Summary
בשל התכנים שומנים גבוהה בדם, מאתגרת רקמת שומן להמחיש היסטולוגית בשיטות מסורתיות. Adipo-ברור הוא רקמה פינוי טכניקה המאפשרת תיוג חזקים, דימות ברזולוציה של פלורסנט הנפחי של רקמת שומן. כאן, אנו מתארים את שיטות הכנת הדוגמא, רעלני, מכתים, ניקוי של הרכבה עבור הדמיה.
Abstract
רקמת שומן ממלאת תפקיד מרכזי אנרגיה הומאוסטזה ומתת הומיאותרמיות. הוא מורכב מסוגים שונים של adipocytes, וכן סימנים מקדימים adipocyte תאים חיסוניים, fibroblasts, כלי דם, עצבים תחזיות. למרות שליטה מולקולרית של התא סוג מפרט ואת האינטראקציה תאים אלה יש כבר יותר ויותר התחום, הבנה מקיפה יותר של תאים אלה שוכנות שומן יכולה להיות מושגת דמיין שלהם הפצה ואדריכלות לאורך כל הרקמה שלם. אימונוהיסטוכימיה קיימות גישות immunofluorescence לנתח היסטולוגיה אדיפוז להסתמך על סעיפים פרפין-מוטבע דק. עם זאת, חלקים דקים ללכוד רק חלק קטן של רקמה; כתוצאה מכך המסקנות עלולים להיות מוטים על ידי ניתוח מה החלק של רקמות. לכן פיתחנו של רקמת שומן פינוי טכניקה, Adipo-נקי, להתיר ויזואליזציה תלת-ממדית מקיפה דפוסי מולקולרית, תאית ברקמות adipose שלם. Adipo-ברור היה ממאמרו של iDISCO / iDISCO +, עם שינויים מסוימים שבוצעו כדי להסיר לחלוטין את השומנים מאוחסן ברקמות תוך שמירה על מורפולוגיה רקמה מקורית. בשילוב עם מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, נדגים כאן את השימוש בשיטת Adipo פנוי כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה הנפחי של רקמת שומן כולו.
Introduction
עד לאחרונה, רקמת שומן היה יזום של כמו אוסף אמורפי של תאי שומן. במהלך העשורים האחרונים, ההבנה שלנו גדלה מתוחכמים יותר, עם שומן שהוכר להיות איבר מורכבים המכילים סוגים שונים של adipocytes, כמו גם סימנים מקדימים adipocyte, תאים חיסוניים, fibroblasts, להערכת ו עצבים תחזיות. אינטראקציות בין תאים אלה שוכנות שומן יש מבטאים את ההשפעות על רקמת שומן, הפיזיולוגיה organismal, פתופיזיולוגיה1. למרות מחקרים המתעוררים יש פרם חשוב המנגנונים המולקולריים שבבסיס אינטראקציות מסוימות, הבנה מקיפה דורש פרופילים מבניים אמין של הרקמה כולו בתלת מימד (3D).
הידע הנוכחי שלנו של רקמת שומן מורפולוגיה מבוססת במידה רבה על ניתוח היסטולוגית סעיפים דקים (5 μm) עם הדמיה ההגדלה גבוהה יחסית (יותר מ 10 X)2,3. עם זאת, גישה זו יש מספר מגבלות משמעותיות. מבנים filamentous הראשון, מורכבות כגון העצבים הסימפתטית, להערכת את, אשר ידועים תפקיד חשוב הפונקציה אדיפוז4,5,6,7, שקשה להעריך באמצעות סעיפים דקים. שנית, בשל צורתה לכאורה אמורפי ואת חוסר נציג יחידות המבניים להתמקד, קשה להעריך את רקמת שומן מבנים המבוססת רק על סעיף מכתים. שלישית, רקמת שומן יש תוכן שומנים בדם גבוהה מאוד, יצירת אתגרים בהשגת עקבי מקטעים טורי המתאימים לטיפול שיקום אנטומי תלת-ממד, שיטה המקובלת ללמוד כל המוח מורפולוגיה8. בהינתן הגורמים הללו, יש צורך בגישה כולה-הר זה יכול לספק לוויזואליזציה תלת-ממדית של דיפו אדיפוז כולו תוך השגת עדיין את הרזולוציה הסלולר.
