Summary
وتمثل العمليات التي تحكم غزو سرطان المثانة فرصاً للعلامات البيولوجية والتنمية العلاجية. هنا نقدم نموذجا غزو سرطان مثانة الذي يتضمن الثقافة ثلاثي الأبعاد من الماغنيسيوم الورم والوقت الفاصل بين التصوير والفحص المجهري [كنفوكل]. هذا الأسلوب مفيد لتحديد ملامح عملية الغازية وفحص العوامل العلاجية.
Abstract
سرطان المثانة مشكلة صحية كبيرة. ويقدر أن أكثر من 000 16 شخص سيموتون هذا العام في الولايات المتحدة من سرطان المثانة. بينما 75% سرطان المثانة غير الغازية ومن غير المرجح أن السرطاني، تقدم حوالي 25% إلى نمط نمو الغازية. وسيضع يصل إلى النصف من المرضى الذين يعانون من حالات السرطان الغازية الانتكاس المنتشر الفتاكة. ومن ثم، فهم إليه تطور سرطان المثانة الغازية أمر حاسم للتنبؤ بنتائج المرضى ومنع الانبثاث قاتلة. في هذه المقالة، نحن نقدم نموذجا غزو سرطان ثلاثية الأبعاد التي تتيح إدراج الخلايا السرطانية ومكونات stromal لتقليد في فيفو الظروف التي تحدث في المثانة وورم المكروية. هذا النموذج يوفر الفرصة لمراقبة عملية الغازية في الوقت الحقيقي باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير، واستجواب المسارات الجزيئية المعنية باستخدام مركبات التصوير والشاشة إيممونوفلوريسسينت [كنفوكل] مع إمكانية غزو كتلة. وبينما يركز هذا البروتوكول على سرطان المثانة، فمن المرجح أنه يمكن استخدام طرق مماثلة لبحث الغزو وحركية في أنواع أخرى من الأورام، وكذلك.
Introduction
الغزو هو خطوة حاسمة في تطور السرطان، مما هو مطلوب لورم خبيث، ويرتبط مع بقاء أقل وسوء التشخيص في المرضى. في سرطان المثانة البشرية، خبيثة الأكثر شيوعاً للمسالك البولية الذي يتسبب في وفاة حوالي 165,000 سنوياً في جميع أنحاء العالم، ترتبط مباشرة مرحلة السرطان والعلاج والتشخيص على وجود أو عدم وجود الغزو1. حوالي 75% حالات سرطان المثانة غير العضلات الغازية، وهي تدار ببتر المحلية. وفي المقابل، سرطان المثانة العضلات الغازية (حوالي 25 في المائة من جميع الحالات) هي الأورام العدوانية مع ارتفاع معدلات المنتشر ويتم التعامل مع العدوانية موقفية العلاج2،3. ولذلك، فهم المسارات الجزيئية التي تؤدي إلى غزو ضروري لتوصيف مخاطر تطور الغازية أفضل وتطوير التدخلات العلاجية التي يمكن أن تحول دون تطور الغازية.
تطور الورم الغازية يحدث في بيئة (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد معقدة وتتضمن ورم الخلية التفاعل مع سائر الخلايا السرطانية وسدى والغشاء وأنواع أخرى من الخلايا، بما في ذلك الخلايا المناعية، والخلايا الليفية، وخلايا العضلات والأوعية الدموية خلايا بطانية. دعم نفاذية (مثلاً، ترانسويل) نظم التحليل وتستخدم عادة كوانتيتاتي سرطان الخلية غزو4، ولكن هذه النظم محدودة نظراً لأنها لا تتيح الرصد المجهري لعملية الغزو في الوقت الحقيقي استرجاع العينات لتلطيخ المزيد والتحليل الجزيئي التحدي. تطوير نظام كروي ورم المثانة ثلاثي الأبعاد لدراسة الغزو المرغوب فيه لأنه يسمح بإدماج مكونات ميكرونفيرونمينتال المعرفة مع توفير الراحة للنظم في المختبر .
