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Biology

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

doi: 10.3791/58271 Published: July 28, 2018

Summary

높은 지질 콘텐츠로 인해 지방 조직 전통적인 조직학 방법을 사용 하 여 시각화를 도전 하고있다. Adipo 분명 강력한 라벨 및 지방이 많은 직물의 고해상도 체적 형광 이미징 기술을 삭제 하는 조직 이다. 여기, 샘플 준비, 전처리, 얼룩, 지우기, 및 이미징에 대 한 설치 방법을 설명 합니다.

Abstract

지방 조직 에너지 항상성 및 체온 조절에 중심 역할을 한다. 그것은 다른 유형의 adipocytes, 뿐 아니라 체형 선구자, 면역 세포, 섬유 아 세포, 혈관 및 신경 예측 구성 됩니다. 셀 형식 지정의 분자 제어 하 고 이러한 세포의 상호 작용 점점 입각, 비록이 지방 주민 세포의 보다 포괄적인 이해 그들의 배포 아키텍처를 시각화 하 여 달성 될 수 있다 통해 전체 조직. 기존 immunohistochemistry 면역 형광 접근 지방 조직학 분석을 얇은 파라핀 포함 된 섹션에 의존 합니다. 그러나, 얇은 섹션 조직;의 작은 부분만 캡처 그 결과, 결론 조직의 어떤 부분을 분석 하 여 편견 수 있습니다. 따라서 전체 adipose 조직에 분자 및 세포 패턴의 포괄적인 3 차원 시각화를 허용 기법, Adipo-명확 하 고, 삭제 하는 지방 조직 개발 했습니다. Adipo 클리어 iDISCO에서 적응 / iDISCO +, 특정 수정에 게 완전히 제거 하는 기본 조직 형태를 유지 하면서 조직에 저장 된 지질. 함께 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 여기는 전체 지방 조직의 고해상도 체적 이미지를 Adipo Clear 메서드를 사용 하 여를 설명 합니다.

Introduction

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최근까지, 지방이 많은 직물 지방 세포의 비정 질 컬렉션으로의 잉태 했다. 지난 몇 년간 우리의 이해 지금 adipocytes, 체형 선구자의 종류, 면역 세포, 섬유 아 세포, 맥 관 구조, 및 신경 예측을 포함 하는 복잡 한 기관 수를 인식 하는 지방으로 더 정교한 성장 했습니다. 이 지방 주민 세포 간의 상호 작용 효과 지방 조직 및 organismal 생리학 및 이상1발음 있다. 신흥 연구 기본 특정 상호 작용 하는 중요 한 분자 메커니즘 unraveled 있다, 하지만 더 포괄적인 이해 안정적인 구조 프로 파일링 3 차원 (3D)에 전체 조직의 필요 합니다.

지방이 많은 직물 형태학의 우리의 현재 지식은 기반 상대적으로 높은 확대 화상 진 찰 (10 X) 가진 얇은 단면도 (5 μ m)의 조직학 분석2,3. 그러나,이 방법은 몇 가지 중요 한 제한이 있다. 첫째, 복잡 한 등 교감 신경 맥 관 구조, 많은 기능4,5,,67에 중요 한 역할을 알려져 있습니다 filamentous 구조는 평가 하기 어려운 통해 얇은 섹션입니다. 둘째, 겉보기 무 조직 모양 및 대표적인 구조 단위에 초점의 부족, 그것은 지방 조직 구조 섹션 얼룩에 기반으로 감사 어렵다. 셋째, 지방 조직 취득 3D 해 부 재건, 전체 두뇌 형태학8을 연구 하는 데 사용 하는 기존의 방법에 대 한 적합 한 일관 된 직렬 섹션에 과제를 만드는 매우 높은 지질 내용을 있습니다. 이러한 요소를 감안할 때, 아직도 세포 해상도 달성 하면서 전체 지방 서비스 센터의 3D 시각화를 제공할 수 있는 전체-마운트 접근에 대 한 중대 한 필요가 있다.

