지방 서비스 센터의 3D 시각화를 제공할 수 있는 전체-마운트 접근에 대 한 중대 한 필요가 있다.
전체 장기의 3 차원 체적 영상 도전 가벼운 살포의 가려지는 효과 때문 이다. 생물 학적 조직의 빛 분산의 주요 원천이 지질 수성 인터페이스에서 온다. 지질을 제거 하 여 피해를 제거 하는 노력에 대 한 지속적인 세기 왔다, 하지만 많은 수의 최근 혁신9되었습니다. 하나 같은 새로 개발 조직-개간 방법은 용 매 허가 기관의 immunolabeling 기반 3D 이미징 (iDISCO / iDISCO +)10,11. 그러나 지방 조직 특정 도전 주어진 지질 높은 수준을 제공 하는, 따라서는 iDISCO 추가 수정 / iDISCO + 프로토콜 완전히 붕괴에서 조직을 보호 하면서 지질을 추출 하는 데 필요한. 수정된 프로토콜을 개발 했습니다, 지금은 Adipo 클리어 라는 고해상도 체적 영상12에 적합 최적의 투명도 달성 하기 위해 지방이 많은 직물의 메탄올/dichloromethane 기반 delipidation를 사용 합니다. delipidation 단계 크게 표현 endogenously 냉각 형광 단백질 GFP와 RFP, 때문에 immunolabeling에 의해 이러한 단백질의 시각화를 달성 해야 합니다. 전반적으로,이 간단 하 고 강력한 프로토콜 지방 주민 세포의 조직 수준 조직 연구에 적용할 수 있는 개발 하는 동안 체형 조상 세포, 그리고 지방 morphogenesis의 혈통 추적.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipo 명확한 지방 조직, 일반 랩 설치에서 쉽게 실행 될 수 있는 삭제 위한 간단 하 고 강력한 방법입니다. IDISCO 등 다른 용 매 기반 개간 방법 비교 / iDISCO +10,,1112, Adipo 클리어는 특히 지방 조직 및 다른 조직 높은 지방 콘텐츠를 지우기. Delipidation 단계 완전히 지방에서 지질을 제거 합니다 및 따라서 전체 조직에 걸쳐 immunolabeling…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 크리스티나 Pyrgaki, 타오 통, 앨리슨 북쪽에 록펠러 대학 Bioimaging 리소스 센터에서 감사 하 고 지원 합니다. 우리는 또한 영화 편집: Xiphias Ge Zhu 감사합니다. 이 작품에서 인간 프론티어 과학 프로그램 조직 (PC)를 지원 했다.
Materials
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
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