ADIPO ясно: Ткани, очистка метод для трехмерных изображений жировой ткани
Summary
Из-за содержания высоким липидов жировой ткани была сложной для визуализации с использованием традиционных гистологических методов. ADIPO-ясно является очистка техника, позволяющая надежной маркировки и высоким разрешением объемные флуоресцентных изображений жировой ткани ткани. Здесь мы описываем методы для пробоподготовки, предварительной обработки, окраски, очистки и монтажа для воображения.
Abstract
Жировой ткани играет центральную роль в энергетического гомеостаза и терморегуляции. Он состоит из различных типов адипоциты, а также Адипоцит прекурсоров, иммунных клеток, фибробластов, кровеносных сосудов и нервных прогнозов. Хотя молекулярный контроль спецификации типа клеток и как взаимодействуют эти клетки были более разграничены, более полное понимание этих клеток жировой резидент может быть достигнуто путем визуализации их распределения и архитектура на протяжении всей ткани. Существующие подходы иммуногистохимии и иммунофлюоресценции для анализа жировой гистология полагаются на парафин врезанных шлифов. Однако шлифов захватить только небольшую часть ткани; в результате выводы могут быть предвзятым, какая часть ткани анализируется. Поэтому мы разработали жировой ткани, очистка техника, Adipo-ясно, чтобы разрешить всеобъемлющей трехмерной визуализации молекулярных и клеточных структур в целом жировой ткани. ADIPO-ясно был адаптирован от iDISCO / iDISCO +, с конкретными изменениями до полностью удалить липидов, хранящиеся в тканях при сохранении собственных тканей морфологии. В сочетании с свет лист флуоресцентной микроскопии мы здесь демонстрируют использование метода Adipo-Clear для получения объемного изображения с высоким разрешением всего жировой ткани.
Introduction
До недавнего времени, жировой ткани был задуман как аморфный коллекции жировых клеток. За последние несколько десятилетий наше понимание выросло более сложные, с жиром, теперь признается сложный орган, содержащих различные типы адипоциты, а также Адипоцит прекурсоров, иммунных клеток, фибробластов, сосудистую и нерва прогнозы. Взаимодействие между эти клетки жировой резидентов произнесли воздействие на научные физиологии и патофизиологии1и жировой ткани. Хотя новые исследования разгадана важные молекулярные механизмы, лежащие в основе некоторых взаимодействия, более полное понимание требует надежных структурных профилирования всей ткани в трех измерениях (3D).
Наши текущие знания о морфологии жировой ткани во многом основывается на гистологический анализ тонких секций (5 мкм) с относительно высокого увеличения изображений (более чем 10 X)2,3. Однако этот подход имеет несколько существенных ограничений. Во-первых, замысловатые нитевидные структуры, такие как симпатические нервы и сосудистую, которые, как известно, играют важную роль в жировой функция4,5,6,7, трудно оценить через тонкие разделы. Во-вторых благодаря его казалось бы аморфной форме и отсутствие представителей структурных подразделений сосредоточиться на, трудно оценить жировой ткани структуры, основанные только на раздел пятнать. В-третьих жировая ткань имеет содержание очень высоким липидов, создавая проблемы в получении последовательной серийный секций, которые подходят для 3D анатомические реконструкции, традиционным методом, используется для изучения морфологии весь мозг8. Учитывая эти факторы, существует большая потребность в целом гора подход, который может обеспечить 3D визуализация всего жировых депо по-прежнему достигая сотовой резолюции.
3D объемного изображения всего органа является сложной задачей вследствие сокрытия эффекта рассеивания света. Основным источником рассеяние света в биологических тканях происходит от липидов водный интерфейсов. Хотя усилия по ликвидации разброса, удалив липиды были постоянной для более века, было большое количество последних инноваций9. Один из таких недавно разработанный метод ткани очистка является immunolabeling с поддержкой 3D визуализации растворителя очищены органов (iDISCO / iDISCO +)10,11. Однако, жировой ткани представляет собой особую проблему, учитывая ее высокий уровень липидов и, следовательно, дополнительные изменения в iDISCO / iDISCO + протокола обязаны полностью извлечь липиды защищая ткани от разрушения. Измененный Протокол, которую мы разработали, теперь называется Adipo-ясно, работают на основе метанол/дихлорметан delipidation жировой ткани для достижения оптимальной транспарентности подходит для высокого разрешения объемных изображений12. Потому что delipidation шаг во многом утоляет эндогенно выразил флуоресцентные белки, например GFP и ППП, визуализации таких белков должна быть достигнута путем immunolabeling. В целом, это простой и надежный протокол могут быть применены для изучения тканевом уровне Организации клеток жировой резидент, трассировки линии Адипоцит прогениторных клеток и жировой морфогенеза во время разработки.
Protocol
Representative Results
Discussion
ADIPO-ясно-это простой и надежный метод для очистки жировой ткани, который может быть легко выполнена в регулярных лабораторной установки. По сравнению с другие методы расчистки на основе растворителей, таких как iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-ясно о?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Pyrgaki Кристина, Тао Тонг и Элисон север от Bioimaging ресурсный центр Университета Рокфеллера для помощи и поддержки. Мы также благодарим Xiphias Ge Чжу для редактирования фильмов. Эта работа получила поддержку от человека пограничной науки программы Организации (PC).
Materials
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