전체 장기의 3 차원 체적 영상 도전 가벼운 살포의 가려지는 효과 때문 이다. 생물 학적 조직의 빛 분산의 주요 원천이 지질 수성 인터페이스에서 온다. 지질을 제거 하 여 피해를 제거 하는 노력에 대 한 지속적인 세기 왔다, 하지만 많은 수의 최근 혁신9되었습니다. 하나 같은 새로 개발 조직-개간 방법은 용 매 허가 기관의 immunolabeling 기반 3D 이미징 (iDISCO / iDISCO +)10,11. 그러나 지방 조직 특정 도전 주어진 지질 높은 수준을 제공 하는, 따라서는 iDISCO 추가 수정 / iDISCO + 프로토콜 완전히 붕괴에서 조직을 보호 하면서 지질을 추출 하는 데 필요한. 수정된 프로토콜을 개발 했습니다, 지금은 Adipo 클리어 라는 고해상도 체적 영상12에 적합 최적의 투명도 달성 하기 위해 지방이 많은 직물의 메탄올/dichloromethane 기반 delipidation를 사용 합니다. delipidation 단계 크게 표현 endogenously 냉각 형광 단백질 GFP와 RFP, 때문에 immunolabeling에 의해 이러한 단백질의 시각화를 달성 해야 합니다. 전반적으로,이 간단 하 고 강력한 프로토콜 지방 주민 세포의 조직 수준 조직 연구에 적용할 수 있는 개발 하는 동안 체형 조상 세포, 그리고 지방 morphogenesis의 혈통 추적.

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Protocol

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동물 관리 및 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 록펠러 대학에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.

1. 조직 준비

  1. 혈액은 조직에서 완전히 제거 될 때까지 4 ° C에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 ~ 20 mL와 함께 표준 intracardiac 관류를 수행 합니다.
  2. 목과 꼬리는 크게 굳 어 때까지 perfusate ~ 20 mL 통 솔루션 (4 %paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS에) 4 ° C에서의 전환.
    주의: PFA 독성이 있다. 피부, 눈 및 점 막과의 접촉을 피하십시오. 솔루션은 증기 두건 안쪽 여야 한다.
  3. 신중 하 게 그것을 손상 하지 않고 전체 지방 패드를 제거 하는 관심의 지방 패드를 해 부. 무뚝뚝한 끝난 집게를 사용 하 여 곤란 또는 조직을 압박을 피하기 위해. 모든 모피와 해 부 조직을 오염 하지 마십시오.
  4. 후 4% PFA 1 x PBS에 4 ° c.에서 하룻밤에 조직 수정 각 지방 패드 15 mL 원뿔 튜브에 고정 솔루션의 ~ 10 mL와 수정 후.
  5. 실 온 (RT)에서 조직 1 x PBS로 3 회 (각 1 시간)을 씻어.
  6. 단기 (최대 2 주)에 대 한 조직 4 ° C에서 1 x PBS에 저장 하 고 빛 으로부터 보호. 장기 저장 (예를 들어, 1-2 년)에 대 한 전환 버퍼 0.05% 나트륨 아 지 드와 1 x PBS (방부 제)로.
    주의: 나트륨 아 지 드 구두로 섭취 또는 피부를 통해 흡수 하는 때 매우 독성이 있다. 나트륨 아 지 드 솔루션 (5% 이상) 증기 두건에서 처리 되어야 집중.

