Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido
Summary
Devido ao alto teor lipídico, o tecido adiposo tem sido desafiador para visualizar usando métodos histológicos de tradicionais. Adipo-Clear é um tecido de limpeza técnica que permite que a rotulagem robusto e alta resolução imagem fluorescente volumétrica do tecido adiposo. Aqui, descrevemos os métodos para a preparação da amostra, pré-tratamento, coloração, limpeza e montagem para a imagem latente.
Abstract
Tecido adiposo desempenha um papel central na homeostase de energia e termorregulação. Ele é composto de diferentes tipos de adipócitos, bem como precursores dos adipócitos, células do sistema imunológico, fibroblastos, vasos sanguíneos e projeções de nervo. Embora o controle molecular da especificação do tipo de célula e como interagem estas células foram delineados cada vez mais, uma compreensão mais abrangente destas células adiposo-residente pode ser alcançada através da visualização de sua distribuição e arquitetura em todo o tecido todo. As abordagens existentes de imuno-histoquímica e imunofluorescência para analisar histologia tecido adiposa dependem de seções finas de parafina. No entanto, seções finas captura apenas uma pequena porção de tecido; Como resultado, as conclusões podem ser influenciadas por qual parte do tecido é analisada. Portanto, nós desenvolvemos um tecido adiposo, limpeza técnica, Adipo-Clear, para permitir a completa visualização tridimensional de padrões moleculares e celulares nos tecidos adiposos. Adipo-Clear foi adaptado de iDISCO / iDISCO +, com modificações específicas feitas para remover completamente os lipídios armazenados no tecido, preservando a morfologia do tecido nativo. Em combinação com microscopia de fluorescência de luz-folha, vamos mostrar aqui o uso de Adipo-Clear método para obter imagens de alta resolução volumétricas, de um tecido adiposo inteira.
Introduction
Até recentemente, tecido adiposo foi concebido como uma coleção amorfa de células de gordura. Ao longo das últimas décadas, nosso entendimento tem crescido mais sofisticado, com gordura agora reconhecida para ser um órgão complexo que contém diferentes tipos de adipócitos, bem como precursores dos adipócitos, células do sistema imunológico, fibroblastos, a vasculatura e projeções de nervo. Interações entre estas células adiposo-residente tem pronunciado efeitos no tecido adiposo e a fisiologia e fisiopatologia1. Embora estudos emergentes têm desvendados importantes mecanismos moleculares subjacentes a certas interações, uma compreensão mais abrangente requer perfil estrutural confiável do tecido inteiro em três dimensões (3D).
Nosso conhecimento atual da morfologia do tecido adiposo é amplamente baseado na análise histológica de seções finas (5 μm), com imagens relativamente alta ampliação (mais de 10 X)2,3. No entanto, esta abordagem tem várias limitações significativas. Primeiras, intricadas estruturas filamentosas como nervos simpáticos e a vascularização, que são conhecidas por desempenhar um papel importante na função do tecido adiposo4,5,6,7, são difíceis de avaliar através de seções finas. Em segundo lugar, devido à sua forma aparentemente amorfa e a falta de unidades estruturais representativas para focar, é difícil apreciar o tecido adiposo estruturas baseadas apenas na coloração de seção. Em terceiro lugar, o tecido adiposo tem um muito alto teor lipídico, criando desafios na obtenção de secções seriais consistentes que são adequadas para a reconstrução anatômica 3D, um método convencional usado para estudar o cérebro inteiro morfologia8. Tendo em conta estes factores, há uma grande necessidade de uma abordagem de conjunto de montagem que pode fornecer a visualização 3D de um depósito de tecido adiposo inteira e ainda alcançar a resolução do celular.
Imagem em 3D volumétrica de um órgão inteiro é um desafio devido aos efeitos obscuring de dispersão de luz. Uma importante fonte de dispersão de luz no tecido biológico vem de interfaces lipid-aquosa. Apesar dos esforços para eliminar a dispersão através da remoção de lipídios foram em curso para mais de um século, tem havido um grande número de recentes inovações9. Um tal método de limpeza de tecidos recém-desenvolvido é uma imagem de 3D habilitado para immunolabeling de órgãos solvente-desmarcada (iDISCO / iDISCO +)10,11. No entanto, o tecido adiposo apresenta um desafio particular, dado o seu alto nível de lipídios e portanto, modificações adicionais para o iDISCO / iDISCO + protocolo são necessário para extrair totalmente os lipídios, protegendo o tecido de entrar em colapso. O protocolo modificado que desenvolvemos, agora chamado Adipo-Clear, emprega baseada em metanol/diclorometano delipidation do tecido adiposo para alcançar a transparência ideal apropriada para imagiologia volumétrica de alta resolução12. Porque o delipidation passo largamente sacia endogenamente expressas proteínas fluorescentes como GFP e RFP, visualização de tais proteínas deve ser alcançada por immunolabeling. Em geral, este protocolo simples e robusto pode ser aplicado para estudar a organização nível de tecido adiposo-residente células, rastreamento de linhagem de células progenitoras de adipócitos e tecido adiposo morfogênese durante o desenvolvimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipo-Clear é um método simples e robusto para limpar o tecido adiposo, que pode ser facilmente executado em uma configuração de laboratório normal. Em comparação com outros métodos de limpeza à base de solvente como iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear é especialmente otimizado para limpar o tecido adiposo e outros tecidos com alto teor de gordura. A etapa de delipidation remove completamente os lipídios do adiposo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Christina Pyrgaki, Tao Tong e Alison North do centro de recursos Bioimaging da Universidade Rockefeller, de assistência e apoio. Agradecemos também Xiphias Ge Zhu para edição de filme. Este trabalho foi apoiado pelo humano Frontier ciência programa organização (PC).
Materials
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
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