נפחי הדמיה ממוחשבת של איבר שלם הוא מאתגר בשל ההשפעות טשטוש של פיזור אור. המקור העיקרי של פיזור אור ברקמות ביולוגיות נובע ממשקים השומנים-מימית. למרות מאמצי ההכחדה של פיזור על-ידי הסרת שומנים כבר מתמשך עבור מעל למאה שנה, היו מספר רב של החידושים האחרונים9. אחת השיטות ניקוי רקמות פיתח כזה היא מאופשר immunolabeling הדמיה תלת-ממדית של איברים הממס-והפנים (iDISCO / iDISCO +)10,11. עם זאת, רקמת שומן מהווה אתגר מסוים נתון רמה גבוהה של שומנים, ולכן, שינויים נוספים iDISCO / iDISCO + פרוטוקול נדרשים באופן מלא תמצית ליפידים תוך הגנה על הרקמה מפני קריסה. פרוטוקול ששונה שפיתחנו, כעת נקרא Adipo-נקי, מעסיקה מבוססת על מתנול/דיכלורומתאן delipidation של רקמת שומן כדי להשיג שקיפות אופטימלית מתאים דימות ברזולוציה גבוהה הנפחי12. כי delipidation צעד בעיקר מרווה endogenously הביע פלורסנט חלבונים כמו GFP ו- RFP, ויזואליזציה של חלבונים כזאת חייבת להיות מושגת על ידי immunolabeling. בסך הכל, פרוטוקול זה פשוט וחזק יכול להיות מיושם ללמוד רקמות ברמת הארגון של תאי שומן-תושב, עקיבה השושלת adipocyte ובתאים, מורפוגנזה אדיפוז במהלך הפיתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפול בבעלי חיים וניסוי בוצעו על פי הנהלים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה ב אוניברסיטת רוקפלר.
1. רקמות הכנה
- לבצע זלוף intracardiac רגיל ~ 20 מ של 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 ° C עד שהדם יוסר לחלוטין הרקמה.
- לעבור את perfusate ~ 20 מ"ל של פתרון מקבע (4% paraformaldehyde (PFA) ב 1 x PBS) ב 4 ° C עד הצוואר ואת הזנב באופן משמעותי התקשח.
התראה: PFA רעיל. יש להימנע ממגע עם העור, העיניים, קרום רירי. פתרונות צריכה להיעשות בתוך ברדס fume. - לנתח את רפידות השמן עניין בקפידה כדי להסיר את משטח שמן כולו ללא פגיעה בו. השתמש הסתיימה בלאנט מלקחיים כדי להימנע צובט או לסחוט את הרקמה. להימנע מזיהום הרקמה ביתור עם כל פרווה.
- פוסט-לתקן את הרקמה 4% מחברים ב- PBS 1 x לילה ב 4 º C. עבור כל כרית השומן, שלאחר לתקן עם ~ 10 מ של פתרון קיבוע צינור חרוטי 15 מ"ל.
- לשטוף את הרקמה 3 פעמים (1 h כל) עם 1 x PBS בטמפרטורת החדר (RT).
- לאחסן את הרקמה עבור לטווח קצר (עד שבועיים) 1 x PBS ב 4 ° C, מוגן מפני אור. לאחסון לטווח ארוך (למשל, 1-2 שנים), לעבור את המאגר PBS x 1 עם אזיד הנתרן 0.05% (כמו כחומר משמר).
התראה: אזיד הנתרן הוא רעיל מאוד כאשר בלע בעל פה או נספג דרך העור. אזיד הנתרן פתרונות (ב-5% או יותר) צריך להיות מטופל ברדס fume מרוכזת.
2. Delipidation, Permeabilization
עיתוי: 1-2 ימים
- הכנת 20%, 40%, 60% ו- 80% מתנול מעבר צבע עם מאגר B1n, (טבלה 1) (v/v), למשל, עבור מאגר 20% מתנול/B1n, לערבב 20 מ של מתנול 80 מ ל מאגר B1n. לאחסן כל מאגרי ב 4 º C. גליצין קריסטלים לזרז ממאגרים מתנול/B1n 60% ו- 80% עקב הרוויה. הימנעו הקריסטלים; השתמש הפתרון נוזלי שוטף הבאים.
התראה: מתנול הוא הפכפך, מגרה. הימנע העור או קשר עין. - הסר בעדינות את השיער הדגימה במיקרוסקופ לנתיחה. כל השיער, מוך או פסולת המצורפת המדגם יגרום צללים במהלך דימות. להעביר את הדגימה נקי לתוך צינור חדש.
- לבצע את כל הצעדים הבאים על קרח או ב 4 ° C אלא אם צוין אחרת. עבור מדגמים קטנים (למשל, אחורי רפידות שומן תת עורית/perigonadal של עכברים צעירים רזה), השתמש צינורות microcentrifuge 2 mL מ ל 1.6 של הפתרון. עבור מדגמים גדולים או דגימות עם תוכן שומני גבוהה (למשל, רפידות השמן מן העכברים המשמינים), השתמש מ ל צינורות עם 4 מ"ל של הפתרון.
