Summary
Процессы, регулирующие вторжения рака мочевого пузыря представляют возможности для биомаркеров и терапевтические развития. Здесь мы представляем модели вторжения рака мочевого пузыря, которая включает 3-D культуры сфероидов опухоли, покадровой изображений и confocal микроскопии. Этот метод полезен для определения особенностей процесса инвазивных и скрининг терапевтических агентов.
Abstract
Рак мочевого пузыря является проблемой значительного здравоохранения. Предполагается, что более чем 16.000 человек умрет в этом году в Соединенных Штатах от рака мочевого пузыря. В то время как 75% рака мочевого пузыря, неинвазивная и вряд ли могут метастазировать, около 25% прогресс для инвазивного роста. До половины пациентов с инвазивным раком будет развивать смертоносного метастатического рецидива. Таким образом понимание механизма инвазивных прогрессии рака мочевого пузыря имеет решающее значение для прогнозировать исходы и предотвращения смертоносных метастазов. В этой статье мы представляем трехмерной рака вторжения модель, которая позволяет включение опухолевых клеток и стромы компонентов для имитации условий в vivo происходящих в микроокружения опухоли мочевого пузыря. Эта модель обеспечивает возможность наблюдать инвазивных процесс в режиме реального времени с использованием промежуток времени визуализации, допрашивать молекулярные пути, связанные с помощью конфокальной immunofluorescent изображений и экран соединений с потенциалом для блока вторжения. Хотя этот протокол фокусируется на рак мочевого пузыря, вполне вероятно, что подобные методы могут использоваться для изучения вторжения и подвижности в других типов опухолей, а также.
Introduction
Вторжение является важнейшим шагом в прогрессии рака, который необходим для метастазов и связан с нижней выживания и плохим прогнозом у больных. В человеческой мочевого пузыря рак, наиболее распространенных злокачественных мочевых путей, которое вызывает около 165 000 смертей в год во всем мире, непосредственно связаны с наличие или отсутствие вторжения1стадия рака, лечение и прогноз. Около 75% случаев рака мочевого пузыря мышц инвазивных и являются управляемые с местными резекции. Напротив неинвазивного мышц мочевого пузыря рак (около 25% всех случаев) являются агрессивные опухоли с высокой метастатических и обрабатываются с агрессивным мультимодальность терапии2,3. Таким образом важно понимание того молекулярные пути, которые вызывают вторжения лучше характеризуют риска инвазивного прогрессии и разработать терапевтические вмешательства, которые могут предотвратить инвазивное прогрессии.
Инвазивные прогрессии опухоли происходит в среде сложной трехмерной (3-D) и включает в себя взаимодействие клеток опухоли с другие опухолевые клетки, строма, базальной мембраны и других типов клеток, в том числе иммунных клеток, фибробластов, мышечных клеток и сосудов эндотелиальные клетки. Проницаемых поддержки (например, Transwell) анализа систем обычно используются, чтобы quantitate раковых клеток вторжения4, но эти системы ограничены, потому что они не позволяют микроскопических мониторинг процесса вторжения в режиме реального времени и получение образцов для дальнейшего окрашивания и молекулярный анализ является сложной задачей. Разработка системы сфероида опухоли 3-D мочевого пузыря для изучения вторжения желательно, потому что она позволяет включение определенных microenvironmental компонентов с удобством в vitro системах.