في هذا البروتوكول، يصف لنا نظام استجواب العمليات الغازية من خلايا سرطان المثانة البشرية باستخدام مقايسة غزو كروي ثلاثي الأبعاد إدراج مصفوفات جل المستندة إلى الكولاجين والفحص المجهري [كنفوكل] للسماح لمحققين لرصد حركية الخلية و الغزو في الوقت الحقيقي (الشكل 1أ). هذا النظام هو تنوعاً ويمكن تعديلها لاستجواب مختلف ورم stromal/إعدادات. أنها تتضمن معظم خطوط خلايا سرطان المثانة أو أورام المثانة الأولية والخلايا اللحمية إضافية مثل السرطان المرتبطة الليفية والخلايا المناعية5،،من67. هذا البروتوكول توضح مصفوفة تتكون من الكولاجين 1 نوع، ولكن يمكن تعديلها لإدراج جزيئات أخرى مثل فيبرونيكتين أو لامينين أو بروتينات الكولاجين الأخرى. يمكن أن تتبع العمليات الغازية ح 72 أو أكثر اعتماداً على قدرة النظام المستخدمة والمجهر. التثبيت وتلطيخ الفلورة الورم جزءا لا يتجزأ من مصفوفة ثلاثية الأبعاد قبل وأثناء وبعد غزو يسمح استجواب upregulated البروتينات في الخلايا الغازية، وبالتالي توفير المعلومات الحاسمة التي عادة ما تكون غائبة أو صعوبة في جمع استخدام نماذج ثلاثية الأبعاد من ثقافة أخرى. ويمكن استخدام هذا النظام أيضا مركبات الشاشة التي منع الغزو، وتحدد مسارات إشارات المتضررين من هذه المركبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تزايد سرطان الماغنيسيوم
-
المتزايدة من خطوط الخلايا
- خلية شروط الثقافة الثقافة خلايا سرطان المثانة البشرية تحت ملتصقة التقليدية والاحتفاظ بحاضنة 37 درجة مئوية تزويد شركة 5%2. الحفاظ على الخلايا في < كونفلوينسي 90%.
ملاحظة: هو ثقافة وسائل الإعلام المستخدمة دولبيكو لتعديل الوسائط الأساسية الدنيا (دميم) التي تحتوي على 4.5 غرام/لتر د-الجلوكوز، ل الجلوتامين، بيروفات صوديوم 110 مغ/لتر، وتزويد 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في جميع أنحاء هذا البروتوكول. - يوم واحد قبل البدء التجربة، تريبسينيزي (باستخدام 0.25% يدتا التربسين) الخلايا، وقياس تركيز الخلية وتوزيع 1 × 106 خلايا في 3 مل الثقافة الإعلامية في كل بئر من صفيحة المرفق 6-جيدا جداً منخفضة.
- احتضان خلايا في شروط مرفق منخفضة عند 37 درجة مئوية إيه وان سيكس ح. هذا وينبغي إتاحة وقت كاف للخلايا للتجميع في الماغنيسيوم لمعظم خطوط الخلايا في سرطان المثانة.
ملاحظة: يمكن ملاحظة تشكيل الماغنيسيوم بالمجهر المقلوب الحقل مشرق. أن الحجم الأمثل وعدد من الماغنيسيوم قد تعتمد على التجارب الفردية، ولكن نجد أن الماغنيسيوم مع أقطار من 50 ميكرون إلى 150 ميكرون عموما مناسبة للوقت الفاصل بين التصوير باستخدام عدسة هدف X 20. - لإدراج أنواع خلية إضافية، مثل الخلايا الليفية أو الخلايا المناعية إلى الماغنيسيوم، مزيج الخلايا المطلوب مع الخلايا السرطانية في نسبة المطلوب (1:1، 01:10، إلخ.) في ملحق منخفضة للغاية لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية ح إيه وان سيكس للسماح بتشكيل الماغنيسيوم نوع الخلية المختلطة.
- خلية شروط الثقافة الثقافة خلايا سرطان المثانة البشرية تحت ملتصقة التقليدية والاحتفاظ بحاضنة 37 درجة مئوية تزويد شركة 5%2. الحفاظ على الخلايا في < كونفلوينسي 90%.
-
المتزايدة من الأورام الأولية
ملاحظة: مصادر الورم يمكن أيضا استخلاص الماغنيسيوم من ورم المثانة الأولية مثل الأورام المتقدمة من ورم المثانة الناجمة عن مادة مسرطنة نماذج8. على سبيل المثال، أورام المثانة المتولدة من الفئران التي تتغذى على ن-بوتيل-ن-(4-هيدروكسيبوتيل) النيتروسامين (BBN)، يمكن حصادها ومفروم إلى قطع صغيرة (حوالي 0.5 مم3) استخدام الأدوات الجراحية المعقمة. هضم العينات الأولية من المثانة البشرية يمكن أيضا دراسة الأمراض السرطانية في هذا النظام.- جمع وتغسل 0.5 مم3 قطع الورم في 5 مل المثلج مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة الغسيل مرة واحدة.
