Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi
Summary
Yüksek lipid içeriği nedeniyle yağ dokusu geleneksel histolojik yöntemlerle görselleştirmek için zor oldu. Adipo-temiz sağlam etiketleme ve yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel floresan görüntüleme sağlayan tekniği temizleyerek bir dokudur. Burada, numune hazırlama, ön, boyama, takas ve montaj için görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır.
Abstract
Yağ dokusu enerji homeostazı ve termoregülasyon merkezi bir rol oynar. Adipositler, hem de adipocyte öncüleri, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, kan damarları ve sinir projeksiyonlar farklı türde oluşur. Her ne kadar hücre türü belirtimi moleküler kontrolü ve bu hücreler arasındaki etkileşimle giderek tarif, bu yağ yerleşik hücreler daha kapsamlı bir anlayış, kendi dağıtım ve mimari görselleştirme tarafından elde edilebilir Bütün doku. Adipose Histoloji analiz etmek için varolan immünhistokimya ve ayirt yaklaşımlar üzerinde ince parafin gömülü kısımlar dayanmaktadır. Ancak, ince kesitler doku yalnızca küçük bir bölümünü yakalamak; Sonuç olarak, sonuçları doku hangi bölümünü analiz tarafından önyargılı. Bu nedenle teknik, moleküler ve hücresel kalıplarının kapsamlı üç boyutlu görselleştirme içinde tüm yağ doku izin vermek için Adipo-temiz, takas bir yağ dokusu geliştirdik. Adipo-net iDISCO adapte / iDISCO +, belirli değişiklikler ile yapılan için tamamen doğal doku morfoloji koruyarak doku içinde depolanan lipid kaldırmak. Işık sayfalık floresans mikroskobu ile birlikte, biz burada tüm bir yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüler elde etmek için Adipo-Clear yöntemi kullanımını göstermektedir.
Introduction
Yakın zamana kadar yağ dokusu ve yağ hücrelerinin amorf bir topluluğu olarak tasarlandı. Son birkaç on yıl içinde anladığımız kadarıyla şimdi farklı türde adiposit yanı sıra adipocyte öncüleri, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, damarlara ve sinir projeksiyonlar içeren karmaşık bir organ olduğu kabul yağ ile daha sofistike büyüdü. Bu yağ yerleşik hücreler arasındaki etkileşimler yağ dokusu ve organizma fizyolojisi ve patofizyolojisi1etkileri belirgin. Her ne kadar ortaya çıkan çalışmalar bazı etkileşimler yatan önemli moleküler mekanizmaları sökülmüş, daha kapsamlı bir anlayış tüm doku üç boyutlu (3D) güvenilir yapısal profilleme gerektirir.
Geçerli bilgimizi yağ dokusu morfolojisi histolojik Analize ince kesitler (5 mikron) nispeten yüksek büyütme görüntüleme (daha–dan 10 X) ile büyük ölçüde dayalı2,3. Ancak, bu yaklaşım bazı önemli sınırlamaları vardır. İlk, karmaşık ipliksi yapılar adipose işlev4,5,6,7‘ önemli roller oynamak için bilinir, sempatik sinirler ve damarlara gibi değerlendirmek zordur ince kesitler. İkinci olarak, görünüşte amorf şeklini ve odaklanmak için temsilcisi yapısal birim eksikliği nedeniyle, yalnızca bölüm boyama temel yağ dokusu yapıları takdir etmek zordur. Üçüncü olarak, yağ dokusu 3D anatomik imar, tüm beyin morfoloji8çalışma için kullanılan geleneksel bir yöntem için uygun tutarlı seri bölümler elde etmek zorluklar oluşturma bir çok yüksek lipid içeriğe sahiptir. Bu faktörler göz önüne alındığında, hala hücresel çözünürlük elde ederken tüm yağ depo 3D görselleştirme sağlayabilir bir bütün-mount yaklaşım için büyük bir ihtiyaç var.
3D hacimsel görüntüleme tüm bir organ ışık saçılım belirsiz etkileri nedeniyle meydan okuyor. Biyolojik dokuların içinde ışık saçılım önemli bir kaynağı lipid sulu arabirimlerden geliyor. Çabaları dağılım lipidler kaldırarak ortadan kaldırmak için bir yüzyıl boyunca devam edecek olmasına rağmen çok sayıda son yenilikleri9olmuştur. Bir tür yeni geliştirilen doku Temizleme immunolabeling etkin 3D görüntüleme solvent seçilmemiş organların yöntemidir (iDISCO / iDISCO +)10,11. Ancak, yağ dokusu lipidler, onun yüksek düzeyde verilen belirli bir meydan okuma sunuyor ve bu nedenle, iDISCO ek değişiklikler / iDISCO + Protokolü tamamen çöken gelen doku koruyarak lipidler ayıklamak için gereklidir. Geliştirdiğimiz, şimdi Adipo-temiz, adı değiştirilmiş Protokolü metanol/diklorometan tabanlı delipidation yağ dokusunun en iyi şeffaflık yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüleme12için uygun elde etmek için kullanır. Çünkü büyük ölçüde endogenously ifade quenches floresan proteinler GFP ve RFP gibi delipidation adım, görselleştirme gibi proteinlerin immunolabeling tarafından sağlanmalıdır. Genel olarak, bu basit ve sağlam iletişim kuralı yağ yerleşik hücre, doku düzeyinde organizasyon eğitim için uygulanabilir adipocyte progenitör hücrelerin ve yağ morfogenez soy izleme geliştirme sırasında.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipo-temiz yağ dokusu, normal laboratuar kurulumunda kolayca gerçekleştirilebilir temizlenmesi için bir basit ve sağlam yöntemdir. İDISCO gibi diğer solvent bazlı temizleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear özellikle yağ dokusu ve diğer doku yüksek yağ içeriği ile temizlenmesi için optimize edilmiştir. Delipidation adım lipitler yağ tamamen kaldırır ve bu nedenle …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Christina Pyrgaki, Tao Tong ve Bioimaging Kaynak Merkezi yardım için Rockefeller Üniversitesi’nde kuzeyden Alison teşekkür ediyoruz ve destek. Biz de Xiphias Ge Zhu film düzenleme için teşekkür ederiz. Bu eser insan sınır bilim programı organizasyonu (PC) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