В этом протоколе, мы описать систему допросить инвазивных процессов человека пузыря раковых клеток с помощью пробирного вторжения 3-D сфероида, включающих матрицы геля на основе коллагена и confocal микроскопии позволяет следователям для мониторинга клетки моторики и вторжение в режиме реального времени (рис. 1А). Эта система является универсальным и может быть изменено для допроса различных стромальные опухоли/параметры. Это может включать большинство линий клеток рака мочевого пузыря или опухоли мочевого пузыря первичных и дополнительных стромальные клетки, таких, как рак, связанные фибробластов и иммунные клетки5,6,7. Этот протокол описывает матрицы состоит из коллагена типа-1, но может быть изменен для включения других молекул, например, фибронектин, Ламинин или других белков коллагена. Инвазивных процессов может следовать за 72 ч или больше в зависимости от возможности микроскопа и используемой системы. Фиксация и иммунофлюоресценции окрашивание опухоли, встроенные в матрице 3-D до, во время и после вторжения позволяет допроса upregulated белков в инвазивных клеток, обеспечивая тем самым важную информацию, которая обычно отсутствует или собрать трудно использование других моделей 3-D культуры. Эта система также может использоваться для экрана соединений, которые блокируют вторжение и разграничить сигнальных путей, пострадавших от таких соединений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. рост рака сфероидов
-
Растущий из клеточных линий
- Культура человека пузыря раковые клетки под обычными приверженца клетки культуры условий и поддерживать в инкубаторе 37 ° C, поставляется с 5% CO2. Сохранить клетки в < 90% confluency.
Примечание: носители культуры является Дульбекко изменение минимальных основных СМИ (DMEM), содержащий 4,5 г/Л D-глюкоза, L-глютамин, пируват натрия 110 мг/Л и поставляется с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) на протяжении всего настоящего Протокола. - Один день до начала эксперимента, trypsinize (с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА) клетки, количественного определения концентрации клеток и распространять 1 х 106 клеток в 3 мл культуры средств массовой информации в каждой скважине 6-ну сверхнизкие крепежной пластиной.
- Инкубации клеток в условиях низкой вложений при 37 ° C для ≥16 h. Это должно позволить достаточное время для ячеек в совокупности в сфероидов для большинства линий клетки рака мочевого пузыря.
Примечание: Формирование сфероидов можно наблюдать Перевернутый светлые области микроскопа. Оптимальный размер и количество сфероидов может зависеть от отдельных экспериментов, но мы находим, что сфероидов с диаметрами от 50 мкм до 150 мкм, обычно подходят для покадровой изображений с использованием 20 X объектив. - Включить дополнительные ячейки типы, такие как фибробластов или иммунные клетки в сфероидов, смешивать нужные ячейки с раковых клеток на нужное соотношение (1:1, 1:10, и т.д.) в ультра-низким уровнем вложения пластины и инкубировать при 37 ° C для ≥16 h разрешить формирование смешанные клетки типа сфероидов.
- Культура человека пузыря раковые клетки под обычными приверженца клетки культуры условий и поддерживать в инкубаторе 37 ° C, поставляется с 5% CO2. Сохранить клетки в < 90% confluency.
-
Рост от первичной опухоли
Примечание: Опухоль сфероидов также могут быть получены от опухоли мочевого пузыря первичных источников, например опухоли превратилось от опухоли мочевого пузыря канцероген индуцированной модели8. Например, опухоли мочевого пузыря, созданные от мышей кормили с N-бутила (4-hydroxybutyl) - N - нитрозамины (BBN), может быть собран и фарш на мелкие кусочки (около 0,5 мм3) используя стерильные хирургические инструменты. Переваривается первичные пробы человека мочевого пузыря, рак может также учился в этой системе.- Собирать и мыть 0,5 мм3 опухоли штук в 5 мл ледяной фосфат амортизированное saline (PBS). Центрифугирование в 200 x g 5 мин при 4 ° C. Повторите этот шаг Стиральная один раз.
- Собирать кусочки опухоли центрифугированием на 200 x g 10 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и добавьте 5 мл DMEM, содержащие 10% FBS. Передать опухоли сфероида/СМИ смесь 6-ну сверхнизкие крепежной пластиной. Инкубировать при 37 ° C для ≥16 h до встраивания в коллагеновой матрицы (см. шаг 2.3).
2. Подготовка камеры 3-D культуры
-
Разбавить тип-1 коллагена (производный от крыс хвост) в среде DMEM, содержащие 10% FBS сделать 2 мг/мл смеси согласно инструкциям производителя.
- Короче говоря Смешайте коллаген с соответствующим количеством 1 N NaOH решения и DMEM нежный дозирование по инструкциям производителя для достижения физиологический рН.
