Adipo-Clear: En vävnad Clearing metod för tredimensionell avbildning av fettvävnad
Summary
På grund av den höga fetthalten, har fettvävnad utmanande för att visualisera med traditionella histologiska metoder. Adipo-Clear är en vävnad som clearing teknik som gör robusta märkning och högupplösta volymetriska fluorescerande avbildning av fettvävnad. Här, beskriver vi metoderna för provberedning, förbehandling, färgning, clearing och montering för avbildning.
Abstract
Fettvävnad spelar en central roll i energi homeostas och värmereglering. Den består av olika typer av adipocyter, liksom fettceller prekursorer, immunceller, fibroblaster, blodkärl och nerv prognoser. Även om molekylär kontroll av cell typ specifikation och hur dessa celler interagerar har varit alltmer avgränsas, kan en mer omfattande förståelse av dessa adipose boförälder celler uppnås genom att visualisera deras distribution och arkitektur hela hela vävnaden. Befintliga immunohistokemi och immunofluorescens metoder att analysera fett histologi lita på paraffin-inbäddat tunnslip. Tunnslip fångar dock endast en liten del vävnad; som ett resultat, kan slutsatser vara partisk av vilken del av vävnad analyseras. Därför har vi utvecklat en fettvävnad som clearing teknik, Adipo-klar, för att tillåta omfattande tredimensionell visualisering av molekylära och cellulära mönster i hela fettvävnad. Adipo-Clear var anpassad från iDISCO / iDISCO +, med särskilda modifikationer gjorts att helt ta bort den lipid lagras i vävnaden samtidigt som infödda vävnad morfologi. I kombination med ljus ark fluorescensmikroskopi visar vi här användningen av metoden Adipo-klar att få högupplösta volymetriska bilder av en hela fettvävnad.
Introduction
Tills nyligen, tänktes fettvävnad av som en amorf samling av fettceller. Under de senaste decennierna vuxit vår förståelse mer sofistikerade, med fett nu erkänts vara ett komplext organ som innehåller olika typer av adipocyter, liksom fettceller prekursorer, immunceller, fibroblaster, kärlsystemet och nerv prognoser. Interaktioner bland dessa adipose boförälder celler har uttalad påverkan på fettvävnad och organismers fysiologi och patofysiologi1. Även om nya studier har unraveled viktiga molekylära mekanismer bakom vissa interaktioner, kräver en mer omfattande förståelse tillförlitlig strukturella profilering av hela vävnad i tre dimensioner (3D).
Vår nuvarande kunskap om fettvävnad morfologi är till stor del baserad på histologisk analys av tunnslip (5 μm) med relativt hög förstoring bildhantering (mer än 10 X)2,3. Detta tillvägagångssätt har dock flera betydande begränsningar. Första, intrikata trådformiga strukturer såsom sympatiska nerver och kärlsystemet, som är känd för att spela viktiga roller i fett funktion4,5,6,7, är svårt att utvärdera genom tunna sektioner. Andra, på grund av dess till synes amorf form och avsaknaden av representativa strukturella enheter att fokusera på, det är svårt att uppskatta adipose vävnad strukturer utifrån endast avsnitt färgning. Tredje har fettvävnaden en mycket höga fetthalten, skapar utmaningar att få konsekvent seriell sektioner som är lämpliga för 3D anatomiska rekonstruktion, en konventionell metod som används för att studera hela hjärnan morfologi8. Tanke på dessa faktorer, finns det ett stort behov av en hela-mount-strategi som kan ge 3D visualisering av en hela fett depot samtidigt fortfarande uppnå cellulära upplösning.
3D volymetriska bildbehandling av hela organ är utmanande på grund av ljusspridning skymmande. En stor källa av ljusspridning i biologiska vävnader kommer från lipid-aqueous gränssnitt. Även om ansträngningar att eliminera scatter genom att ta bort lipider har pågått för över ett sekel, har förekommit ett stort antal senaste innovationer9. En sådan nyutvecklade vävnad-clearing metod är immunolabeling-aktiverade 3D imaging av lösningsmedel-godkänt organ (iDISCO / iDISCO +)10,11. Fettvävnad presenterar emellertid en särskild utmaning med tanke på dess höga lipider, och därför ytterligare ändringar i iDISCO / iDISCO + protokoll krävs fullt extrahera lipider samtidigt skydda vävnaden från att kollapsa. Det ändrade protokollet har vi utvecklat, nu kallas Adipo-klar, sysselsätter metanol/diklormetan-baserade delipidation av fettvävnad att uppnå optimal öppenhet lämplig för högupplösta volymetriska imaging12. Eftersom delipidation steg till stor del släcker endogenously uttryckt fluorescerande proteiner som GFP och RFP, måste visualisering av sådana proteiner uppnås genom immunolabeling. Övergripande, detta enkel och robust protokoll kan användas för att studera vävnad-nivå organisation av adipose boförälder celler, lineage tracing fettceller stamceller och fett morfogenes under utveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipo-Clear är en enkel och robust metod för clearing fettvävnad, som enkelt kan utföras i en vanlig labbet setup. I jämförelse med andra lösningsmedel-baserade röjningmetoder såsom iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear är särskilt optimerad för clearing fettvävnad och annan vävnad med hög fetthalt. Det delipidation steget tar bort helt lipider från adipose, och därför underlättar immunolabeling i hela hela v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Christina Pyrgaki, Tao Tong och Alison North från Bioimaging Resource Center på Rockefeller University för hjälp och stöd. Vi tackar också Xiphias Ge Zhu för filmredigering. Detta arbete stöds av Human Frontier Science Program organisation (PC).
Materials
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