- מקום הצינורות המכילים את הדגימות בצורה אופקית על תפקודי לב / נשימה שוכן בגובה ~ 100 סל"ד. ודא כי הדגימות יכול לנוע בחופשיות בתוך הצינור.
- מייבשים את הדגימה בסדרה מדורגת של 20%, 40%, 60%, 80% ו- 100% מתנול/B1n מאגר עבור הזמן המצוין (טבלה 2). מזער את הפתרון carry-over.
- Delipidate הדגימה עם 100% דיכלורומתאן (DCM) (3 פעמים), כל אחד עם זמן הדגירה שצוינו בטבלה 2. הדגימה יש לשקוע לתחתית הצינור בסוף מנקי DCM השני והשלישי. אם לא, ולהאריך את זמן הדגירה כדי להבטיח delipidation מלאה (למשלמ- 30 דקות להאריך h 1-2).
התראה: צריך להיות מטופל DCM בתוך ברדס fume. השתמש מיכלי זכוכית צינורות microcentrifuge ואחסון אשר עשויות פוליפרופילן עבור incubations. הצינורות microcentrifuge אין להשתמש לאחסון לטווח ארוך של DCM. צלחות פטרי, פיפטות סרולוגית שנעשו מפוליסטירן אינם תואמים DCM. DCM הוא המרבץ. להעביר את הדגימה אל פתרון טריים במהירות כדי למנוע לייבוש. - לשטוף פעמיים עם 100% מתנול עבור הזמן המצוין (טבלה 2).
- אופציונלי: אם המדגם הוא לא perfused היטב, הצבע של המוגלובין של כדוריות דם אדומות הנותרים עלול לגרום autofluorescence חזק. אקונומיקה עם 5% H2O2 ב מתנול (1 נפח של 30% H2O2 כדי כרכים 5 של מתנול) בן לילה ב 4 º C.
- נתרענן המדגם בסדרה מאגר מתנול הפוכה/B1n: 80%, 60%, 40%, 20% מתנול/B1n ו- 100% B1n מאגר (פי 2) עבור הזמן המצוין (טבלה 2).
- לשטוף את הדגימה עם מאגר PTxwH (טבלה 1) עבור 2 h-RT.
- לאחסן את הדגימה delipidated במאגר PTxwH ב 4° C (עד 1 שנה) או להמשיך מיד לשלב immunostaining.
3. כל הר Immunostaining
עיתוי: 8-10 ימים
הערה: כל השלבים הבאים צריך להתבצע ב RT אלא אם כן צוין אחרת, עם טלטול והגנה מפני אור. עבור מדגמים קטנים, השתמש צינורות microcentrifuge 2 mL מ ל 1.6 של פתרון. עבור מדגמים גדולים, להשתמש מ ל צינורות עם 4 מ"ל של פתרון. מומלץ לאמת תחילה את הנוגדנים על חתיכות קטנות של רקמות או מקטעי רקמת שטופלו מתנול.
- לדלל נוגדן ראשוני במאגר PTxwH לריכוז המומלץ. Centrifuge הפתרון מדולל נוגדנים ב ~ 20,000 g x 10 דקות למנוע מציגה פוחת משקעים נוגדן או הסיכומים.
- תקופת דגירה הדגימה delipidated עם הפתרון נוגדן ראשוני של הזמן המצוין (טבלה 2).
- לשטוף את הדגימה עם מאגר PTxwH בסדרה של צעדים דגירה: 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 20 דקות, 1 h, 2 h, 4 שעות ו בן לילה.
- לדלל הנוגדן משני במאגר PTxwH לריכוז המומלץ. Centrifuge הפתרון מדולל נוגדנים ב x ~ 20,000 g 10 דקות למנוע מציגה פוחת משקעים נוגדן או הסיכומים.
הערה: כדי להימנע רקע הנגרמת על ידי רקמת autofluorescence, נוגדנים משניים מצומדת עם fluorophores הפולטות אור אזורים מרחיקת אדום ואדום מומלץ. בהתאם למספר קווי לייזר זמין על המיקרוסקופ, יכול לדימות עד 3-4 סמני בו-זמנית בדוגמא אחת. - תקופת דגירה הדגימה עם הפתרון נוגדנים משניים של הזמן המצוין (טבלה 2).
- לדוגמה תשטוף עם מאגר PTxwH בסדרה של צעדים דגירה: 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 20 דקות, 1 h, 2 h, 4 שעות ו בן לילה.
- אופציונלי: עבור סוגי רקמות הם שבירים, לתקן את הרקמה ויטראז'ים עם 4% מחברים ב- 1 x PBS לילה ב 4 ° C כדי לעזור לשמר את רקמת מורפולוגיה.