2. Delipidation 및 Permeabilization

타이밍: 1-2 일

  1. 20%, 40%, 60% 및 80% 메탄올 그라데이션 B1n 버퍼 (표 1) (v/v), 예를 들어, 20% 메탄올/B1n 버퍼에 대 한 준비, 메탄올의 20 mL와 B1n 버퍼의 80 mL를 혼합. 4 ° c.에 모든 버퍼 저장 글리신 결정 채도 인해 60% 및 80% 메탄올/B1n 버퍼에서 침전 한다. 크리스탈;를 제거 하지 마십시오 액체 솔루션을 사용 하 여 다음 세척에 대 한.
    주의: 메탄올은, 자극성, 휘발성 및 가연성. 피부 또는 눈 접촉을 피하십시오.
  2. 부드럽게 해 부 현미경 아래 예제에서 머리를 제거 합니다. 어떤 머리, 보풀, 또는 파편 샘플에 연결 된 이미징 동안 그림자를 발생 합니다. 새로운 튜브로 청소 샘플을 전송 합니다.
  3. 달리 명시 하지 않는 한 또는 얼음에 4 ° C에서 다음 단계를 모두 수행 합니다. (예를 들어, 젊은 마른 쥐에서 후부 피하/perigonadal 지방 패드) 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 (예를 들면, 비만 쥐에서 지방 패드) 높은 지질 콘텐츠로 샘플 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다.
    1. 가로로 설정 궤도 셰이 커에 샘플을 포함 하는 튜브를 놓고 ~ 100 rpm. 샘플 튜브 안에 자유롭게 이동할 수 있는지 확인 합니다.
  4. 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 20%, 40%, 60%, 80%, 및 100% 메탄올/B1n 버퍼의 등급된 시리즈에서 샘플을 탈수. 이어지기 솔루션을 최소화 합니다.
  5. Delipidate 100 %dichloromethane (DCM)와 샘플 (3 회), 부 화 시간에 각각 표 2에 표시. 샘플의 두 번째 및 세 번째 DCM 세척 끝 튜브의 바닥에 싱크 한다. 그렇지 않은 경우 전체 delipidation를 위해 보육 시간 연장 (예를 들어, 30 분에서 1-2 시간까지).
    주의: DCM 연기 후드 안에 처리 되어야 합니다. 유리 용기를 사용 하 여 저장 및 microcentrifuge 튜브 외피에 대 한 폴 리 프로필 렌에서 만들어집니다. Microcentrifuge 튜브 DCM의 장기 저장을 위해 사용할 수 없습니다. 접시 및 serological 펫 폴리스 티 렌에서 DCM와 호환 되지 않습니다. DCM은 매우 휘발성 이다. 신속 하 게 건조를 방지 하기 위해 신선한 솔루션에는 샘플을 전송 합니다.
  6. 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 100% 메탄올으로 두 번 세척.
  7. 옵션: 없으면 샘플 잘 perfused, 나머지 적혈구에서 헤모글로빈의 색 될 수 있습니다 강한 autofluorescence. 4 ° c.에 하룻밤 메탄올 (메탄올의 5 볼륨 30% H2O2 의 1 볼륨)에서 5% H2O2 와 표 백제
  8. 반전된 메탄올/B1n 버퍼 시리즈에서 샘플 rehydrate: 80%, 60%, 40%, 20% 메탄올/B1n, 및 100 %B1n 버퍼 (2 회) 지정 된 시간 (표 2).
  9. 실시간에서 PTxwH 버퍼 (표 1) 2 시간에 대 한 샘플을 씻어
  10. Delipidated 샘플 4 ° C (최대 1 년)에서 PTxwH 버퍼에 저장 하거나 immunostaining 단계로 바로 진행 합니다.

3. 전체 마운트 Immunostaining

타이밍: 8-10 일

참고: 다음 단계를 모두 수행 되어야 합니다 밖으로 RT에 떨고와 빛 으로부터 보호, 언급 하지 않는 한. 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 대 한 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다. 먼저 조직 또는 메탄올 처리 조직 단면도의 작은 조각에 항 체를 검사 하는 것이 좋습니다.

  1. 권장된 농도에 PTxwH 버퍼에 1 차적인 항 체 희석. 항 체 희석된 솔루션 소개 항 체 침전 또는 집계를 방지 하기 위해 10 분 ~ 20000 x g에서 원심
  2. 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 1 차적인 항 체 솔루션 delipidated 샘플을 품 어.
  3. 일련의 인큐베이션 단계에서 PTxwH 버퍼와 샘플을 세척: 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 h와 하룻밤.
  4. 권장된 농도에 PTxwH 버퍼에 이차 항 체 희석. 항 체 희석된 솔루션 소개 항 체 침전 또는 집계를 방지 하기 위해 10 분 ~ 20000 x g 에서 원심
    참고: 조직 autofluorescence에 의해 발생 하는 높은 백그라운드를 방지 하려면 fluorophores 빨간색과 빨강 영역에 빛을 방출로 활용 된 이차 항 체는 권장 됩니다. 현미경에 레이저 라인 수에 따라 최대 3-4 마커 수 수 몇 군데 동시에 하나의 샘플에.
  5. 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 2 차 항 체 솔루션 샘플을 품 어.
  6. 일련의 인큐베이션 단계에서 PTxwH 버퍼와 세척 샘플: 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 h와 하룻밤.
  7. 옵션: 조직 유형 연약한, 수정 얼룩진된 조직 4% PFA 1 x PBS에 조직 형태를 유지 하기 위해 4 ° C에서 하룻밤.
    참고:이 단계는 이미징 배경을 증가할 수 있습니다. 지방 조직에 대 한이 단계를 수행할 필요는 없습니다.
  8. 1 x PBS와 샘플 일련의 인큐베이션 단계에서 세척: 5 분, 10 분, 그리고 30 분.
  9. 부드럽게 해 부 현미경 아래 예제에서 린 트를 제거 합니다.

