سبب المحتوى الدهني المرتفع، قد تم الطعن في الأنسجة الدهنية تصور استخدام الأساليب التقليدية في غذائها. أديبو–واضح هو منديل مسح تقنية تسمح العلامات قوية وعالية الدقة التصوير الفلورسنت الحجمي للأنسجة الدهنية. هنا، نحن تصف الأساليب لإعداد نموذج المعالجة المسبقة وتلطيخ والمقاصة، والمتصاعدة للتصوير.
الأنسجة الدهنية يلعب دوراً مركزياً في التوازن الطاقة وثيرموريجوليشن. وهو يتألف من أنواع مختلفة من adipocytes، فضلا عن السلائف adipocyte والخلايا المناعية والليفية، والأوعية الدموية والعصب الإسقاطات. على الرغم من أن قد جرى تحديد السيطرة الجزيئية لتحديد نوع الخلية وكيف تتفاعل هذه الخلايا يزداد، فهم أكثر شمولاً لهذه الخلايا الدهنية-المقيم يمكن أن يتحقق بتصور التوزيع والهندسة المعمارية في جميع أنحاء النسيج كله. نهج إيمونوهيستوتشيميستري والفلوره الحالية لتحليل الأنسجة الدهنية تعتمد على مقاطع رقيقة جزءا لا يتجزأ من البارافين. ومع ذلك، التقاط المقاطع رقيقة سوى جزء صغير من النسيج؛ كنتيجة لذلك، يمكن أن يكون متحيزا الاستنتاجات التي توصل إليها بما هي جزء من الأنسجة ويتم تحليل. ولذلك وضعنا أنسجة الدهنية مسح تقنية، أديبو واضحة، للسماح التصور ثلاثي الأبعاد الشاملة لأنماط الجزيئية والخلوية في الأنسجة الدهنية كله. أديبو واضحة وقد تم تكييف من إيديسكو/إيديسكو +، مع التعديلات المحددة التي لإزالة الدهون المخزنة في الأنسجة مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة الأصلية تماما. بالاقتران مع ورقة الضوء الفلورية مجهرية، نبدي هنا استخدام الأسلوب أديبو واضحة للحصول على صور عالية الاستبانة الحجمي للأنسجة الدهنية أكملها.
وحتى وقت قريب، كان تصور الأنسجة الدهنية كمجموعة غير متبلور من الخلايا الدهنية. على مدى العقود القليلة الماضية، نمت فهمنا أكثر تطورا، مع الدهون من المعترف به الآن أن يكون جهازا معقدة التي تحتوي على أنواع مختلفة من adipocytes، فضلا عن السلائف adipocyte والخلايا المناعية، والخلايا الليفية، والمفرج وإسقاطات العصب. التفاعلات بين هذه الخلايا الدهنية-المقيم وضوحاً آثار في الأنسجة الدهنية وفسيولوجيا العضوي والفيزيولوجيا المرضية1. على الرغم من أن الدراسات الناشئة قد متدهور أهمية الآليات الجزيئية الكامنة وراء بعض التفاعلات، يتطلب فهم أكثر شمولاً التنميط الهيكلية موثوقة من الأنسجة كاملة في الأبعاد الثلاثة (3D).
معرفتنا الحالية مورفولوجيا الأنسجة الدهنية يستند إلى حد كبير على التحليل النسيجي لأقسام رقيقة (5 ميكرومترات) مع تصوير نسبيا عالية التكبير (أكثر من 10 X)2،3. غير أن هذا النهج قد عدة قيود كبيرة. هياكل الخيطية أولاً، معقدة مثل الأعصاب متعاطفة والمفرج، التي من المعروف أن تلعب أدواراً هامة في الدالة الدهنية4،5،،من67، يصعب تقييمها من خلال أقسام رقيقة. ثانيا، بسبب شكله غير متبلور على ما يبدو وعدم وجود ممثل الوحدات الهيكلية للتركيز على، من الصعب نقدر هياكل الأنسجة الدهنية التي تستند فقط إلى تلطيخ الباب. وثالثاً، قد الأنسجة الدهنية محتوى دهني مرتفع جداً، يخلق تحديات في الحصول على مقاطع المسلسل متسقة مناسبة للتعمير تشريحية ثلاثية الأبعاد، طريقة تقليدية المستخدمة في دراسة مورفولوجية الدماغ كله8. ونظرا لهذه العوامل، وهناك حاجة كبيرة لاتباع نهج كل جبل يمكن تقديم التصور ثلاثي الأبعاد لمستودع الدهنية كاملة بينما لا يزال تحقيق القرار الخلوية.
3D التصوير الحجمي للجهاز أكمله يمثل تحديا بسبب آثار obscuring مبعثر الخفيفة. ويأتي مصدرا رئيسيا تشتت الضوء في الأنسجة البيولوجية من الواجهات المائية الدهنية. على الرغم من أن الجهود الرامية إلى القضاء على مبعثر بإزالة الدهون كانت مستمرة لأكثر من قرن، كانت هناك عدد كبير من الابتكارات الأخيرة9. أحد هذه الأساليب إزالة الأنسجة المطورة حديثا تصوير 3D إيمونولابيلينج-تمكين أجهزة مسح مذيب (إيديسكو/إيديسكو +)10،11. بيد أن الأنسجة الدهنية يمثل تحديا خاصا نظراً للمستوى المرتفع من الدهون، ومن ثم، تعديلات إضافية إيديسكو/إيديسكو + البروتوكول المطلوبة لاستخراج الدهون الكامل بينما تحمي الأنسجة من الانهيار. يستخدم بروتوكول تعديل وضعنا، وتسمى الآن أديبو-واضحة، ديليبيديشن على الميثانول/الميثان من الأنسجة الدهنية لتحقيق الشفافية المثلى المناسبة ل التصوير الحجمي عالية الدقة12. نظراً ديليبيديشن خطوة إلى حد كبير يروي اندوجينوسلي أعرب عن الفلورسنت البروتينات مثل التجارة والنقل وطلب تقديم العروض، ويجب تحقيق التصور هذه البروتينات قبل إيمونولابيلينج. عموما، يمكن تطبيق هذا البروتوكول بسيطة وقوية لدراسة المنظمة مستوى الأنسجة من الخلايا الدهنية-المقيم، وتتبع نسب الخلايا السلف adipocyte، و morphogenesis الدهنية أثناء التطوير.
أديبو–واضح هو أسلوب مباشر وقوى لإزالة الأنسجة الدهنية، والتي يمكن تنفيذها بسهولة في إعداد مختبر عادية. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى المقاصة على أساس مذيب مثل إيديسكو/11،إيديسكو +10،12، أديبو واضحة هو الأمثل خاصة لإزالة الأنسجة الدهنية وال…
The authors have nothing to disclose.
ونشكر بيرجاكي كريستينا، تونغ تاو والشمال أليسون من مركز الموارد بيويماجينج في جامعة روكفلر للمساعدة والدعم. ونشكر أيضا إكسيفياس قة تشو لتحرير الفيلم. وأيد هذا العمل بالبشرية الحدود العلوم برنامج المنظمة (PC).
1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |