Summary
De processer som styr urinblåsan cancer invasion representerar möjligheter för biomarkör och terapeutisk utveckling. Här presenterar vi en urinblåsan cancer invasion modell som innehåller 3D-kultur av tumör spheroids, time-lapse imaging och konfokalmikroskopi. Den här tekniken är användbar för att definiera funktioner i invasiv processen och för screening terapeutiska medel.
Abstract
Urinblåsecancer är ett betydande hälsoproblem. Det beräknas att mer än 16 000 personer kommer att dö i år i USA från cancer i urinblåsan. Medan 75% av urinblåsan cancer är icke-invasiv och osannolikt att metastasera, utvecklas ca 25% till en invasiv tillväxtmönster. Upp till hälften av patienterna med invasiva cancer kommer att utveckla dödliga metastaserande återfall. Thus, förstå mekanismen av invasiva progression i cancer i urinblåsan är avgörande att förutsäga behandlingsresultat och förebygga dödliga metastaser. I denna artikel presenterar vi en tredimensionell cancer invasion modell som tillåter införlivande av tumörceller och stromal komponenter att efterlikna i vivo villkor som förekommer i den blåsan tumör mikromiljö. Denna modell ger möjlighet att iaktta den invasiva processen i realtid med time-lapse imaging, förhöra de molekylära vägarna som är involverade med confocal Immunofluorescerande imaging och skärmen föreningar med potential att blockera invasion. Medan detta protokoll fokuserar på cancer i urinblåsan, är det troligt att liknande metoder kan användas för att undersöka invasionen och motilitet i andra tumörtyper samt.
Introduction
Invasionen är ett kritiskt steg i cancer progression, som krävs för metastas, och förknippas med lägre överlevnad och dålig prognos hos patienter. I mänskliga blåscancer, den vanligaste malignitet i urinvägarna som orsakar ca 165 000 dödsfall per år i hela världen, är cancer Stadium, behandling och prognos direkt relaterade till närvaro eller frånvaro av invasion1. Omkring 75% av fallen av cancer i urinblåsan är icke-muskel invasiva och är hanteras med lokal resektion. Däremot muskel-invasiv urinblåsan cancer (ca 25% av alla fall) är aggressiva tumörer med hög metastaserande och behandlas med aggressiv multimodalitet terapi2,3. Förstå de molekylära vägar som utlöser invasion är därför viktigt att bättre karakterisera risken för invasiv progression och att utveckla terapeutiska interventioner som kan förhindra invasiv progression.
Invasiv tumör progression uppstår i en komplex tredimensionell (3-D) miljö och innebär tumör cell interaktion med andra tumörceller, stroma, basalmembranet och andra typer av celler inklusive immunceller, fibroblaster, muskelceller och vaskulär endotelceller. Genomsläppliga stöd (t.ex., Transwell) analys system är vanligen anställda att kvantifiera cancer cell invasion4, men dessa system är begränsade, eftersom de inte tillåter mikroskopiska övervakning av invasion processen i realtid och hämtning av prover för ytterligare färgning och molekylär analys är utmanande. Utveckling av en 3D-urinblåsan tumör sfäroid system att studera invasion är önskvärt eftersom det möjliggör införlivandet av definierade microenvironmental komponenter med bekvämligheten av in vitro- system.
I detta protokoll, beskriver vi ett system för att förhöra de invasiva processerna human bladder cancer celler med en 3D-sfäroid invasion analys införliva kollagenbaserade gel matriser och konfokalmikroskopi att utredarna att övervaka cell motilitet och invasion i realtid (figur 1A). Detta system är mångsidig och kan modifieras för att förhöra olika tarmcancer/inställningar. Det kan införliva de flesta urinblåsan cancer cellinjer eller primära urinblåsan tumörer och ytterligare stromaceller som cancer associerade fibroblaster och immunceller5,6,7. Detta protokoll beskriver en matris består av kollagen typ 1, men kan ändras för att införliva andra molekyler som Fibronektin, laminin och kollagen proteiner. Invasiva processer kan följas för 72 h eller längre beroende på förmågan av Mikroskop och system som används. Fixering och immunofluorescens färgning av tumören inbäddad i den 3D-matrisen före, under och efter invasionen tillåter förhör av proteiner uppreglerad i invasiv celler, vilket ger viktig information som vanligtvis frånvarande eller svårt att samla använda andra 3D-kultur-modeller. Detta system kan också utnyttjas på skärmen föreningar som blockera invasion, och att avgränsa signalvägar som påverkas av sådana föreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. växande Cancer Spheroids
-
Växer från cellinjer
- Kultur mänskliga urinblåsan cancerceller under konventionella anhängare cell odlingsbetingelser och underhåll i en 37 ° C inkubator levereras med 5% CO2. Upprätthålla celler på < 90% konfluens.
Obs: odlingssubstrat som används är Dulbeccos minsta nödvändiga media (DMEM) som innehåller 4,5 g/L D-glukos, L-glutamin, 110 mg/L natrium pyruvat, och levereras med 10% fetalt bovint serum (FBS) i hela detta protokoll. - En dag före början av experimentet, trypsinize (med hjälp av 0,25% Trypsin-EDTA) celler, kvantifiera cellkoncentrationen och distribuera 1 x 106 celler i 3 mL kultur media i varje brunn 6-väl ultralåg fastsättning platta.
- Inkubera cellerna i låg bifogade villkor vid 37 ° C för ≥16 h. Detta bör ge tillräcklig tid för celler till samlade in spheroids för de flesta urinblåsan cancer cellinjer.
Obs: Bildandet av spheroids kan observeras av inverterad ljusa fält Mikroskop. Den optimala storleken och antalet spheroids kan bero på individuella experiment, men vi tycker att spheroids med diametrar från 50 µm till 150 µm är generellt sett lämpligt för time-lapse bildåtergivning med en 20 X-objektiv. - För att införliva ytterligare celltyper, såsom fibroblaster eller immunceller i spheroids, blanda önskad cellerna med cancerceller vid önskad förhållande (1:1, 1:10, osv.) i bifogad ultralåg tallrik och inkubera vid 37 ° C för ≥16 h att tillåta bildandet av Blandad cell typ spheroids.
- Kultur mänskliga urinblåsan cancerceller under konventionella anhängare cell odlingsbetingelser och underhåll i en 37 ° C inkubator levereras med 5% CO2. Upprätthålla celler på < 90% konfluens.
-
Växer från primära tumörer
Obs: Tumör spheroids kan också härledas från primära urinblåsan tumör källor såsom tumörer utvecklas från cancerframkallande-inducerad urinblåsan tumör modeller8. Till exempel urinblåsan tumörer genereras från möss matas med N-butyl - N-(4-hydroxybutyl) nitrosamin (BBN), kan skördas och hackad i små bitar (ca 0,5 mm3) med sterila kirurgiska instrument. Rötas delprov av human bladder cancer kan också studeras i detta system.- Samla och tvätta 0,5 mm3 tumör bitar i 5 mL iskallt fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Centrifugering vid 200 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Upprepa detta tvätt en gång.
- Samla tumör bitar genom centrifugering vid 200 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och tillsätt 5 mL DMEM innehållande 10% FBS. Överföra tumör sfäroid/media blandning till en 6-väl ultralåg bifogade tallrik. Inkubera vid 37 ° C för ≥16 h innan inbäddning i kollagen matris (se steg 2.3).
2. förbereda 3D-kultur kammaren
-
Späd typ 1 kollagen (härlett från rat tail) i DMEM innehållande 10% FBS att göra en 2 mg/mL blandning enligt tillverkarens anvisningar.
- Kort sagt, blanda kollagen med lämplig mängd 1 N NaOH-lösning och DMEM av mild pipettering utifrån tillverkarens anvisningar att uppnå Fysiologiskt pH.
- Efter blandning kollagen och DMEM snabbt coat brunnarna av kammaren bilden (för de flesta tillämpningar, avdelningen bilder med ett antal 1,5-skyddsglaset är optimal) med kollagen-DMEM blandningen innan stelning (200 µL per brunn). Tillåta belagda kammare bilden vara stillastående i rumstemperatur i 15 min.
Obs: Sammansättningen av kollagenbaserade matris kan modifieras genom att lägga till andra extracellulära matrix ingredienser, såsom Fibronektin eller laminin, enligt tillämpning av experiment.
- Försiktigt Pipettera 500 µL av media som innehåller spheroids (eller tumör bitar, om primärtumör prov används) från 6-väl ultralåg fastsättning plattan i en tom 1,5 mL mikrocentrifug rör. Vänta 2 min att låta spheroids bosätta sig till botten av röret.
- Ta försiktigt bort supernatanten från röret. Förbereda en annan tub typ 1 kollagen (2 mg/mL) blandas med DMEM innehållande 10% FBS och snabbt lägga till 500 µL av denna blandning till spheroids. Blanda försiktigt spheroids och kollagen av långsam pipettering.
- Tillsätt 250 µL spheroids/kollagen blandning i en brunn av kollagen-pre-coated kammare bild. Tillåta kollagen matris som innehåller spheroids att stelna helt (ca 30 min vid 37 ° C).
- Efter kollagenmatrisen är stelnat, tillsätt 1 mL DMEM innehållande 10% FBS till varje brunn (figur 1B). Inkubera i kammaren bilden i en 37 ° C inkubator levereras med 5% CO2 tills den för avbildning.
3. levande Cell Time-lapse Imaging
- Slå på mikroskopet confocal efter tillverkarens instruktioner och säkerställa att klimatkammare når 37 ° C och är försedd med 5% CO2.
Obs: Våra Mikroskop och kammare kräver vanligtvis 1 h att nå systemet jämvikt. - Noggrant överföra kammare bilden till bild adaptern kopplade till mikroskopet.
- Leta upp spheroids av intresse med hjälp av ett lågenergi-mål (t.ex., 5 X) och starta imaging med högre makt målet (i nuvarande protokoll, 20 X-objektiv används för de flesta av den levande cellen tänkbar för dess bättre bildkvalitet).
Obs: För primära urinblåsan tumörprover, 5 X och 10 X mål kan behövas för att täcka större imaging område. För våra time-lapse imaging, avbildning intervallet anges som 30 min och en Z-stacken används till bild i hela sfäroid. Oftast är avståndet mellan Z-skivor satt till 4 µm för 20 X mål, och det totala avståndet i Z-axeln är ca 200 µm. bilder kan erhållas med hjälp av DIC och med fluorescens om cellerna eller vävnaderna harbor fluorescerande protein markörer. - Utföra time-lapse imaging för 24-72 h.
Obs: Längd bestäms av celltypen och behov av experimentet.
4. beredning av provet Block som innehåller Cancer Spheroids för fryst vävnad snittning
- Lyft försiktigt blocket av kollagen gel och spheroids från avdelningen bilder med liten pincett. Placera blocket kollagen gel i en plast histologi mögel.
- Skölj kollagen gelen med 1 x PBS kort och sedan åtgärda det med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS för 30 min i rumstemperatur.
FÖRSIKTIGHET: PFA är potentiellt cancerframkallande och bör hanteras med försiktighet. - Tvätta kollagen gelen med 1,5 mL 1 x PBS på en shaker för 15 min. Ersätt PBS och upprepa föregående tvätt steg 3 x.
- Applicera ett tunt lager (ca 3 mm) för optimal skärtemperatur (ULT) förening för att täcka botten av en ny plast histologi mögel. Placera den fasta och sedan noggrant tvättas kollagen gel ovanpå ULT förening, bädda hela gelen genom att fylla formen med OCT förening samtidigt undvika bildandet av eventuella luftbubblor i ULT.