4. 조직 개간

타이밍: 1-2 일

  1. 선택 사항: agarose 빛 시트 현미경 검사 법에 대 한 샘플 장착을 촉진 하기에 샘플을 포함 합니다.
    참고:이 단계는 좋습니다 이미징 동안 모양을 안정화를 지방 조직에 대 한.
    1. 1 x PBS (w/v)에서 1 %agarose 포함 솔루션을 준비 합니다. 포함 솔루션 쿨 ~ 40 ° C ~ 샘플 과도 한 열을 노출 하지 마십시오.
    2. (, 페 트리 접시 또는 보트 무게) 금형 청소 샘플을 배치 하 고 원하는 위치에 정렬. 어떤 액체의 carryover를 하지 마십시오. 부드럽게 샘플 포함 솔루션을 붓는 다. 어떤 공기 방울을 피하십시오.
    3. 완전 실시간 컷에 샘플을 포함 하는 블록을 공고히 하는 agarose를 하자.
      참고: 하룻밤 외피를 포함 하 여 다음 단계를 모두 수행 되어야 합니다 밖으로 RT에 떨고와 빛 으로부터 보호. 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 대 한 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다.
  2. 지정 된 시간 (표 2)에 대 한 H2소개할 25%, 50%, 75% 및 100% (3 회)와 메탄올에서에서 샘플을 탈수.
    참고: 샘플 100% 메탄올 단계에서 하룻밤 남아 있을 수 있습니다.
  3. (3 회)을 떨고와 1 시간에 대 한 100 %DCM 샘플을 품 어. 샘플 각 DCM 세척의 끝에 관의 바닥에 싱크 한다. 그렇지 않은 경우에 메탄올의 완전 제거를 보장 하기 위해 보육 시간 연장. 샘플은 100 %DCM 단계에서 하룻밤 남아 있을 수 있습니다.
  4. 일치 하는 굴절률을 달성 하기 위해 가벼운 떨고와 dibenzyl 에테르 (DBE)에 샘플 밤새 품 어.
    참고: 샘플 결국 가시 광선에 투명 하 게 될 것 이다.
    주의: DBE 위험입니다. 피부와 접촉을 하지 마십시오. 두 계층 장갑 연기 후드 안에 그것을 처리 합니다. 최대한 빨리 그것은 DBE와 함께 오염 된 장갑을 삭제 합니다. 유리 용기를 사용 하 여 저장 및 microcentrifuge 관 (폴 리 프로필 렌) 외피에 대 한. Microcentrifuge 튜브 DBE의 장기 저장을 위해 사용할 수 없습니다. 접시 및 폴리스 티 렌에서 혈 청 학적인 펫 DBE와 호환 되지 않습니다. 100% 에탄올으로 어떤 유출 청소.
  5. 어둠 속에서 RT에서 샘플 2 h. 저장소 떨고 가벼운와 신선한 DBE와 함께 샘플을 품 어 나 영상에 직접 진행.
    참고: 샘플은 한 달 내 이미지를 권장 됩니다. 특정 fluorophores 다른 사람 들 보다 더 안정 되어 있지만,이 단계에서 샘플의 장기 보관 권장 하지 않습니다.

5입니다. 현미경

  1. 빛-시트 현미경 DBE와 호환 되는 이미지입니다.
    참고: 유기 용 매 기반 이미징에 대 한 승인 되 고 DBE의 굴절률과 일치 하는 유일한 목표는 DBE 몰입 이미징에서 목표를 찍기로 사용할 수 있습니다.
    1. Agarose 포함 샘플 영상 동안 움직임을 막을 수 있는 홀더에 탑재 합니다. DBE 채워진 챔버로 샘플을 담가.
    2. Z-스택 전체 샘플 (예를 들어, 1-2 배 확대) 전체 조직 유통/관심의 마커의 구조를 취재를 수집 합니다.
    3. (예를 들어, 4-12 배 확대) 자세한 구조를 이미지를 관심 영역을 확대 하려면 더 높은 확대와 함께 목표를 전환 합니다.
      참고: 콜라겐 지방 조직, 주변 모든 지방 세포13의 기질에 큰 기여입니다. 콜라겐은 약 400에 이르기까지 일반적인 방출 스펙트럼 550 nm14nm. 488 레이저 선 (녹색)으로 샘플을 상상 하 고 내 콜라겐 (예를 들어, 525-550 nm)의 방출 스펙트럼 파장 범위에서 방출된 빛을 수집 이전에 보여 줬던 조직 autofluorescence 신호를 제공할 것입니다. 지방 세포 윤곽 및 전반적인 조직 아키텍처12를 나타냅니다.
  2. 거꾸로과 이미징 confocal 또는 두 광자 현미경.
    1. 모든 플라스틱 부품 (또는 인감 수 있습니다 기타 DBE 호환 이미징 챔버)을 건드리지 않고 agarose 포함 샘플 챔버 슬라이드 유리 바닥에 놓습니다. DBE 밖으로 누출 되지 않는 다는 것을 확인 하십시오.
    2. 더 깊은 침투를 달성 하 긴 작동 거리를 가진 목표를 선택 하십시오.
      참고: 이미지는 챔버 슬라이드의 유리 바닥을 통해 거꾸로 또는 2 광자 공초점 현미경으로 행해져야 한다. 샘플 및 찍기 DBE 기반 이미징에 대 한 제안 하지 목표 사이의 직접 접촉을 하지 마십시오.