- После смешивания коллагена и DMEM, быстро пальто скважин слайд камеры (для большинства приложений, палата слайды с число 1,5-стеклом является оптимальным) с коллагена DMEM смеси до затвердевания (200 мкл/хорошо). Разрешить покрытием палата слайд, чтобы быть стационарные при комнатной температуре в течение 15 мин.
Примечание: Состав коллагена основе матрицы можно изменять, добавляя другие ингредиенты внеклеточного матрикса, например фибронектин или Ламинин, согласно целей эксперимента.
- Аккуратно накапайте 500 мкл СМИ, содержащий сфероидов (или опухоль штук, если используется образец первичной опухоли) из 6-ну сверхнизкие крепежную пластину в пробки microcentrifuge пустой 1,5 мл. Подождите 2 мин, чтобы поселиться в нижней части трубки сфероидов.
- Осторожно удалите супернатант из трубки. Подготовить другой трубки типа-1 коллагена (2 мг/мл) смешивается с DMEM, содержащие 10% FBS и быстро добавить 500 мкл этой смеси сфероидов. Осторожно Смешайте сфероидов и коллагена, Медленное дозирование.
- Добавьте 250 мкл сфероидов/коллаген смесь в хорошо коллагена pre покрытием палата слайда. Разрешить коллагеновой матрицы, содержащие сфероидов закрепить полностью (около 30 минут при 37 ° C).
- После затвердевшим коллагеновой матрицы, добавьте 1 mL DMEM, содержащие 10% FBS для каждой скважины (рис. 1Б). Инкубируйте в камере слайд инкубатора 37 ° C, поставляется с 5% CO2 до готовности для изображений.
3. живой клетки покадровой изображений
- Включите Конфокальный микроскоп следуя инструкциям производителя и убедитесь, что климатической камере достигает 37 ° C и поставляется с 5% CO2.
Примечание: Наш микроскоп и камеры обычно требуют 1 h достичь равновесия системы. - Тщательно передачи палата слайд слайд-адаптер, прилагается к Микроскоп.
- Найдите сфероидов интерес с использованием малой мощности цели (например, 5 X) и начать изображений с тем более высокой мощности (в текущем протоколе, 20 X цель используется для большинства изображений живой клетки для лучшего качества изображения).
Примечание: Для первичной пузыря опухоли образцов, 5 X и 10 X целей могут быть необходимы для того, чтобы покрыть большую площадь изображений. Для наших покадровой изображений, изображений интервал задан как 30 мин и стек Z используется для изображения всего сфероида. Обычно расстояние между Z-ломтики присваивается 4 μm 20 X цели и общее расстояние оси Z — около 200 µm. изображения могут быть получены с помощью DIC и с флуоресценцией если клеток/тканей гавани флуоресцентный белок маркеров. - Выполните покадровый изображений для 24-72 ч.
Примечание: Продолжительность определяется тип ячейки и потребности эксперимента.
4. Подготовка образца блока, содержащего сфероидов рака для разрезания замороженные ткани
- Аккуратно поднимите блок гель коллагена и сфероидов от камеры слайды с помощью небольших щипцами. Поместите блок гель коллагена в пластиковых гистология плесень.
- Промойте гель коллагена с ПБС кратко и затем исправить ее с параформальдегида 4% (PFA) в PBS на 30 минут при комнатной температуре.
Предупреждение: PFA является потенциальным канцерогеном и должны быть обработаны с осторожностью. - Промойте гель коллагена с 1,5 мл 1 x PBS на шейкер на 15 мин заменить PBS и повторите предыдущий шаг, Стиральная 3 x.
- Нанесите тонкий слой (около 3 мм) оптимального раскроя температуры (OCT) соединение для покрытия нижней части новой формы пластиковые гистологии. Место фиксированной и промывают гель коллагена на вершине OCT соединение, затем тщательно внедрить весь гель, заполнив форму с октября составные избегая формирование любых воздушных пузырьков в центре развертывания Office.
- Оставьте плесень на 4 ° C на 1 час.
- Место плесень, содержащий образец и октября соединения на чашку Петри 100 мм, плавающей на жидком азоте. Разрешить для флэш заморозить полностью образца.