- جمع قطع الورم بالطرد المركزي في x 200 غ لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وإضافة 5 مل دميم التي تحتوي على 10% FBS. نقل ورم كروي/وسائط مزيج لصفيحة مرفق 6-جيدا جداً منخفضة. احتضان في 37 درجة مئوية إيه وان سيكس ح قبل تضمينها في مصفوفة الكولاجين (راجع الخطوة 2، 3).
2-إعداد دائرة الثقافة ثلاثي الأبعاد
-
يضعف الكولاجين النوع-1 (مشتقة من ذيل فأر) في دميم التي تحتوي على 10% FBS لجعل خليط 2 مغ/مل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- وباختصار، مزيج الكولاجين مع كمية مناسبة من حل هيدروكسيد الصوديوم ن 1 ودميم بيبيتينج لطيف استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة لتحقيق الأس الهيدروجيني الفسيولوجي.
- بعد خلط الكولاجين ودميم، بسرعة معطف آبار الشريحة الدائرة (بالنسبة لمعظم التطبيقات، شرائح الدائرة مع تغطية عدد 1.5-كوب الأمثل) مع الكولاجين-دميم المخلوط قبل التجميد (200 ميليلتر في البئر). تسمح الشريحة المغلفة الدائرة أن تكون ثابتة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: يمكن تعديل تكوين مصفوفة المستندة إلى الكولاجين عن طريق إضافة مكونات المصفوفة خارج الخلية الأخرى، مثل فيبرونيكتين أو لامينين، وفقا لأغراض التجربة.
- بلطف بيبيت 500 ميليلتر من الوسائط التي تحتوي على الماغنيسيوم (أو قطع الورم، إذا تم استخدام عينة الورم الرئيسي) من لوحة المرفق 6-جيدا جداً منخفضة في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 فارغة. انتظر 2 دقيقة للسماح الماغنيسيوم تسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
- بعناية إزالة المادة طافية من الأنبوب. إعداد أنبوب آخر من نوع-1 الكولاجين (2 مغ/مل) مختلطة مع دميم التي تحتوي على 10% FBS وإضافة 500 ميليلتر من هذا الخليط بسرعة الماغنيسيوم. بلطف مزيج الماغنيسيوم والكولاجين ببطء بيبيتينج.
- إضافة 250 ميليلتر من خليط الماغنيسيوم/الكولاجين إلى بئر شريحة الدائرة المغلفة من قبل الكولاجين. السماح الكولاجين مصفوفة تحتوي على الماغنيسيوم على ترسيخ تماما (حوالي 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية).
- بعد هو توطد المصفوفة الكولاجين، إضافة 1 مل دميم التي تحتوي على 10% FBS لكل بئر (الشكل 1ب). احتضان شريحة الدائرة في حاضنة 37 درجة مئوية تزويد 5% CO2 حتى جاهزة للتصوير.
3-يعيش خلية الوقت الفاصل بين التصوير
- تشغيل المجهر [كنفوكل] اتباع إرشادات الشركة المصنعة والتأكد من أن الدائرة المناخ تصل إلى 37 درجة مئوية، ويتم تزويد شركة 5%2.
ملاحظة: لدينا قاعة ومجهر عادة ما تتطلب ح 1 للوصول إلى توازن النظام. - بعناية بنقل الشريحة الدائرة إلى محول الشرائح المرفقة بالمجهر.
- موقع الماغنيسيوم اهتمام باستخدام طاقة منخفضة وهدف (مثلاً، 5 س) وبدء التصوير بهدف السلطة العليا (في البروتوكول الحالي، يتم استخدام 20 X الهدف بالنسبة لتصوير الخلايا الحية لأن جودة الصورة أفضل).
ملاحظة: لعينات الورم الابتدائي المثانة، 5 X 10 X أهداف قد يلزم ومن أجل تغطية أكبر منطقة التصوير. لدينا الوقت الفاصل بين التصوير، يتم تعيين الفاصل الزمني التصوير ك 30 دقيقة وتستخدم كدسة Z لصورة كروي كله. عادة المسافة بين Z-شرائح يتم تعيين إلى 4 ميكرومتر 20 س والهدف والمسافة الإجمالية لمحور Z هو حوالي 200 ميكرومتر. الصور يمكن الحصول عليها باستخدام DIC ومع الأسفار إذا أنسجة خلايا/ميناء علامات البروتين الفلورسنت. - إجراء تصوير مرور الزمن ح 24 – 72.