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Representative Results

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Adipo 명확한 준비 전체 지방 패드 조직 형태 및 세포질 상호 작용 고 비만 상태에 영향을 분석 하는 차원에서 몇 군데 있습니다. 이 메서드는 녹색 채널에 조직 autofluorescence 신호를 수집 하 여 일반 지방 구조 분석에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리가 이전 것으로 나타났습니다는 autofluorescence 지방 오버레이 perilipin 얼룩, 성숙한 adipocytes12개요 일반적으로 사용 되는 마커와 호의에 신호. 예를 들어 후부 피하 지방 패드 (psWAT) 낮은 확대 (1.3 X)와 함께 빛 시트 현미경을 사용 하 여 스캔 (그림 1AB) adipocytes의 lobular 조직 보여 줍니다. Adipocytes, 크기 등의 자세한 정보 (그림 1 cD) 높은 확대 (4 배)와 함께 관심의 영역으로 확대 하 여 계시 될 수 있다.

Adipo 클리어 도전 캡처 또는 얇은 섹션에서 추적 하는 혈관, 신경 예측 등 filamentous 구조를 시각화에 대 한 특히 유용 합니다. 교감 신 경계 (SNS) lipolysis 및 지방 조직4,5thermogenesis에서 중요 한 역할을 한다. 티로신 hydroxylase (TH)로 얼룩진 psWAT 패드 이미징, SNS에 대 한 마커 큰 신경 번들, 혈관 신경 분포, 뿐만 아니라 조직 실질 (그림 2A-H)에 밀도 터미널 arborization로 표시 되는 구조를 보여준다. 또한, 일 + parenchymal 예측 (그림 2E-H; dorsolumbar 부분에 상대적으로 높은 밀도 데 사 타 구니 부분 psWAT, 내 지역 편차 표시 보충 영화 1)입니다. SNS 터미널 arborization 연산을 추적 될 수 있다 고 innervation12의 밀도 평가 하기 위해 Imaris 소프트웨어의 FilamentTracer 도구를 사용 하 여 재구성 된 우리의 이전 작품 시연 하고있다.

지방 조직 무 겁 게 나가도록 알려져 있다. 지방의 대사 요구에 변화는 종종 그것의 맥 관 구조6,7의 개장 하는 동적 연결 됩니다. 강력 하 고 빠른 전체 조직 맥 관 구조의 프로 파일링 혈관 개장에 대 한 추가 편견된 분석을 제공할 수 있습니다. 우리 모든 adipocytes 접촉 (그림 3A-H;의 전체 조직에 걸쳐 모세 혈관은 관찰 라벨 혈관을 표식으로 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자 (PECAM-1, 일컬어 CD31)를 사용 하 여, 보충 영화 2) 지방에서 교환 효율적인 영양소와 산소에 대 한 높은 수요를 지 원하는.

면역 세포는 지방 조직의 또 다른 중요 한 구성 요소입니다. 비만 상태는 죽은 adipocytes15,16주변 "크라운-같은" 구조를 형성 하는 프로-염증 성 세포의 침투와 함께 지방 조직이 염증이 된다. 비만 동물에서 지방 패드는 특히 그들의 큰 크기 및 높은 지질 내용을 지우기 어렵다. 그러나, Adipo 클리어 (큰 조직 또는 높은 지방 콘텐츠 조직 표 2 에 설명 된)의 확장된 버전 전체 높은 지방 라덴 조직의 일관 된 청소를 얻을 수 있습니다. 예를 들어 높은 지방 다이어트의 16 주를 품고 마우스에서 epididymal 지방 밀도 "왕관 모양의 구조", (그림 4AB) 전체 조직에 걸쳐 CD68에 의해 immunolabeled를 보여 줍니다. 중요 한 것은, 광학 섹션 전체 깊이 조직의 다양 한 위치에서 점령 (~ 4-5 m m) 보기 동일 하 게 선명한 이미지, 보여주는 조직 (그림 4C-F)의 완전 한 개간.