- Храните замороженные образец блока на-80 ° C для использования в будущем.
5. иммунофлюоресценции изображений для замороженных секционного рака сфероидов
- Замороженные образец блок передачи из морозильной камеры-80 ° C-20 ° C палаты криостата.
-
Выполнение обычных замороженных секционирование, установив интервал раздел 7 мкм. Пусть секционного образцы придают стекла слайд без морщин или ловушку воздуха.
- Храните слайды при температуре-80 ° C до выполнения дальнейшего окрашивания.
Примечание: Различные интервалы времени могут использоваться для экспериментальной потребностям.
- Храните слайды при температуре-80 ° C до выполнения дальнейшего окрашивания.
- Воздух сухой слайды для 1 ч при комнатной температуре.
- Разрушения образцов с PBS, содержащих 0,5% Тритон X-100 за 15 мин.
- Мыть образцов 3 x 10 мин в мыть с PBS.
- Окружить образцы на слайде с гидрофобным барьеров с помощью пера гидрофобный барьер.
- Лечить образцов раствором блокировки (ПБС содержащие 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА)), за 1 ч при комнатной температуре.
- Применить 40 мкл раствора первичного антитела содержащих (1 x PBS, содержащих 5% BSA с разбавления 1: 100 первичных антител) для каждого образца на слайде.
- Инкубируйте слайды в первичных антител при 37 ° C за 1 ч или при комнатной температуре на ночь (время инкубации и условий зависит от основного антитела).
- Мыть образцов 3 x 15 мин (в мыть) с PBS.
- Применить 40 мкл раствора вторичных антител содержащих (1 x PBS, содержащих 5% BSA с вторичное антитело разбавления 1: 300) для каждого образца на слайде.
- Мыть образцов 3 x 15 мин (в мыть) с PBS.
- Пятно образцы с Hoechst 33342 раствором (1 мкг/мл, разбавленных в PBS) при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем промойте образцы с PBS на 5 мин.
- Маунт образцы с монтажа средних и покрыть их с соответствующего размера обложки скользит. Оставьте слайды в темноте при комнатной температуре на 24 часа и затем выполнить confocal микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное создание инвазивных мочевого пузыря рак опухоли сфероида требует формирования соответствующего размера опухоли сфероидов от клеточных линий или первичной опухоли. Рисунок 2 A показывает размера сфероидов превратилось от четыре человека мочевого пузыря рак клеточных линий (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J и UM-UC18). Рисунок 2 B показывает опухоль сфероида от опухоли мочевого пузыря генерируемые BBN мыши, встроенные в коллагеновой матрицы. Эти сфероидов были внедрены как описано выше, и представитель изображения были захвачены с помощью микроскопа для живых клеток. 20 X объектив был использован для визуализации UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14 и сфероидов UM-UC18, в то время как мыши сфероидов опухоли мочевого пузыря были рассмотрены с использованием 5 X и 10 X объективов.
Представитель изображения сфероидов линии клеток человека мочевого пузыря после 24-72 ч (рисA) и мышь BBN мочевого пузыря первичной опухоли сфероидов (рис. 2B) продемонстрировать миграции рака мочевого пузыря в коллагеновой матрицы. 253J, неинвазивная клеток линии, остаются во многом нетронутыми с небольшое или никакое миграции (рисA). Видео 1, 2и 3 показывают процесс промежуток времени вторжения UM-UC9, UM-UC13 и сфероидов UM-UC14, соответственно. 4 видео показывает свойства вторжения сфероиде UM-UC18. 5 видео показывает две области мыши опухоли мочевого пузыря от 66 h до 87 h после коллагена встраивания.