ملاحظة: يتم تحديد المدة حسب نوع الخلية واحتياجات التجربة.
4-إعداد كتلة العينة التي تحتوي على الماغنيسيوم السرطان لتقطيع الأنسجة المجمدة
- رفع كتلة هلام الكولاجين والماغنيسيوم من الشرائح الدائرة بعناية باستخدام الملقط الصغيرة. وضع كتلة هلام الكولاجين في الأنسجة بلاستيكية العفن.
- شطف جل الكولاجين مع 1 x PBS بإيجاز ومن ثم إصلاحه مع بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: منهاج عمل بيجين هو مادة مسرطنة محتملة وينبغي التعامل معها بحذر. - أغسل جل الكولاجين مع 1.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني حول شاكر لاستبدال 15 دقيقة برنامج تلفزيوني وكرر الخطوة السابقة الغسيل 3 x.
- تطبيق طبقة رقيقة (حوالي 3 مم) قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مجمع لتغطية الجزء السفلي من العفن الأنسجة البلاستيكية الجديدة. ضع الثابتة وغسلها جل الكولاجين على رأس OCT مركب، ثم تضمين بعناية الجل كله عن طريق ملء القالب مع أكتوبر مجمع مع تجنب تشكيل أي فقاعات الهواء في OCT.
- ترك العفن في 4 درجات مئوية عن ح 1.
- ضع القالب الذي يتضمن عينة وأكتوبر مجمع على طبق بيتري 100 ملم تطفو على النتروجين السائل. تسمح العينة لتجميد فلاش تماما.
- تخزين كتلة العينة المجمدة في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
5-الفلورة تصوير الماغنيسيوم السرطان مقطعة مجمدة
- نقل كتلة العينة المجمدة من الثلاجة-80 درجة مئوية إلى الدائرة-20 درجة مئوية كريوستات.
-
أداء تمزيقها المجمدة التقليدية بتعيين فاصل المقطع إلى 7 ميكرومتر. اسمحوا عينات مقطعة نعلق على الشريحة الزجاجية دون التجاعيد أو المحاصرين الجوية.
- تخزين الشرائح في-80 درجة مئوية قبل القيام بتلوين المزيد.
ملاحظة: يمكن استخدام فترات زمنية مختلفة لتناسب الاحتياجات التجريبية.
- تخزين الشرائح في-80 درجة مئوية قبل القيام بتلوين المزيد.
- الهواء الجاف للشرائح ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- بيرميبيليزي العينات مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5% X-100 تريتون لمدة 15 دقيقة.
- أغسل عينات x 3 مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة للمياه والصرف الصحي.
- تطويق هذه العينات على الشريحة بالحواجز مسعور باستخدام قلم حاجز مسعور.
- معالجة العينات بعرقلة الحل (1 x برنامج تلفزيوني يحتوي على 5% من ألبومين المصل البقري (BSA))، ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- تطبيق ميليلتر 40 من الحل الأساسي الذي يحتوي على الأجسام المضادة (1 x برنامج تلفزيوني يحتوي على 5% جيش صرب البوسنة، مع تخفيف 1: 100 من جسم الأولية) لكل عينة على الشريحة.
- احتضان الشرائح في جسم الأولية في 37 درجة مئوية ح 1 أو في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها (وقت الحضانة وشروط تختلف اعتماداً على جسم الأولية).
- أغسل عينات x 3 مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة (الواحدة والمياه والصرف الصحي).
- تطبيق ميليلتر 40 الثانوية التي تحتوي على جسم الحل (1 x برنامج تلفزيوني يحتوي على 5% من جيش صرب البوسنة مع رافعة جسم الثانوي تمييع) لكل عينة على الشريحة.
- أغسل عينات x 3 مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة (الواحدة والمياه والصرف الصحي).