הערה: שלב זה עשוי להגדיל את הרקע הדמיה. אין צורך לבצע שלב זה של רקמת שומן. - לשטוף את הדגימה עם PBS 1 x בסדרה של צעדים דגירה: 5 דקות, 10 דקות ו- 30 דקות.
- הסר בעדינות מוך הדגימה במיקרוסקופ לנתיחה.
4. רקמות סליקה
עיתוי: 1-2 ימים
- אופציונלי: להטביע את הדגימה agarose כדי להקל על מדגם הרכבה של מיקרוסקופ אור גיליונות.
הערה: שלב זה מומלץ בחום רקמת שומן לייצב את צורתה במהלך דימות.- הכינו את הפתרון ההטבעה עם 1% agarose ב x 1 PBS (w/v). מגניב הפתרון ההטבעה ~ 40 ° C כדי למנוע חשיפת המדגם לחום מוגזם.
- למקם את הדגימה נקי לתוך תבנית (למשל, פטרי או שקילה הסירה) ולסדר אותו אל המיקום הרצוי. הימנע כל דחויים נוזלי. שופכים בעדינות את הפתרון ההטבעה המדגם. להימנע בועות אוויר.
- תן את agarose באופן מלא לחזק ב RT. לחתוך החוצה גוש המכיל את הדגימה.
הערה: כל השלבים הבאים כולל לילה incubations צריכה להתבצע ב- RT, עם טלטול והגנה מפני אור. עבור מדגמים קטנים, השתמש צינורות microcentrifuge 2 mL מ ל 1.6 של פתרון. עבור מדגמים גדולים, להשתמש מ ל צינורות עם 4 מ"ל של פתרון.
- מייבשים את הדגימה מתנול הצבע ב- H2o: 25%, 50%, 75% ו 100% (3 פעמים) עבור הזמן המצוין (טבלה 2).
הערה: מדגם ניתן יהיה להשאיר למשך הלילה בשלב 100% מתנול. - דגירה המדגם ב- 100% DCM עבור h 1 ברעידות (3 פעמים). לדוגמה יש לשקוע לתחתית הצינור בסוף כל כביסה DCM. אם לא, ולהאריך את זמן הדגירה כדי להבטיח הסרה מלאה של מתנול. לדוגמה ניתן יהיה להשאיר למשך הלילה בשלב DCM 100%.
- דגירה המדגם של אתר dibenzyl (אנגלית) בן לילה ברעידות מתון כדי להשיג שבירה תואמים.
הערה: מדגם בסופו של דבר יהפוך שקוף בהאור הנראה.
שים לב: מדיניות ה. הוא דבר מסוכן הימנע מכל מגע עם העור. בתוך ברדס fume עם כפפות שכבות כפול להתמודד עם זה... למחוק את הכפפות ברגע מזוהם עם אנגלית. השתמש מיכלי זכוכית עבור אחסון של microcentrifuge צינורות (פוליפרופילן) עבור incubations. הצינורות microcentrifuge אין להשתמש לאחסון לטווח ארוך של אנגלית. צלחות פטרי, פיפטות סרולוגית שנעשו מפוליסטירן אינן תואמות עם אנגלית. נקה כל נוזלים עם 100% אתנול. - דגירה הדגימה עם אנגלית טריים עם קלה רועד עבור חנות ה 2 דגימת ה-RT בחושך או להמשיך ישירות הדמיה.
הערה: דגימות מומלצים לדימות תוך חודש. למרות fluorophores מסוימים יציב יותר מאשר לאחרים, אחסון לטווח ארוך של הדגימות בשלב זה לא מומלץ.
5. מיקרוסקופ
- הדמיה עם מיקרוסקופ אור גיליונות התואמת אנגלית.
הערה: המטרות רק כי הם מאושר דימות מבוסס הממס האורגני והתאמתי מקדם שבירה של אנגלית יכול לשמש כמו טבילה מטרות בתחום ההדמיה מדיניות ה-שקוע.- הר מדגם agarose-מוטבע על גבי בעל שיכול למנוע תנועה במהלך דימות. לטבול את הדגימה לתא יהיה מלא.
- לאסוף ערימה-z כיסוי המדגם כולו (למשל, 1-2 X הגדלה) כדי להשיג כל רקמה/מבנה ההפצה של סמן עניין.
- לעבור אובייקטיבית עם הגדלה גבוהה יותר (למשל, 4-12 X הגדלה) כדי להגדיל האזורים לעניין התמונה מבני נתונים היסטוריים.