Чтобы продемонстрировать целесообразность использования иммунофлюоресценции пятнать протеина маркеров в нашей сфероидов инвазивные опухоли, они фиксировали и витражи на 24-72 ч. рис. 3 показывает репрезентативных выборок витражи для группы атаксия-телеангиэктазии D-связанные белком (ATDC, также известный как TRIM29), белок, который играет значительную роль в прогрессировании опухолей и рака человека пузыря и поджелудочной железы9,10, tubulins (α и β), которые образуют микротрубочек и играть ключевую роль в формировании клеток и клеточного движения11,12, кератин 14 (KRT14), базальный эпителиальных маркер, участвующих в вторжения13и виментин (VIM), мезенхимальные маркер14,15, 16. Эти изображения показывают, что визуализация клеточном и субклеточном структур может быть выполнена с использованием этой методологии. Более высокие увеличения UM-UC14 показывает нитчатые пятная для ATDC (рисA). Очень инвазивных клетки распространяются от сфероидов UM-UC18 после того, как 24 h вторжения Экспресс высокий уровень VIM, маркер эпителия в мезенхимальных перехода (EMT, Рисунок 3B).
Включение различных типов клеток (рак связанные фибробластов) в опухоль сфероидов осуществимым и предоставляет способ для изучения взаимодействия гетерологичных клеток (рис. 4 и 6 видео). В этом примере, мы использовали красное флуоресцирование белками (RFP)-помечены фибробластов и 253J рака мочевого пузыря клеток линии преобразованы с вектором для выражения зеленого флуоресцентного белка (ГПУП). Эти клетки были смешанные формы опухоли сфероидов и встроенных в коллагена. Процесс вторжения, мониторинг, конфокальная микроскопия. Рисунок 4 показывает, что взаимодействие с фибробластов может модулировать 253J в инвазивных поведение.
Рисунок 5 показывает полезность анализа системы для тестирования ингибиторы вторжения. Cytochalasin D является известным ингибитором миграции клеток и вторжения, который действует путем преграждать актина полимеризации17,18 и был использован в качестве примера. Cytochalasin D лечения препятствует вторжение сфероидов UM-UC9 (рис. 5A). Такой же концентрации cytochalasin D (0,2 мкм) возможность частично остановить вторжение сфероидов UM-UC18 (рис. 5B). Так как система может использоваться для изображения нескольких скважин и опухоли organoids параллельно, он поддается скрининг ограниченное группа фармакологических агентов для воздействия на вторжение.
Рисунок 1 : Установки для assay 3-D вторжения с живой клеток. (A) Схематический обзор для 3-D живых клеток и иммунофлюоресценции. (B) Coverslip камеры с коллагеном и СМИ, используемые в этом эксперименте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Мочевого пузыря рак сфероида вторжение. (A) примеры человеческого мочевого пузыря рак клеток линии сфероидов внедренные в матрицу, гель коллагена. Сфероидов показываются в то время встраивания (0 h, верхний ряд) или после 72 ч (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J) или 24 ч (UM-UC18). Шкалы бар = 50 µm. (B) примеры BBN-индуцированной мыши мочевого пузыря прорастание опухоли в коллагеновой матрицы. Стрелки указывают на краю инвазивные опухоли сфероида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Анализ иммунофлюоресценции инвазивных мочевого пузыря рак сфероидов. (A) UM-UC14 опухоли сфероида после 72 ч вторжения в коллагена. Образцы были запятнана обычных иммунофлюоресценции пробирного ATDC (зеленый), тубулин (фиолетовый) и ядра (Hoechst пятно синего). Белый квадрат обозначает область с выше увеличение, показанная в нижней строке сразу две панели. Шкалы бар = 50 µm. (B) UM-UC18 опухоли сфероидов витражи для KRT14 (зеленый), VIM (красный), ATDC (фиолетовый) и ядра (Hoechst пятно синего) после 24 ч вторжения в коллагена. Шкалы бар = 50 µm. белый квадратный обозначает область с выше увеличение, показанная в нижней правой панели. Пунктирная линия примерно указывает границы оригинальные сфероида опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Дневно меченых опухоли сфероида, включающих фибробластов. Вторжение GFP-меченых 253J мочевого пузыря рак клеток только (нижней панели) или совместно культивируемых с ЗП меченых фибробластов (верхней панели) наблюдение за 24 ч. Шкала бар = 50 µm. вторжения усиливается с добавлением фибробластов в системе культуры (верхняя группа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Эффект препарата небольшой молекулярной ориентации актина полимеризации вторжения в. (A) UM-UC9 опухоли сфероида относились с cytochalasin D (0,2 мкм) или ДМСО (управления транспортного средства) и наблюдение за 72 ч. (B) UM-UC18 опухоли сфероида лечение с cytochalasin D или ДМСО 24 h. шкалы бар = 50 µm. пунктирная линия указывает границы оригинала «««сфероиде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Возможные проблемы | Рекомендуемое решение |