- وصمة عار العينات مع الحل هويشت 33342 (1 ميكروغرام/ملليلتر، تضعف في برنامج تلفزيوني) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم أغسل العينات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- تحميل العينات مع تصاعد المتوسطة وغطاء لهم مع كشوف تغطية حجم مناسب. اترك الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة ح 24، ثم قم بإجراء الفحص المجهري [كنفوكل].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتطلب نجاح إنشاء كروي ورم سرطان المثانة الغازية تشكيل الماغنيسيوم ورم حجم مناسب من خطوط الخلايا أو الأورام الأولية. الشكل 2 يظهر حجم مناسب الماغنيسيوم المتقدمة من أربعة خطوط الخلايا لسرطان المثانة البشرية (أم-UC9، أم UC13، أم-UC14، 253J، وأم-UC18). الشكل 2 ويبين ب كروي ورم من ورم مثانة المولدة بواسطة BBN ماوس المضمنة في مصفوفة الكولاجين. تم تضمين هذه الماغنيسيوم كما هو موضح أعلاه، وتم القبض على الصور الممثل باستخدام مجهر مجهزة لتصوير الخلايا الحية. واستخدمت عدسة الهدف X 20 للتصوير أم-UC9 وأم UC13 وأم UC14 والماغنيسيوم أم-UC18، حين درست الماغنيسيوم ورم المثانة الماوس استخدام العدسات الهدف X 10 و 5 X.
صور الممثل من الماغنيسيوم خط الخلية المثانة البشرية بعد 24-72 ساعة (الشكل 2أ) والماوس BBN الابتدائي المثانة ورم الماغنيسيوم (الشكل 2ب) إثبات الهجرة سرطان المثانة في مصفوفة الكولاجين. 253J، خط خلية غير الغازية، وتبقى على حالها إلى حد كبير مع الهجرة قليلاً أو لا (الشكل 2أ). كليب 1و 2و 3 إثبات عملية غزو الوقت الفاصل بين أم UC9 وأم UC13 والماغنيسيوم أم-UC14، على التوالي. 4 الفيديو يظهر خصائص غزو كروي أم UC18. 5 فيديو يبين مجالات اثنين من ورم المثانة الماوس من ح 66 إلى تضمين الكولاجين بعد ح 87.
لإثبات إمكانية استخدام الفلورة تلطيخ علامات البروتين في أعمالنا الماغنيسيوم الورم الغازية، أنها ثابتة والملون في 24 أو 72 يظهر الشكل 3 h. الملون عينات ممثلة للمجموعة ترنح-توسع الشعريات د المرتبطة (أتدك، يعرف أيضا باسم TRIM29)، البروتين بروتين الذي يلعب دوراً هاما في التقدم توموريجينيسيس وسرطان المثانة البشرية وسرطان البنكرياس9،10، توبولينس (α و β)، التي تشكل microtubules و تلعب دوراً رئيسيا في تشكيل الخلية والحركة الخلوية11،12، كيراتين 14 (KRT14)، علامة الظهارية القاعدية تشارك في غزو13، وفيمنتين (VIM)، علامة الوسيطة14،15، 16. وتبين هذه الصور أن التصور الهياكل الخلوية وسوبسيلولار يمكن أن يؤديها باستخدام هذه المنهجية. تعرض طريقة العرض التكبير أعلى من أم-UC14 الخيطية تلطيخ أتدك (الشكل 3أ). الخلايا الغازية عاليا نشرها من الماغنيسيوم أم-UC18 بعد 24 ساعة غزو الإعراب عن مستوى عال من فيم، علامة على مرحلة انتقالية الظهارية للوسيطة (EMT، الشكل 3ب).
إدراج خلية مختلفة الأنواع (المرتبطة بسرطان الخلايا الليفية) في الماغنيسيوم الورم الممكن ويوفر وسيلة لدراسة التفاعلات بين مغايرة خلية-خلية (الشكل 4 و 6 فيديو). في هذا المثال استخدمنا ومضان أحمر البروتين (RFP)-الليفية البشرية المسمى وسرطان المثانة 253J الخلية خط ترانسدوسيد مع ناقل للتعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل). هذه الخلايا كانت مختلطة بشكل ورم الماغنيسيوم وجزءاً لا يتجزأ من الكولاجين. عملية غزو يرصدها مجهرية [كنفوكل]. الشكل 4 يوضح أن التفاعل مع الخلايا الليفية يمكن أن تعدل السلوك الغازية في 253J.