הערה: קולגן היא לתורם המרכזי מטריצה חוץ-תאית של רקמת שומן, המקיף את תאי השומן כל13. קולגן יש ספקטרום פליטה אופייני הנע בסביבות 400 nm 550 ננומטר14. הדמיה הדגימה עם קו לייזר 488 (ירוק) ואיסוף האור הנפלט בטווח אורך גל שנמצאת בתוך ספקטרום הפליטה של קולגן (למשל, 525-550 ננומטר) תספק את האות autofluorescence רקמות, אשר היה בעבר הראו ניסחו תאי השומן מתאר ורקמת הכולל אדריכלות12.
- הדמיה עם הפוך קונאפוקלית או מיקרוסקופ שני הפוטונים.
- למקם את הדגימה agarose-מוטבע שקופית קאמרית עם חלק תחתון זכוכית בלי לגעת בכל חלקי פלסטיק (או הקאמרית של דימות אחרים התואמים ליהיה זה יכול לאטום). ודא כי מדיניות ה לא ידלוף.
- לבחור את המטרות עם עובד למרחקים ארוכים כדי להשיג חדירה עמוקה יותר.
הערה: הדמיה צריך להיעשות עם מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים הפוך דרך קרקעית זכוכית של השקופית קאמרית. יש למנוע מגע ישיר בין המדגם לבין טובלים המטרות כי לא מוצעות עבור דימות מבוסס מדיניות ה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פנוי Adipo מוכן כל שומן רפידות יכול לדימות תלת-ממד כדי לנתח כמה אינטראקציות סלולרי ומורפולוגיה רקמות מושפעות בארה ב רזה והשמנה. בשיטה זו ניתן להחיל בקלות כדי לנתח מבנה אדיפוז כללי על ידי איסוף האות autofluorescence רקמות בערוץ ירוק. אנחנו בעבר הראו כי autofluorescence את אות בכיסויי אדיפוז בחיוב עם perilipin מכתים, סמן נפוץ חלוקה לרמות adipocytes בוגר12. לדוגמה, סריקה האחורי תת עורית השמן פנקס (psWAT) באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות עם הגדלה נמוכה (1.3 X) מציג הארגון lobular של adipocytes (איור 1 א' וב'). מידע מפורט יותר, כגון גודל adipocytes, יכול להתגלות על ידי התקרבות אל האזורים עניין עם הגדלה גבוהה יותר (4x) (איור 1C ו- D).
פנוי Adipo שימושי במיוחד להמחשת filamentous מבנים כגון תחזיות העצבים וכלי הדם, אשר הם מאתגר ללכוד או מעקב על סעיפים דקים. מערכת העצבים הסימפתטית (SNS) ממלא תפקיד מכריע בשליטה lipolysis, התרמוגנזה רקמת שומן4,5. הדמיה כרית psWAT מוכתם hydroxylase טירוזין (ה), סמן SNS, חושף את המבנים המופיעים חבילות עצב גדול, העצבוב כלי דם, וכן arborization מסוף צפופה ב- parenchyma רקמות (איור 2 א-H). בנוסף, תאנון + ההקרנות parenchymal להציג ווריאציה אזורית בתוך psWAT, עם החלק מפשעי בעל צפיפות גבוהה יותר ביחס לחלק dorsolumbar (איור 2E-H; הסרט משלים 1). העבודות הקודמות שלנו הוכיחה כי arborization מסוף SNS יוכל להימצא שהמפתחות שיחזר באמצעות הכלי FilamentTracer של תוכנת Imaris כדי להעריך את הצפיפות של העצבוב12.
רקמת שומן ידוע להיות vascularized בכבדות. השינויים בדרישות מטבולי של אדיפוז הקשורים לעתים קרובות עם שיפוץ דינמי של6,שלה להערכת7. חזקה ומהירה בניית פרופיל של כל רקמה להערכת יכולה לספק ניתוח מוטים נוספים עבור שיפוץ כלי דם. באמצעות טסיות תא אנדותל אדהזיה מולקולה (PECAM-1, המכונה גם CD31) כסמן לכלי הדם תווית, הבחנו כי כל adipocytes נמצאים הנימים לאורך כל הרקמה שלם (איור 3 א-H; 2 הסרט משלים), תמיכה הביקוש הגבוה יעיל חומרי מזון וחמצן להחליף בשומן.
