裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア
Summary
高脂質含量のため従来の組織学的方法を使用して視覚化する脂肪組織にチャレンジしております。裏打ちクリアは、堅牢なラベリングと脂肪組織の高分解能体積蛍光イメージングができるテクニックをクリア組織です。ここでは、試料調製、前処理、染色、クリア、およびイメージング用取付方法をについて説明します。
Abstract
脂肪組織は、エネルギー代謝と体温調節に中心的な役割を果たしています。それは脂肪細胞と同様、脂肪細胞の前駆物質、免疫細胞、線維芽細胞、血管、神経投射の種類で構成されます。その分布と建築の可視化によるこれらの居住者の脂肪細胞のより包括的な理解を実現できますが、特定の細胞の分子制御とこれらの細胞の相互関係をますます線引きされている,全体全体の組織。脂肪組織を分析する既存の免疫組織染色と蛍光抗体法のアプローチは、薄いパラフィン埋め込まれたセクションに依存します。ただし、薄片組織の小さな部分のみをキャプチャします。その結果、結論は組織のどの部分を分析によってバイアスすることができます。したがって全体の脂肪組織における分子・細胞パターンの包括的三次元視覚化を許可する技術、裏打ちクリアをクリア脂肪組織を開発しました。裏打ちクリア iDISCO から適応された/iDISCO + は、特定の変更に対するネイティブの組織形態を維持しながら、組織に格納されている脂質を完全に削除します。光シート蛍光顕微鏡と組み合わせて、ここで全体の脂肪組織の高分解能の 3次元濃淡画像の取得に裏打ちクリア メソッドを使用を示します。
Introduction
最近まで、脂肪組織は、脂肪細胞の非晶質のコレクションとしての考案されました。過去数十年間は、我々 の理解は脂肪の脂肪細胞と脂肪細胞の前駆物質の種類、免疫細胞、線維芽細胞、血管、および神経投射を含む複雑な器官であると認め今より洗練されたきました。これらの居住者の脂肪細胞間の相互作用は、脂肪組織と個体の生理学と病態生理学1に及ぼす影響を発音しています。新興の研究は、特定の相互作用の基礎となる重要な分子メカニズムを解明している、信頼性の高い構造プロファイリング 3 次元 (3 D) で全体の組織のより包括的な理解が必要です。
脂肪組織の形態の私達の現在の知識は薄いセクション (5 μ m) を比較的高倍率 (10 倍以上) の組織学的分析に基づいて2,3。ただし、この方法には、いくつかの重要な制限があります。交感神経や血管、脂肪関数4,5,6,7で重要な役割を再生する知られているなどまず、複雑な糸状構造が評価することは困難薄いセクションで。第二に、その一見アモルファス形状とに集中する代表的な構造の単位の不足、セクション染色のみに基づいて脂肪組織構造を理解することは困難です。第三に、脂肪組織が 3 D 解剖学的再建、従来の全脳形態8を研究するために使用に適した一貫性のある連続切片を得ることに課題を作成する、非常に高い脂質含量です。これらの要因を考えると、携帯電話の解像度を実現しながら全体の脂肪デポの 3次元可視化を提供することができますマウント全体アプローチのための大きい必要性があります。
臓器全体の体積の 3 D イメージングによる光の拡散効果のあいまいに挑戦しています。生体内光散乱の主な原因は、脂質水溶液の界面から来ています。脂質を除去することによって散乱を除去するために努力は、世紀以上にわたっての継続されていますが、最近の技術革新の9の数が多いがありました。そのような新しく開発された組織のクリア メソッドは溶媒消去臓器の反応が有効な 3 D イメージング (iDISCO/iDISCO +)10,11。ただし、脂肪組織が脂質の高レベルを与えられた特定の課題を提示し、したがって、iDISCO に修正を加える/iDISCO + プロトコルは完全に崩壊から組織を保護しながら脂質を抽出するために必要な。裏打ち-クリアと呼ばれる、開発した修正されたプロトコルでは、高分解能体積画像12に適した最適な透明度を達成するために脂肪の脱脂をメタノール/ジクロロ メタン ベースを採用しています。脱脂は、GFP や RFP など主として内生表現渇き蛍光タンパク質ステップので、そのようなタンパク質の可視化は、反応によって達成されなければなりません。全体的にみて、このシンプルで堅牢なプロトコルは居住者の脂肪細胞の組織レベルの組織を研究に適用できる脂肪細胞の前駆細胞と脂肪の形態の開発中にトレースする血統。
Protocol
Representative Results
Discussion
裏打ちクリアは正規のラボ環境のセットアップで簡単に行うことができる脂肪をクリアするための簡単かつ堅牢なメソッド。IDISCO など他の溶剤ベースの清算方法と比較して/iDISCO +10、11,12、裏打ちクリア、特に脂肪組織と他の組織と高脂肪の内容をクリアに最適化されています。脱脂ステップ脂肪から脂質を完全に削除し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
クリスティーナ ピルガキ、タオ トンとアリソン北支援のロックフェラー大学のバイオ リソース センターから感謝し、サポートします。我々 はまた、動画編集のため Xiphias Ge 朱を感謝します。この作品は、人間フロンティア科学プログラム組織 (PC) によってサポートされていました。
Materials
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
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