يوضح الشكل 5 الأداة المساعدة لنظام الفحص لاختبار مثبطات للغزو. سيتوتشالاسين د هو مثبط معروفة للهجرة الخلية والغزو الذي يعمل بحظر أكتين البلمرة17،18 وكان يستخدم كمثال. العلاج سيتوتشالاسين د تعوق غزو الماغنيسيوم أم-UC9 (الشكل 5ألف). نفس تركيز سيتوتشالاسين د (0.2 ميكرومتر) قادرة جزئيا تحول دون غزو الماغنيسيوم أم-UC18 (الشكل 5ب). حيث يمكن استخدام النظام الصورة في العديد من الآبار وورم أورجانويدس في نفس الوقت، أنها قابلة للفحص فريق محدود من عوامل دوائية للتأثير على الغزو.
الشكل 1 : الإعداد للمقايسة غزو ثلاثية الأبعاد مع تصوير الخلية الحية- (أ) نظرة عامة التخطيطي لتصوير ثلاثي الأبعاد خلية حية والفلوره. (ب) ساترة الدائرة مع الكولاجين والوسائط المستخدمة في هذه التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : سرطان المثانة كروي الغزو. (أ) أمثلة من المثانة البشرية سرطان الخلية خط الماغنيسيوم جزءا لا يتجزأ من مصفوفة جل الكولاجين. يتم إظهار الماغنيسيوم في الوقت لتضمين (0 ح، الصف العلوي) أو بعد 72 ساعة (أم-UC9، أم UC13، أم UC14، 253J) أو ح 24 (أم-UC18). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) الماوس المستحثة بأمثلة من BBN المثانة ورم الغزو في مصفوفة الكولاجين. تشير الأسهم إلى حافة كروي الورم الغازية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحليل الفلورة الماغنيسيوم سرطان المثانة الغازية. (أ) أم-UC14 ورم كروي بعد 72 ساعة غزو في الكولاجين. كانت عينات الملون بمقايسة الفلورة التقليدية أتدك (الأخضر)، توبولين (البنفسجي)، ونوى (هويشت وصمة عار الأزرق). يشير المربع الأبيض إلى المنطقة أعلى عرض التكبير تظهر في أسفل الصف حق فريقي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) أم-UC18 الورم الماغنيسيوم الملون ل KRT14 (الأخضر)، فيم (أحمر)، أتدك (البنفسجي)، ونوى (هويشت وصمة عار الأزرق) بعد 24 ساعة غزو في الكولاجين. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الأبيض مربع يشير إلى المنطقة مع أعلى عرض التكبير تظهر في اللوحة اليسرى السفلي. ويشير خط متقطع تقريبا إلى حدود كروي الورم الأصلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الورم المسمى فلوريسسينتلي كروي دمج الخلايا الليفية. غزو الخلايا السرطانية المسمى بروتينات فلورية خضراء 253J المثانة وحدها (لوحات أسفل) أو مثقف يشترك مع المسمى RFP الليفية (لوحات العلوي) رصد 24 h. مقياس بار = 50 ميكرومتر. غزو تتعزز مع إضافة الليفية لنظام الثقافة (اللوحة العلوية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : تأثير المخدرات الجزيئية صغيرة تستهدف بلمرة الأكتين في غزو. (أ) كروي الورم UC9 أم تعامل مع سيتوتشالاسين د (0.2 ميكرومتر) أو [دمس] (التحكم بالسيارة) ورصد حاء – 72 (ب (أم-UC18 ورم كروي تعامل مع سيتوتشالاسين د أو [دمس] ل h. 24 مقياس بار = 50 ميكرومتر. خط متقطع بشرط يشير إلى الحدود الأصلية كروي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المشكلة المحتملة | الحل الموصى به |
| عدد منخفض من الماغنيسيوم قابلة للتطبيق | • زيادة عدد الخلايا المستزرعة في تعليق • ضمان > 90% خلايا قابلة للتطبيق بعد تيبسينيزيشن • الاختيار خلايا للتلوث • الحفاظ على الخلايا في النمو لوغاريتمي قبل تيبسينيزينج • تحسين وسائل الإعلام ثقافة الخلية • تعديل وقت الثقافة في حالة تعليق • حاول خطوط خلايا بديلة |
| الماغنيسيوم كبيرة جداً أو صغيرة جداً | • ضبط عدد الخلايا إضافة إلى لوحة مرفق منخفضة • استخدام لطيف بيبيتينج لتحطيم أكبر خلية المجاميع |
| صعوبة في التركيز أثناء تخيل | • ضبط سمك جل الكولاجين. للأهداف بمسافة قصيرة من العمل، في محاولة لجعل الكولاجين هلام أرق. • ضمان أن الشريحة الدائرة أو ساترة هو #1.5 • تحسين حجم الماغنيسيوم (50-150 ميكرومتر في القطر) |
| ترحيل الخلايا خارج منطقة التصوير أثناء الغزو بالانزيم | • تقليل حجم الماغنيسيوم • إعادة مركز منطقة التصوير كل 24 ساعة إذا لزم الأمر • إشراك تبليط تكنولوجيا التصوير (إذا كان قابلاً للتطبيق) لتغطية مساحة أكبر • النظر في استخدام خطوط بديلة الخلية |
| شريحة الدائرة يجف | • ضمان وجود لا تسرب في إعداد دائرة المناخ • ضمان إليه مراقبة الرطوبة الوظيفية |
الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها بنموذج ثلاثي الأبعاد من الغزو.