Figure 1
그림 1: 지방 조직 형태 autofluorescence 신호를 사용 하 여 분석. 모든 패널은 실시간에서 지 내게는 8 주 된 C57Bl/6J 남성 마우스에서 분리 한 Adipo 명확한 준비 psWAT 패드의 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 이미지 Autofluorescence 신호는 녹색 채널 삭제 샘플을 검색 하 여 수집 됩니다. Dorsolumbar 지역 (A) (B) 1.3 X 목표에 의해 사 타 구니 지역의 광학 섹션 (샘플의 중간에서 횡단면)입니다. (C, D) 고배율 (4 배) 박스형된 지역 A B에서 광학 섹션입니다. 림프절은 별표로 표시 됩니다. 스케일 바는 각 패널에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 3D 지방 조직에 동 정적인 신경 분포의 이미징. 모든 패널은 티로신 hydroxylase (일) ( 그림 1과 같이 동일한 샘플)으로 표시 하는 psWAT의 LSFM 이미지입니다. 복원된 dorsolumbar 지역 (A) 와 사 타 구니 지역 (B) 1.3 X 목표에 의해 최대 예측 (C, D) AB의 중간에서 광학 섹션입니다. (E, F) 고배율 (4 배)에서 C D박스형된 지역의 광학 섹션입니다. (G, H) TH (녹색) 및 autofluorescence (마젠타) 사이의 오버레이의 고배율 광학 섹션입니다. 화살촉 표시 동 정적인 신경 분포의 뚜렷한 패턴: (1) 신경 번들; (2) 혈관 신경 분포; (3) parenchymal arborization입니다. 림프절은 별표로 표시 됩니다. 스케일 바는 각 패널에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 지방 조직에서 혈관의 영상 3D. 모든 패널은 LSFM psWAT ( 그림 1과 같이 동일한 샘플) 라는 CD31의 이미지입니다. (A, B) 복원된 dorsolumbar 지역 (A) 와 사 타 구니 지역 (B) 1.3 X 목표에 의해 최대 예측 (C, D) AB의 중간에서 광학 섹션입니다. (E, F) 고배율 (4 배)에서 C D박스형된 지역의 광학 섹션입니다. (G, H) CD31 (빨간색)와 autofluorescence (사이안) 사이의 오버레이의 고배율 광학 섹션입니다. 림프절은 별표로 표시 됩니다. 스케일 바는 각 패널에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: "왕관 모양의 구조" 지방 조직에서의 3D 영상. 모든 패널은 16 주 동안 높은 지방 다이어트를 먹이 하는 남성 마우스에서 분리 한 Adipo 명확한 준비 eWAT 패드의 LSFM 이미지입니다. 샘플은 CD31와 CD68 immunolabeled 했다. (A, B) 4. (A) X-Y 보기 보다는 더 많은 것의 총 깊이 가진 복원된 샘플의 최대 예측 (B) Y-Z 보기. (C-F) B에 표시 된 깊이에서 광학 섹션. 스케일 바는 각 패널에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

버퍼 화학 최종 농도
B1n 버퍼
글리신 0.3 M
트라이 톤 X-100 0.1% (v/v)
H2O 용 매
나트륨 아 지 드 (방부, 옵션) 0.01% (w/v)
7 NaOH로 pH를 조정
PTxwH 버퍼
10 x PBS 1 x
트라이 톤 X-100 0.1% (v/v)
트윈 20 0.05% (v/v)
헤 파 린 2 µ g/ml
H2O 용 매
나트륨 아 지 드 (방부, 옵션) 0.01% (w/v)

표 1: 버퍼 솔루션의 목록. 이 표에서 Adipo 클리어에 사용 되는 버퍼에 대 한 요리법 합니다. 버퍼의 장기 저장을 위한 방부 제로 나트륨 아 지 드를 추가 하는 것이 좋습니다.