| Низкое количество жизнеспособных сфероидов | • Увеличение числа клеток, культивируемых в подвеска • Обеспечить > 90% клеток являются жизнеспособными после typsinization • Проверьте ячейки для загрязнения • Поддерживать клетки в логарифмического роста до typsinizing • Оптимизировать медиа культуры клеток • Изменить время культуры в состоянии подвеска • Попробуйте альтернативные клеточных линий |
| Сфероидов слишком большой или слишком маленький | • Отрегулировать количество ячеек добавляется низкой крепежной пластиной • Использование нежный закупорить сломать больше клеток агрегатов |
| Трудно сосредоточиться во время воображая | • Отрегулировать толщину гель коллагена. Для целей с короткой рабочее расстояние попробуйте сделать тоньше гель коллагена. • Обеспечить камеры слайд или coverslip #1.5 • Оптимизировать размер сфероидов (50 – 150 мкм в диаметре) |
| Клетки мигрируют из изображений зоны во время вторжения пробирного | • Уменьшить размер сфероидов • Повторно центр визуализации зоны каждые 24 ч, при необходимости • Привлечение черепица imaging технологии (если применимо), чтобы покрыть большую площадь • Рассмотреть вопрос об использовании альтернативных клеточных линий |
| Слайд камеры высыхает | • Убедитесь, что не происходит утечки в камере установки Климат • Убедитесь, что функциональный механизм контроля влаги |
Таблица 1: Устранение неполадок модели 3-D вторжения.
Видео 1: покадровой видео показаны сфероида UM-UC9 культивировали в коллагена от 0 до 72 ч. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 2: покадровой видео показаны коллективной миграции сфероида UM-UC13 культивировали в коллагена от 0 до 72 ч. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 3: промежуток времени видео сфероида UM-UC14 культивировали в коллагена от 0 до 72 ч. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 4: промежуток времени видео сфероида UM-UC18 культивировали в коллагена от 0 до 24 ч. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 5: покадровой видео опухолей мочевого пузыря BBN-индуцированной мыши 66–84 h после коллагена встраивание. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 6: покадровой видео, показывая рак сфероидов образуются из GFP-меченых 253J клетки смешивают с ЗП меченых фибробластов (слева) или GFP-меченых 253J клетки только (справа). Сфероидов были внедрены в коллагена и наблюдение за 24 ч. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем 3-D опухоли сфероида модель, которая позволяет в реальном времени наблюдения вторжения рака мочевого пузыря, которая имеет решающее значение для прогрессии рака и метастаз. Эта система поддается включение различных стромы и клеточных компонентов разрешить следователям лучше напомнить микроокружения ткани где происходит вторжение рака мочевого пузыря. Сфероидов рака мочевого пузыря могут быть получены из различных источников, таких как клеточные линии (включая генетически измененные клеточные линии полезны для изучения сигнальные пути, которые влияют на процессы вторжения) и мышь первичной опухоли (описано здесь). Это потенциально может также быть адаптированы для анализа человеческого первичной опухоли. В зависимости от того, используется система электронного фотографирования флуоресценции можно контролировать в режиме реального времени или фиксации и иммунофлюоресценции, пятнать в различные моменты времени. Система может также использоваться для проверки потенциальных ингибиторов вторжения. Это делает систему универсальный и мощный инструмент для оценки биологии рака мочевого пузыря.
Система конфокальной микроскопии с климатической камере, которая обеспечивает контроль температуры, контроль влажности и CO2 поставок является ключевой частью оборудования для построения модели, описанной в настоящем Протоколе.