الفيديو 1: إظهار الفيديو الوقت الفاصل بين UC9 أم كروي مثقف في الكولاجين من 0 إلى حاء 72 من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 2: الوقت الفاصل بين شريط فيديو يظهر الهجرة الجماعية من كروي أم-UC13 المستزرعة في الكولاجين من 0 إلى حاء 72 من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
3 الفيديو: فيديو كروي أم-UC14 المستزرعة في الكولاجين من 0 إلى حاء – 72 والوقت الفاصل بين من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
4 الفيديو: فيديو كروي أم-UC18 المستزرعة في الكولاجين من 0 إلى 24 حاء والوقت الفاصل بين من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
5 الفيديو: فيديو الوقت الفاصل بين أورام المثانة الماوس التي يسببها BBN 66–ح 84 الكولاجين بعد تضمينها. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 6: الوقت الفاصل بين شريط فيديو يظهر الماغنيسيوم السرطان تتكون من الخلايا المسماة بروتينات فلورية خضراء 253J مختلطة مع طلب تقديم العروض المسمى البشرية الليفية (يسار) أو بروتينات فلورية خضراء المسمى 253J الخلايا وحدها (يمين). كانت جزءا لا يتجزأ من الكولاجين الماغنيسيوم ورصدها ل 24 h. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يصف لنا نموذج كروي ورم ثلاثية الأبعاد التي تتيح المراقبة في الوقت الحقيقي من غزو سرطان المثانة هو أمر حاسم لتقدم وتطور سرطان خبيث. وهذا النظام قابلة لإدماج مختلف مكونات stromal والخلوية السماح لمحققين بالخص أفضل المكروية الأنسجة التي تتم فيها غزو سرطان المثانة. الماغنيسيوم سرطان المثانة يمكن أن تتولد من مصادر مختلفة مثل خطوط الخلايا (بما في ذلك خطوط الخلايا المحورة جينياً مفيدة للنظر في إشارات المسارات التي تؤثر على عمليات الغزو)، والماوس الأساسي الأورام (الموصوفة هنا). يمكن أن يحتمل أن يمكن تكييفها أيضا لتحليل الورم الرئيسي البشرية. اعتماداً على نظام التصوير المستخدمة، يمكن رصد الأسفار في الوقت الحقيقي أو بالتثبيت والفلوره تلطيخ في نقاط زمنية مختلفة. يمكن أيضا استخدام النظام لاختبار مثبطات المحتملة لغزو. وهذا يجعل النظام أداة مرنة وقوية لتقييم بيولوجيا سرطان المثانة.
نظام الفحص المجهري [كنفوكل] بدائرة مناخ الذي يوفر التحكم في درجة الحرارة والتحكم في الرطوبة والعرض2 CO قطعة رئيسية من المعدات لبناء نموذج الموصوفة في هذا البروتوكول.
وقد أبلغ على نطاق واسع أن الثقافات ثلاثي الأبعاد يوفر ميكرونفيرونمينتس المتخصصة التي تحاكي أفضل الأنسجة الأصلية لخلية علم الأحياء والسرطان دراسات19،20. تعتمد العديد من الدراسات على نفاذية الأغشية إدراج فحوصات لا تعكس الظروف تحت الغزو الذي يحدث في الجسم الحي. علاوة على ذلك، تسمح هذه الدراسات التقليدية من السهل رصد عملية الغزو في طريقة في الوقت الحقيقي، لا تحليلاً مفصلاً لعينات خلال أو غزو التالية. هنا وصفت لنا نظاما مفيداً لكليهما في الوقت الحقيقي والاستجواب نقطة النهاية لبيولوجيا السرطان الغازية.