תאים חיסוניים הם מרכיב חיוני אחר של רקמת שומן. במצב מהשמנת יתר, רקמת שומן הופך דלקתי, אשר מלווה החדירה של מקרופאגים הפרו דלקתיים בצורת "דמוי כתר" מבני המקיפים מת adipocytes15,16. רפידות שומן מחיות שמנים קשים במיוחד לנקות בשל שלהם גודל גדול ותוכן שומנים בדם גבוהה יותר. עם זאת, גירסה מורחבת של Adipo פנוי (המתוארים בטבלה מס ' 2 רקמות גדולות או רקמות עם תכולת שומן גבוהה) ניתן להשיג סליקה עקבית של רקמות כל גבוהה-ומשמין. לדוגמה, epididymal שומן מן עכבר נמאס 16 שבועות של תזונה עתירת שומן מראה צפוף "דמוי כתר מבנים", immunolabeled על ידי CD68, לאורך כל הרקמה שלם (איור 4A ו- B). חשוב לציין, פרקים אופטי השתלטו מזוויות שונות כל עומק הרקמה (~ 4-5 מ מ) הצג תמונות, הממחיש ניקוי מוחלט של הרקמה (איור 4C-F) חדות באותה מידה.
איור 1: ניתוח של מורפולוגיה רקמת שומן באמצעות האות autofluorescence. כל הלוחות הם אור גיליון פלורסצנטיות מיקרוסקופ (LSFM) תמונות של רכיב pad psWAT מוכן Adipo פנוי מבודד מן העכבר הגברית C57Bl/6J בן שבוע 8 ב- RT. האות autofluorescence נאסף על-ידי סריקת המדגם שנוקה לערוץ הצבע הירוק. סעיפים אופטי (חתכים מהאמצע של המדגם) של אזור dorsolumbar (א) ובאזור במפשעה (B) נלקח על ידי המטרה X 1.3. (C, D) ההגדלה גבוהה (4x) סעיפים אופטי של האזורים מסגרת של A ו- B. בלוטות הלימפה מסומנים על ידי כוכביות. גודל ברים הם הצביעו על כל לוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: 3D הדמיה של אוהדת העצבוב של רקמת שומן. כל הלוחות הם תמונות LSFM של psWAT המסומנת hydroxylase טירוזין (ה) (באותה דגימת זרע כמו איור 1). תחזיות המרבי של אזור dorsolumbar המשוחזרת (א) ואיזור במפשעה (B) נלקח על ידי המטרה X 1.3. (C, D) סעיפים אופטי מהאמצע של A ו- B. (E, F) ההגדלה גבוהה (4x) סעיפים אופטי של האזורים מסגרת של C ו- D. (G, H) גבוהה-הגדלה אופטית סעיפים הכיסוי בין תאנון (ירוק) autofluorescence (מגנטה). ראשי חצים מצביעות על דפוסים ברורים של העצבוב סימפטי: צרור עצבים (1); (2) העצבוב כלי דם; (3) עם arborization. בלוטות הלימפה מסומנים על ידי כוכביות. גודל ברים הם הצביעו על כל לוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: 3D הדמיה של כלי דם בתוך רקמת שומן- כל הלוחות הם תמונות LSFM של CD31 הנקרא psWAT (באותה דגימת זרע כמו איור 1). (A, B) תחזיות המרבי של אזור dorsolumbar המשוחזרת (א) ואיזור במפשעה (B) נלקח על ידי המטרה X 1.3. (C, D) סעיפים אופטי מהאמצע של A ו- B. (E, F) ההגדלה גבוהה (4x) סעיפים אופטי של האזורים מסגרת של C ו- D. (G, H) גבוהה-הגדלה אופטית סעיפים הכיסוי בין CD31 (אדום) autofluorescence (ציאן). בלוטות הלימפה מסומנים על ידי כוכביות. גודל ברים הם הצביעו על כל לוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: הדמיה תלת-ממדית של "מבני דמוי כתר" רקמת שומן- כל הלוחות הם תמונות LSFM של רכיב pad eWAT מוכן Adipo פנוי מבודד עכבר זכר נמאס בשומן במשך 16 שבועות. המדגם היה immunolabeled עם CD31 ו- CD68. (A, B) תחזיות המרבי של המדגם המשוחזרת עם עומק הכולל של יותר מ- 4 מ מ. (א) X-Y בתצוגה. נוף Y-Z (B) . (C-F) סעיפים אופטי מן המעמקים שצוין ב- B. גודל ברים הם הצביעו על כל לוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מאגר | כימית | ריכוז סופי |
| מאגר B1n | ||
| גליצין | 0.3 M | |
| טריטון X-100 | 0.1% (v/v) | |
| H2O | תמיסה # הממס | |
| אזיד הנתרן (חומר משמר, אופציונלי) | 0.01% (w/v) | |
| להתאים את ה-pH 7 עם NaOH | ||
| מאגר PTxwH | ||
| 10 x PBS | 1 x | |
| טריטון X-100 | 0.1% (v/v) | |
| Tween 20 | 0.05% (v/v) | |
| הפארין | 2 µg/ml | |
| H2O | תמיסה # הממס | |
| אזיד הנתרן (חומר משמר, אופציונלי) | 0.01% (w/v) |
טבלה 1: רשימת מאגרים ופתרונות. טבלה זו מכילה מתכונים המאגרים בשימוש Adipo-נקי. לאחסון לטווח ארוך של מאגרי, מומלץ להוסיף אזיד הנתרן כחומר משמר.