Широко сообщалось, что 3-D культур предоставляют специализированные микросреды, которые лучше имитировать родной тканей для клеток биологии и рак исследований19,20. Многие исследования полагаются на проницаемой мембраны Вставка анализов, которые не отражают условия, в которых вторжение происходит в естественных условиях. Кроме того эти традиционные исследования позволяют легко мониторинг процесса вторжения в режиме реального времени, ни подробный анализ образцов во время или следующие вторжения. Здесь мы описали систему, которая является полезной для обеих в реальном времени и конечной точки допроса инвазивного рака биологии.
Коллаген является важным компонентом дополнительных клеточных матрицы (ECM) и существует во многих формах. Тип-1 Коллаген является преобладающей формой фибриллярного коллагена, тогда как коллаген типа-4 nonfibrillar коллагена, составляя базальной мембраны21. Раковые клетки должны проникнуть базальной мембраны и переехать через коллаген типа-1 во время прогрессии от неинвазивные инвазивные опухоли22. Тип-1 коллагена, учитывая его повсеместное присутствие в ECM, использовался как матрица для построения 3-D культур, которые имитируют ECM, лучше, чем двумерных культуры блюдо5,6,23. В то время как система, изложенные здесь основанный на тип-1 коллагеновой матрицы, он может быть изменен, чтобы включить другие стромальные составляющих, на основе экспериментальных вопрос и нужно.
Методология, которую мы используем для создания сфероидов рака мочевого пузыря из клеточных линий включает культуры клеток в условиях низкой привязанность и агрегации клеток. Не все клетки могут терпеть этих условиях культуры и некоторые могут проходят apoptosis или формирования сыпучих агрегатов, которые отмежеваться во время коллагена, внедрение процесса. Изменение культуры время, номер сотового или включения другие типы клеток в суспензии может улучшить результат. Линии клетки, отобранных для этого анализа зависят от цели эксперимента. Мы успешно использовал эту технику с 7/7 уникальных людей пузыря рак клеточных линий. Однако вполне возможно, что некоторые линии клетки могут не подходить для этой экспериментальной установки. Кроме того некоторые клеточные линии имеют очень инвазивных фенотип, что приводит к ранней диссоциации сфероидов, и раковые клетки, движущихся из области наблюдения во время промежуток времени эксперимент. Экспериментальный эксперименты для понимания общего поведения клеточных линий настоятельно рекомендуется определить лучшие сроки для исследований. Устранение общих проблем с сфероида поколения и изображений перечислены в таблице 1.
Эта система подходит для ограниченного скрининг фармакологических соединений с потенциалом для блока раковых клеток вторжения. Здесь мы использовали Cytochalasin D, клетки проницаемой ингибитор полимеризации актина, чтобы проиллюстрировать этот потенциал приложения18. Как показано выше, 0,2 мкм cytochalasin D эффективно подавляет вторжения UM-UC9 и UM-UC18 сфероидов. Путем использования нескольких камер слайды и автоматизированных микроскопических стадии контроля, возможен эффект нескольких соединений на сфероиде прорастание опухоли.
Хотя эти анализы лучше всего подходят для качественно описать инвазивных поведение, количественная оценка масштабов миграции и вторжения также возможна. Получение изображений сфероидов в начале эксперимента и в различные моменты времени и последующие изображения анализа для измерения Дальний линейное расстояние вторжения в X, Y или Z направления может предоставить количественная оценка инвазивных мигрирующих поведения. Более продвинутые изображения анализ с использованием дневно помечены клетки могут использоваться для определения и quantitate отдельную ячейку или ячейки типа поведение в зависимости от экспериментальных потребность или вопрос.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить лаборатории д-р Ховард Кроуфорд (Мичиганский университет) для технической поддержки и предоставление материалов и оборудования для этого исследования и Алан Kelleher для технической поддержки.
Эта работа финансировалась грантов из университета Мичигана с Рак центр Core Грант CA046592-26S3, низ K08 CA201335-01A1 (ПЛП), BCAN YIA (ПЛП), низ R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M.
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M.