الكولاجين هو عنصر هام في المصفوفة الخلوية إضافية (ECM)، وتوجد في أشكال عديدة. الكولاجين النوع-1 هو الشكل السائد للكولاجين فيبريلار بينما هو الكولاجين 4 نوع الكولاجين نونفيبريلار المكونة للغشاء21. الخلايا السرطانية يجب اختراق الغشاء الطابق السفلي والتحرك من خلال نوع-1 الكولاجين أثناء التقدم غير الغازية للأورام الغازية22. نظراً لوجودها في كل مكان في إدارة المحتوى في المؤسسة، استخدمت الكولاجين النوع-1 كمصفوفة لبناء ثقافات ثلاثي الأبعاد، والتي تحاكي ECM أفضل من ثقافة ثنائية الأبعاد الطبق5،،من623. بينما النظام المبين هنا استناداً إلى مصفوفة الكولاجين النوع-1، فإنه يمكن تعديلها لتشمل مكونات stromal الأخرى استناداً إلى مسألة تجريبية، وحاجة.
المنهجية التي نستخدمها لتوليد الماغنيسيوم سرطان المثانة من خطوط الخلايا ينطوي على ثقافة الخلية في الظروف منخفضة-مرفق وتجميع الخلية. ليست كافة الخلايا يمكن أن يتسامح مع هذه الظروف الثقافة والبعض قد يخضع للمبرمج أو تشكيل مجاميع فضفاضة أن ننأى خلال الكولاجين تضمين عملية. تعديل الوقت الثقافة، رقم الهاتف الخلوي أو إدراج أنواع الخلايا الأخرى في تعليق يمكن تحسين النتائج. خطوط الخلايا المحددة لهذا الفحص يعتمد على هدف التجربة. لقد استخدمت بنجاح هذا الأسلوب مع خطوط خلايا سرطان المثانة البشرية الفريدة 7/7. ومع ذلك، من الممكن أن بعض خطوط الخلايا قد لا تكون مناسبة لهذا الإعداد التجريبية. وعلاوة على ذلك، أن بعض خطوط الخلايا النمط الظاهري الغازية جداً، الأمر الذي يؤدي إلى عدم اقتران المبكر الماغنيسيوم، والخلايا السرطانية التي تتحرك خارج منطقة المراقبة خلال التجربة بمرور الزمن. ينصح تجارب رائدة لفهم السلوك العام لخطوط الخلايا لتحديد أفضل الأطر الزمنية للدراسات. استكشاف الأخطاء وإصلاحها للقضايا المشتركة مع جيل كروي وتصوير مسرود في الجدول 1.
هذا النظام مناسبة لفحص مركبات دوائية مع إمكانية غزو خلايا السرطان كتلة محدودة. هنا استخدمنا د سيتوتشالاسين، مثبط نفاذية خلية بلمرة الأكتين، ولتوضيح هذا التطبيق المحتملة18. كما هو موضح أعلاه، 0.2 ميكرون من سيتوتشالاسين د فعال يحول دون غزو الماغنيسيوم أم UC9 وأم UC18. عن طريق استخدام الدوائر المتعددة الشرائح والتحكم الآلي المرحلة مجهرية، تأثير مركبات متعددة على غزو كروي الورم أمر ممكن.
على الرغم من أن هذه الاختبارات الأنسب لوصف السلوك الغازية نوعيا، التحديد الكمي لحجم الهجرة والغزو أيضا عمليا. الحصول على صور الماغنيسيوم في بداية التجربة، وفي نقاط زمنية مختلفة، واللاحقة صورة التحليل لقياس المسافة الخطية الأبعد من الغزو في العاشر، يمكن أن توفر توجيهات Y أو Z التقدير الكمي للسلوك المهاجرة الغازية. يمكن استخدام صورة أكثر تقدما تحليل استخدام المسمى فلوريسسينتلي الخلايا لتعريف وكوانتيتاتي خلايا فردية أو خلية نوع السلوك تبعاً لحاجة تجريبية أو السؤال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر مختبر الدكتور هوارد كراوفورد (جامعة ميشيغان) للدعم التقني وتوفير المواد والمعدات اللازمة لهذه الدراسة، والن كيلر للدعم التقني.
تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جامعة مركز السرطان ميشيغان روجل الأساسية منحة CA046592 26S3، K08 المعاهد الوطنية للصحة CA201335-01A1 (حزب العمال التقدمي)، يا BCAN (حزب العمال التقدمي)، CA17483601A1 R01 المعاهد الوطنية للصحة (DMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M.
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M.