버퍼 작은 조직 큰 조직 (또는 고 지방 내용) 온도
20% 메탄올/B1n 버퍼 30 분 1 h 4 ° C
40% 메탄올/B1n 버퍼 30 분 1 h 4 ° C
60% 메탄올/B1n 버퍼 30 분 1 h 4 ° C
80% 메탄올/B1n 버퍼 30 분 1 h 4 ° C
100% 메탄올 30 분 1 h 4 ° C
DCM 30 분 1 h 4 ° C
DCM 1 h 2-3 h, 또는 하룻밤 4 ° C
DCM 30 분 2 h 4 ° C
100% 메탄올 30 분 1 h 4 ° C
100% 메탄올 30 분 1 h 4 ° C
선택 사항: 5% H2O2/methanol 하룻밤 하룻밤 4 ° C
80% 메탄올/B1n 버퍼 30 분 1 h 4 ° C
60% 메탄올/B1n 버퍼 30 분 1 h 4 ° C
40% 메탄올/B1n 버퍼 30 분 1 h 4 ° C
20% 메탄올/B1n 버퍼 30 분 1 h 4 ° C
B1n 버퍼 30 분 1 h RT
B1n 버퍼 하룻밤 하룻밤 RT
PTxwH 버퍼 2 h 2 h RT
PTxwH 버퍼 스토리지 스토리지 4 ° C
1 차적인 항 체 외피 3 일 4-5 일 RT
이차 항 체 외피 3 일 4-5 일 RT

표 2: 보육 시간 delipidation 및 immunostaining. 이 테이블에 대 한 프로토콜의 delipidation 및 immunostaining 단계 보육 시간을 포함 되어 있습니다. 작은 조직의 대략적인 무게 < 300 밀리 그램입니다.

보충 영화 1: 지방 조직에 동 정적인 신경 분포의 이미징 3D. (같은 그림 2)는 psWAT 샘플의 티로신 hydroxylase (일) immunostaining. 영화 플라이 쓰루 광학 섹션 (4 X는 dorsolumbar에서)와 psWAT의 사 타 구니 지역 보여줍니다 ~ 2 m m.의 총 깊이 일에에서 표시 됩니다 녹색. Autofluorescence는 자홍색으로 표시 됩니다. Dorsolumbar 부분에서 지역 SNS 저밀도 나타납니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 2: 3D 이미징의 지방 조직에서 맥 관 구조. CD31 (같은 그림 3) psWAT 샘플의 immunostaining. 영화 플라이 쓰루 광학 섹션 (4 X는 dorsolumbar에서)와 psWAT의 사 타 구니 지역 보여줍니다 ~ 2 m m.의 총 깊이 CD31 표시 됩니다 빨간색. Autofluorescence는 청록색에 표시 됩니다. 모든 adipocytes 밀접 하 게 모세 혈관으로 둘러싸여 나타납니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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Adipo 명확한 지방 조직, 일반 랩 설치에서 쉽게 실행 될 수 있는 삭제 위한 간단 하 고 강력한 방법입니다. IDISCO 등 다른 용 매 기반 개간 방법 비교 / iDISCO +10,,1112, Adipo 클리어는 특히 지방 조직 및 다른 조직 높은 지방 콘텐츠를 지우기. Delipidation 단계 완전히 지방에서 지질을 제거 합니다 및 따라서 전체 조직에 걸쳐 immunolabeling를 용이 하 게 하 고 크게 XY 해상도의 손실 없이 엔드-투-엔드 이미징 수 있도록 가벼운 살포를 최소화 합니다. 형광 빛 시트 뿐만 아니라 현미경 confocal 큰 조직의 빠른 검색을 제공 하는 및 2 광자 현미경 사용할 수 있습니다 또한 높은 해상도 더 많은 정보를 얻기 위해.

메탄올/DCM을 기반으로 delipidation는 중요 한 단계입니다. 부족 한 delipidation는 조직의 핵심으로 특히, 이미지를 흐려에 발생할 수 있습니다. DCM에서 침 몰 하는 많은 샘플을 관찰 하 여 지질의 완전 제거를 보장 하기 위해 중요 하다. 조직 유형 (예를 들어, epididymal 지방 epididymis와 연결 된 고환)의 혼합물을 포함 하는 샘플 확장된 DCM 외피와도 완벽 하 게 싱크 하지 않을 수 있습니다. 그러나, 이러한 샘플 DCM에서 하룻밤 배양 완전 한 delipidation를 달성 해야 합니다. 이 유기 용 매에 있는 단백질의 변성으로 인해 특정 항 체 delipidation 단계와 호환 되지 않을 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜에 대 한 또 다른 중요 한 단계 된다 적합 한 항 체를 선택. 먼저 메탄올 처리 조직 단면도 또는 조직 Adipo 클리어 처리의 작은 조각에 항 체를 검사 하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 메탄올/DCM/DBE와 화학 염료의 호환성도 응용 하기 전에 테스트 해야 합니다.

