Adipo-Clear: Een weefsel Clearing methode voor driedimensionale beeldvorming van vetweefsel
Summary
Als gevolg van het hoge vetgehalte, heeft adipeus weefsel is uitdagend om te visualiseren met behulp van traditionele histologische methoden. Adipo-Clear is een weefsel clearing techniek waarmee robuuste labeling en hoge resolutie volumetrische fluorescerende beeldvorming van vetweefsel. Hier beschrijven we de methoden voor de bereiding van de monsters, voorbehandeling, kleuring, clearing en montage voor imaging.
Abstract
Vetweefsel speelt een centrale rol in de homeostase van de energie en thermoregulatie. Het is samengesteld uit verschillende soorten adipocytes, evenals adipocyte precursoren, immune cellen, fibroblasten, bloedvaten en zenuwen projecties. Hoewel de moleculaire controle van cel type specificatie en de wisselwerking van deze cellen hebben steeds zijn afgebakend, kan een vollediger inzicht in deze cellen adipeus-ingezeten worden bereikt door het visualiseren van hun distributie en architectuur gedurende het hele weefsel. Bestaande immunohistochemistry en immunofluorescentie benaderingen voor het analyseren van obesitas histologie is afhankelijk van dunne paraffine-ingebedde secties. Echter, dunne secties vangen slechts een klein gedeelte van weefsel; Dientengevolge, kunnen de conclusies worden beïnvloed door welk deel van weefsel wordt geanalyseerd. Daarom hebben we een adipeus weefsel clearing techniek, Adipo-Clear, om toe te staan uitgebreide driedimensionale visualisatie van moleculaire en cellulaire patronen hele vetweefsel. Adipo-Clear werd aangepast van iDISCO / iDISCO +, met specifieke wijzigingen aangebracht in de lipide opgeslagen in het weefsel met behoud van de morfologie van het oorspronkelijke weefsel volledig te verwijderen. In combinatie met licht vel fluorescentie microscopie tonen we hier het gebruik van de methode Adipo-Clear te verkrijgen van de volumetrische resolutieafbeeldingen van een hele adipeus weefsel.
Introduction
Tot voor kort werd adipeus weefsel opgevat als een amorfe verzameling van vetcellen. In de afgelopen decennia, is ons begrip meer verfijnd, gegroeid met vet nu erkend als een complex orgaan met verschillende soorten adipocytes, evenals adipocyte precursoren, immune cellen, fibroblasten, de therapieën en zenuw projecties. Interacties tussen deze cellen adipeus-ingezeten hebben uitgesproken effecten op vetweefsel en organisch fysiologie en pathofysiologie1. Hoewel opkomende studies hebben ontrafeld belangrijke moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan bepaalde interacties, vereist een vollediger begrip betrouwbare structurele profilering van het hele weefsel in drie dimensies (3D).
Onze huidige kennis van vetweefsel morfologie is grotendeels gebaseerd op histologische analyse van dunne secties (5 μm) met relatief hoge-vergroting beeldvorming (meer dan 10 X)2,3. Deze benadering heeft echter enkele belangrijke beperkingen. Eerste, ingewikkelde filamenteuze structuren zoals sympathische zenuwen en de therapieën, waarvan bekend is dat een belangrijke rol spelen in de obesitas functie4,,5,,6,7, zijn moeilijk te evalueren via de dunne secties. Ten tweede, vanwege zijn schijnbaar amorfe vorm en het gebrek aan representatieve structurele eenheden te concentreren op, het is moeilijk te waarderen adipeus weefsel structuren alleen gebaseerd op sectie kleuring. Ten derde, vetweefsel heeft een zeer hoog vetgehalte, maken van de uitdagingen bij het verkrijgen van consistente seriële secties die geschikt voor 3D anatomische reconstructie, een conventionele methode gebruikt zijn bij het bestuderen van de hele hersenen morfologie8. Gezien deze factoren, is er een grote behoefte aan een geheel-mount aanpak die 3D visualisatie van een hele obesitas depot terwijl nog het bereiken van cellulaire resolutie kan bieden.
3D volumetrische beeldvorming van een gehele orgaan is uitdagend vanwege de verduistert effecten van licht spreiding. Een belangrijke bron van licht spreiding in biologische weefsels komt van lipide-waterige interfaces. Hoewel de inspanningen om te elimineren scatter doordat lipiden lopende voor meer dan een eeuw geweest, zijn er een groot aantal recente innovaties9. Een dergelijk nieuw ontwikkelde weefsel-clearing methode is immunolabeling ingeschakelde 3D beeldvorming van oplosmiddel-gewist organen (iDISCO / iDISCO +)10,11. Vetweefsel kampt echter met een bijzondere uitdaging, gezien zijn hoge niveau van lipiden, en daarom extra wijzigingen in de iDISCO / iDISCO + protocol moeten volledig uittreksel van de lipiden terwijl de bescherming van het weefsel instort. Het gewijzigde protocol die we hebben ontwikkeld, nu genaamd Adipo-Clear, maakt gebruik van methanol/dichloormethaan gebaseerde delipidation van vetweefsel aan het bereiken van optimale transparantie geschikt voor hoge resolutie volumetrische imaging12. Want de delipidation stap grotendeels lest endogeen uitgedrukt fluorescente proteïnen zoals GFP en RFP, moet visualisatie van dergelijke eiwitten worden bereikt door immunolabeling. Globaal, dit eenvoudig en robuust protocol kan worden toegepast om te bestuderen van weefsel-niveau organisatie van adipeus-ingezeten cellen, lineage traceren van adipocyte voorlopercellen, en obesitas morfogenese tijdens de ontwikkeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipo-Clear is een eenvoudige en robuuste methode voor het ontruimen van vetweefsel, die gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd in een regelmatige lab setup. In vergelijking met andere methoden op basis van oplosmiddel clearing zoals iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear is met name geoptimaliseerd voor het ontruimen van vetweefsel en ander weefsel met een hoog vetgehalte. De delipidation stap volledig verwijderd adipeus, lipiden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Christina Pyrgaki, Tao Tong en Alison North uit het Bioimaging Resource Center aan de Rockefeller-universiteit voor hulp en ondersteuning. Wij danken ook Xiphias Ge Zhu voor het bewerken van de film. Dit werk werd gesteund door het Human Frontier Science programma organisatie (PC).
Materials
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