| מאגר | רקמה קטנה | רקמות גדולות (או עם תכולת שומן גבוהה) | טמפרטורה |
| 20% מתנול/B1n מאגר | 30 דקות | 1 h | 4° C |
| 40% מתנול/B1n מאגר | 30 דקות | 1 h | 4° C |
| מאגר מתנול/B1n 60% | 30 דקות | 1 h | 4° C |
| 80% מתנול/B1n מאגר | 30 דקות | 1 h | 4° C |
| . מאה אחוז מתנול | 30 דקות | 1 h | 4° C |
| DCM | 30 דקות | 1 h | 4° C |
| DCM | 1 h | 2-3 h, או לילה | 4° C |
| DCM | 30 דקות | 2 h | 4° C |
| . מאה אחוז מתנול | 30 דקות | 1 h | 4° C |
| . מאה אחוז מתנול | 30 דקות | 1 h | 4° C |
| אופציונלי: 5% H2O2/methanol | בן לילה | בן לילה | 4° C |
| 80% מתנול/B1n מאגר | 30 דקות | 1 h | 4° C |
| מאגר מתנול/B1n 60% | 30 דקות | 1 h | 4° C |
| 40% מתנול/B1n מאגר | 30 דקות | 1 h | 4° C |
| 20% מתנול/B1n מאגר | 30 דקות | 1 h | 4° C |
| מאגר B1n | 30 דקות | 1 h | RT |
| מאגר B1n | בן לילה | בן לילה | RT |
| מאגר PTxwH | 2 h | 2 h | RT |
| מאגר PTxwH | אחסון | אחסון | 4° C |
| נוגדן ראשוני דגירה | 3 ימים | 4-5 ימים | RT |
| נוגדנים משניים דגירה | 3 ימים | 4-5 ימים | RT |
בטבלה 2: הדגירה פעמים עבור delipidation ו- immunostaining. טבלה זו מכילה הדגירה פעמים עבור הצעדים delipidation ו- immunostaining של הפרוטוקול. משקל משוער של רקמה קטנה היא < 300 מ ג.
1 הסרט משלים: 3D הדמיה של אוהדת העצבוב של רקמת שומן. טירוזין hydroxylase (ה) immunostaining של מדגם psWAT (כמו איור 2). הסרט מציג את הזבוב-באמצעות סעיפים אופטי (4 X מ dorsolumbar) ואת מפשעי מחוזות psWAT, עם עומק הכולל של ~ 2 מ מ. TH מוצג בצבע ירוק. Autofluorescence מוצג מגנטה. באזור ממנו החלק dorsolumbar נראה צפיפות SNS נמוכה יותר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
2 הסרט משלים: 3D הדמיה של להערכת ברקמת שומן. Immunostaining CD31 של מדגם psWAT (כמו איור 3). הסרט מציג את הזבוב-באמצעות סעיפים אופטי (4 X מ dorsolumbar) ואת מפשעי מחוזות psWAT, עם עומק הכולל של ~ 2 מ מ. CD31 מוצגים באדום. Autofluorescence מוצג ציאן. כל adipocytes מופיעים קרוב להיות מוקף נימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adipo-ברור היא שיטה פשוטה וחזק שהבהרת רקמת שומן, אשר ניתן בקלות לבצע התקנה במעבדה רגילה. לעומת שיטות ניקוי ממס מבוסס אחרות כגון iDISCO / iDISCO10,11,12, פנוי Adipo ממוטבת במיוחד לניקוי רקמת שומן ורקמות אחרות עם תכולת שומן גבוהה. הצעד delipidation לחלוטין מסיר שומנים שומן, ולכן מקלה על immunolabeling לאורך כל הרקמה כל, בעיקר ממזער את פיזור האור, ומאפשר הדמיה end-to-end ללא אובדן של XY רזולוציה. בנוסף זריחה אור גיליונות מיקרוסקופים, המספקים סריקה מהירה של רקמות גדולות, קונאפוקלית ומיקרוסקופים שני הפוטונים יכול לשמש גם כדי לקבל פרטים נוספים של רזולוציה גדולה יותר.
