Adipo-klar: En væv Clearing metode til tredimensional billeddannelse af fedtvæv
Summary
På grund af det høje fedtindhold, har fedtvæv udfordrende for at visualisere ved hjælp af traditionelle histologiske metoder. Adipo-klar er et væv, clearing teknik, der giver mulighed for robust mærkning og høj opløsning volumetriske fluorescerende billeddannelse af fedtvæv. Her, beskriver vi metoder til prøveforberedelse, forbehandling, farvning, clearing og beslag til billedbehandling.
Abstract
Fedtvæv spiller en central rolle i energi homøostase og termoregulering. Det er sammensat af forskellige typer af adipocytter, samt adipocyt prækursorer, immun celler, fibroblaster, blodkar og nerve fremskrivninger. Selv om den molekylære kontrol af celle type specifikation og hvor disse celler interagere har været mere og mere afgrænset, kan en mere omfattende forståelse af cellernes fedt-resident opnås ved at visualisere deres distribution og arkitektur i hele den hele væv. Eksisterende Immunhistokemi og immunfluorescens tilgange til at analysere adipøst histologi stole på paraffin-embedded tyndslib. Men, tynde sektioner fange kun en lille del af væv; som et resultat, kan være partiske konklusioner af hvilken del af væv er analyseret. Vi har derfor udviklet en fedtvæv, clearing teknik, Adipo-klart, for at tillade omfattende tre-dimensionelle visualisering af molekylære og cellulære mønstre i hele fedtvæv. Adipo-klar var tilpasset fra iDISCO / iDISCO +, med specifikke ændringer lavet til helt at fjerne lipid gemt i vævet samtidig bevare indfødte væv morfologi. I kombination med lys-ark Fluorescens mikroskopi viser vi her brugen af Adipo-klar metode til at opnå høj opløsning volumetriske billeder af en hele fedtvæv.
Introduction
Indtil for nylig, blev fedtvæv udtænkt af som en amorf samling af fedtceller. I de seneste par årtier, er vores forståelse vokset mere sofistikeret, med fedt nu anerkendt for at være et komplekst organ som indeholder forskellige typer af adipocytter samt adipocyt prækursorer, immun celler, fibroblaster, vaskulatur og nerve fremskrivninger. Interaktioner blandt disse fedtholdigt-resident celler har udtalt effekter på fedtvæv og kropsligt fysiologi og patofysiologi1. Selv om nye undersøgelser har skilles ude vigtige molekylære mekanismer bag visse interaktioner, kræver en mere omfattende forståelse pålidelige strukturel profilering af hele væv i tre dimensioner (3D).
Vores nuværende viden om fedtvæv morfologi er hovedsagelig baseret på histologiske analyse af tyndslib (5 μm) med relativt høj forstørrelse imaging (mere end 10 X)2,3. Denne tilgang har dog flere betydelige begrænsninger. Første, indviklede trådformede strukturer som sympatiske nerver og kar, som er kendt for at spille en vigtig rolle i adipøst funktion4,5,6,7, er vanskeligt at vurdere gennem tynde sektioner. Andet, på grund af sin tilsyneladende amorf form og den manglende repræsentative strukturelle enheder til at fokusere på, det er svært at sætte pris på fedtvæv strukturer baseret kun på afsnit farvning. For det tredje har fedtvæv en meget høj lipid indhold, at skabe udfordringer i at opnå ensartet serie sektioner, der er egnet til 3D anatomiske genopbygning, en konventionel metode bruges til at undersøge hele hjernens morfologi8. I betragtning af disse faktorer, er der et stort behov for en hele-mount tilgang, der kan give 3D visualisering af en hel adipøst depot samtidig stadig opnå cellulære opløsning.
3D volumetriske billeddannelse af hele organ er udfordrende på grund af skyggende virkningerne af lysspredningen. En væsentlig kilde til lysspredningen i biologisk væv kommer fra lipid-vandig grænseflader. Selv om bestræbelserne på at fjerne scatter ved at fjerne lipider har stået på i over et århundrede, har der været et stort antal af de seneste innovationer9. En sådan nyudviklede væv-clearing metode er immunolabeling-aktiveret 3D imaging af opløsningsmiddel-ryddet organer (iDISCO / iDISCO +)10,11. Dog fedtvæv udgør en særlig udfordring givet sit høje niveau af lipider, og derfor, yderligere ændringer til iDISCO / iDISCO + protokollen er forpligtet til at fuldt uddrag af lipider samtidig beskytte væv fra kollapse. Den ændrede protokol, vi har udviklet, nu kaldet Adipo-klar, beskæftiger methanol/dichlormethan-baseret delipidation af fedtvæv til at opnå optimal gennemsigtighed egnet til høj opløsning volumetriske imaging12. Fordi delipidation trin i vid udstrækning slukker endogent udtrykt fluorescerende proteiner som normal god landbrugspraksis og RFP, skal visualisering af sådanne proteiner opnås ved immunolabeling. Samlet set denne enkel og robust protokol kan anvendes til at studere væv-niveau organisation af fedt-resident celler, afstamning sporingen af adipocyt stamceller og fedt morfogenese under udvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipo-Clear er en enkel og robust metode til at rydde fedtvæv, som let kan udføres i en regelmæssig lab setup. I forhold til andre opløsningsmiddel-baserede clearing metoder som iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-klar er specielt optimeret til rydning af fedtvæv og andre væv med højt fedtindhold. Delipidation skridt fjerner helt lipider fra fedt, og derfor letter immunolabeling i hele den hele væv og i høj grad minimerer …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Christina Pyrgaki, Tao Tong og Alison North fra Bioimaging Resource Center på Rockefeller University for at få hjælp og støtte. Vi takker også Xiphias Ge Zhu for film redigering. Dette arbejde blev støttet af Human Frontier Science Program organisation (PC).
Materials
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