프로토콜의 한 가지 한계는 endogenously 표현된 형광 단백질의 냉각. 유기 용 매 기반 delipidation 및 개간 단계 크게 이러한 단백질 변성. 내 인 성 형광 단백질을 시각화 하기 위해 항 체 라벨를 채택 될 필요. 적합 한 항 체 조합의 가용성 높은 이미징 다중화 수행 기능을 제한 합니다. 현재 사용 가능한 빛 시트 현미경만 최대 4 채널 이미지를 우리을 허용합니다.

Adipo 명확한 filamentous 구조와 지방 조직에 상대적으로 낮은 밀도가지고 세포 인구를 시각화에 대 한 특히 유용 합니다. 그러나, 고밀도 신호 이미징이 접근으로 제한 된다. 항 체 밀도 신호를 사용 하는 조직 내부에 접근을 차단 하는 샘플의 표면에 있는 epitopes에 의해 격리 될 수 있습니다. 따라서, 작은 화학 프로브는 조밀한 구조를 얼룩 것이 좋습니다. 같은 문제로 Adipo 클리어의 갈색 지방 조직에 응용 프로그램 제한 됩니다. 갈색 지방이 조밀한 구조를 가진 지방 창 고 이다. 조밀한 혈관 및 신경 신경 분포, 그것은 또한 밀접 하 게 작은 adipocytes 미토 콘 드리 아17의 많은 수를 포함 하는 포장. CD31와 일을 적용할 때 같은 얼룩 갈색 지방, 샘플의 표면에만 위에서 설명한 절차 분류 됐다 (데이터 표시 되지 않음). 또한, 갈색 지방 강한 조직 autofluoresence, 이미징 동안 낮은 신호 대 잡음 비율에 지도 생성 합니다. 갈색 지방이 더 작은 조각으로 잘라 하 고 가능 하면 화학 프로브를 사용 하는 것이 좋습니다.

전반적으로, Adipo 지우기 관심의 여러 구조의 동시 프로 파일링 수 전체 지방 조직에서 고해상도. 이 방법을 사용 하 여, 하나의 신경 예측, 맥 관 구조, 면역 세포, adipocytes 등 구조 전체 지방 패드를 통해 작용 하는 방법을 분석할 수 있습니다. 그것은 방지 단면 또는 관심 영역을 선택 하 여 편견된 이미징 데이터를 제공 합니다. Adipo 명확한 계보 추적 연구에서 체형 시 조 및 전조 세포의 분포 뿐만 아니라 초기 morphogenesis 이벤트 등 많은 개발 연구에 적용할 수 있습니다. 지방, 뿐만 아니라 Adipo 명확한 수 있습니다 또한 높은 지질 콘텐츠 또는 지방, 유선, 지방 림프절 등으로 둘러싸인 다른 조직의 3D 전체 산 분석을 촉진 한다. 이 메서드는 또한 생리 및 병 적인 조건에서 인간의 지방 조직 조직학을 공부 하는 기회를 제공 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리 크리스티나 Pyrgaki, 타오 통, 앨리슨 북쪽에 록펠러 대학 Bioimaging 리소스 센터에서 감사 하 고 지원 합니다. 우리는 또한 영화 편집: Xiphias Ge Zhu 감사합니다. 이 작품에서 인간 프론티어 과학 프로그램 조직 (PC)를 지원 했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x phosphate buffered saline Corning 21-040-CV
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148-1KG
Methanol Fisher Scientific A412SK-4
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-500ML
Tween 20 Sigma Aldrich P2287-500ML
Heparin Sigma Aldrich H3393-100KU
Dichloromethane Sigma Aldrich 270991
Hydrogen peroxide 30% Fisher Scientific 325-100
Benzyl ether Sigma Aldrich 108014
Agarose Invitrogen 16500500
Sodium azide Sigma Aldrich 71289-5G
Glycine Fisher Scientific BP381-1
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase Millipore AB152 1:200 dilution
Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 R&D Systems AF3628 Final concentration of 2 µg/mL
Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 Bio-Rad MCA1957 Final concentration of 2 µg/mL
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 711-605-152 Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 Invitrogen A11077 Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 712-605-153 Final concentration of 5-10 µg/mL
Imaging chamber ibidi 80287
Light sheet microscope LaVision BioTec Ultramicroscope II
Imaging software LaVision BioTec Imspector software
Microscopy visualization software Bitplane Imaris

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References

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Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제
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Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58271, doi:10.3791/58271 (2018).More

Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58271, doi:10.3791/58271 (2018).

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