Delipidation מבוססת על מתנול/DCM הוא שלב קריטי. Delipidation לא מספקת עלולה להביא תמונות מטושטשות, במיוחד כלפי הליבה של הרקמה. חשוב להבטיח הסרה מלאה של שומנים על ידי התבוננות דגימות אדיפוז נקלט DCM. הדגימות המכילות תערובת של סוגי רקמות (למשל, epididymal שומן עם יותרת האשך, testis מצורף) לא תטבע באופן מלא גם עם incubations DCM המורחבת. עם זאת, המקננת הדגימות לילה ב- DCM צריך להשיג delipidation מלאה. בשל דנטורציה של חלבונים באלה ממיסים אורגניים, נוגדנים מסוימים לא יהיה תואם השלב delipidation. לכן, בחירה של נוגדנים מתאימים נעשה עוד צעד קריטי עבור פרוטוקול זה. מומלץ לאמת תחילה את הנוגדנים על מקטעי רקמת שטופלו מתנול או חתיכות קטנות של רקמות מעובד על ידי Adipo-ברור. באופן דומה, התאימות של צבעם עם מתנול/DCM/יהיה צריך להיבדק גם לפני היישום.
מגבלה אחת של הפרוטוקול היא שכבתה של החלבונים פלורסנט ביטוי endogenously. Delipidation ממס מבוסס אורגני והשלבים סליקה במידה רבה denature כגון חלבונים. כדי להמחיש חלבונים פלורסנט אנדוגני, נוגדן תיוג צריך להיות מועסק. הזמינות של נוגדנים מתאימים שילובים מגביל את היכולת לבצע מאוד מרובב הדמיה. מיקרוסקופים אור גיליונות הנוכחי זמין רק מאפשרים לנו את התמונה עד 4 ערוצים.
פנוי Adipo שימושי במיוחד להמחשת מבני filamentous אוכלוסיות תאים בעלי צפיפות נמוכה יחסית של רקמת שומן. עם זאת, הדמיה אותות צפופה הופכת מוגבלת עם גישה זו. כאשר נוגדנים משמשים להוספת תווית אותות צפופה, הם יכולים להיות בבידוד על ידי epitopes ממוקם על פני השטח של המדגם, חוסם את הגישה אל רקמות הפנים. לכן, הגששים כימי קטן מומלץ כתם מבנים צפופים. בשל באותו העניין, היישום של הקליר Adipo רקמת שומן חום הוא מוגבל. שומן חום הוא דיפו אדיפוז במבנים צפופים. בנוסף צפופה של כלי דם, עצבים העצבוב, גם צמוד גדושות עם adipocytes קטנות המכילות מספר רב של המיטוכונדריה17. בשעת החלת CD31 ו- TH מכתים עם אותו ההליך כמתואר לעיל בראון שמנה, רק את פני השטח של המדגם סומן (נתונים לא מוצג). יתר על כן, שומן חום מייצרת רקמה חזקה autofluoresence, המוביל אל יחס אות לרעש נמוך במהלך דימות. מומלץ לחתוך שומן חום לחתיכות קטנות יותר ולהשתמש הגששים כימי כאשר הדבר אפשרי.
בסך הכל, פנוי Adipo מאפשר יצירת פרופילים בו זמנית של מספר מבנים מעניינים עם רזולוציה גבוהה של כל רקמת שומן. באמצעות גישה זו, ניתן לנתח כמה מבנים כגון עצב תחזיות, להערכת, תאים חיסוניים ו adipocytes אינטראקציה לאורך כל משטח כל השמן. הוא מספק נתונים הדמיה לא משוחד על ידי הימנעות חלוקתה או בחירת אזורים מעניינים. ניתן להחיל Adipo-ברור גם ללמוד פיתוח אדיפוז כגון אירועים במהלך תחילת מורפוגנזה, כמו גם את ההפצה של קדמון adipocyte ותאי קודמן במחקרים מעקב אחר שושלת היוחסין. בנוסף שומן, פנוי Adipo עשויה להקל גם ניתוח תלת-ממד כולה-הר של רקמות אחרות תוכן שומני גבוהה או מוקפים שומן, כגון בלוטת חלב שומניים הלימפה בבית השחי הצומת. שיטה זו מציעה גם הזדמנות ללמוד היסטולוגיה של רקמת שומן אנושי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים כריסטינה שממוקמים טאו טונג, אליסון צפון, מרכז המשאבים Bioimaging באוניברסיטת רוקפלר לקבלת סיוע ותמיכה. אנו מודים גם Xiphias ג ' נרל אלקטריק ז'ו לעריכת הסרט. עבודה זו נתמכה על ידי האדם הגבול המדע תוכנית הארגון (PC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