- Lämna mögel vid 4 ° C för 1 h.
- Placera formen som innehåller provet och OCT förening på en 100 mm petriskål flyter på flytande kväve. Låt provet till flash-frysa helt.
- Förvaras fryst prov blocket vid-80 ° C för framtida bruk.
5. immunofluorescens Imaging för frysta sektionerad Cancer Spheroids
- Överföra blocket frusna provet från frysen-80 ° C till-20 ° C kammaren av en kryostat.
-
Utföra konventionell frysta snitt-ställa in intervall för avsnitt 7 µm. Låt sektionerad prover bifoga till glas bild utan rynkor eller instängd luft.
- Lagra bilder vid-80 ° C innan du utför ytterligare färgning.
Obs: Olika intervaller kan användas för experimentella behov.
- Lagra bilder vid-80 ° C innan du utför ytterligare färgning.
- Luften torr bilderna för 1 h i rumstemperatur.
- Permeabilize proverna med PBS med 0,5% Triton x-100 i 15 min.
- Tvätta prover 3 x med PBS för 10 min per tvätt.
- Omringa proverna i bilden med hydrofoba hinder med hjälp av en hydrofoba barriär penna.
- Behandla proverna med blockerande lösning (1 x PBS som innehåller 5% bovint serumalbumin (BSA)), för 1 h i rumstemperatur.
- Gäller 40 µL primär antikropp-innehållande lösning (1 x PBS som innehåller 5% BSA med 1: 100 utspädning av primär antikropp) för varje prov på bilden.
- Inkubera bilder i primär antikropp vid 37 ° C i 1 h eller i rumstemperatur över natten (den inkubationstiden varierar beroende på primär antikropp).
- Tvätta prover 3 x med PBS för 15 min (per tvätt).
- Gäller 40 µL sekundär antikropp-innehållande lösning (1 x PBS som innehåller 5% BSA med 1:300 sekundär antikropp utspädning) för varje prov på bilden.
- Tvätta prover 3 x med PBS för 15 min (per tvätt).
- Färga av prov med Hoechst 33342 lösning (1 µg/mL, utspädd i PBS) i rumstemperatur i 10 min. Tvätta sedan prover med PBS för 5 min.
- Montera av prov med monteringsmedium och täck dem med lämplig storlek täckglas. Lämna bilder i mörker vid rumstemperatur i 24 h och sedan utföra konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skapande av invasiva urinblåsan cancer tumör sfäroid kräver bildandet av lämplig storlek tumör spheroids från cellinjer eller primära tumörer. Figur 2 A visar lämplig storlek spheroids utvecklats från fyra mänskliga urinblåsan cancer cellinjer (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J och UM-UC18). Figur 2 B visar en tumör sfäroid från en BBN-genererade mus urinblåsan tumör inbäddad i kollagen matris. Dessa spheroids bäddades som beskrivs ovan och representativa bilder var tagna med Mikroskop utrustat för levande cell imaging. De 20 X objektivet användes för imaging UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14 och UM-UC18 spheroids, medan mus urinblåsan tumör spheroids undersöktes med hjälp av 5 X och 10 X objektiv.
Representativa bilder av human bladder cellen fodrar spheroids efter 24-72 h (figur 2A) och mus BBN primära urinblåsan tumör spheroids (figur 2B) visar urinblåsan cancer migration in i kollagenmatrisen. 253J, en icke-invasiv cellinje, förblir i stort sett intakt med liten eller ingen migration (figur 2A). Videor 1, 2och 3 visar time-lapse invasion processen för UM-UC9, UM-UC13 och UM-UC14 spheroids, respektive. Video 4 visar invasion egenskaperna för en UM-UC18 sfäroid. Video 5 visar två områden av mus urinblåsan tumör från 66 h till 87 h efter kollagen inbäddning.
För att demonstrera möjligheten att använda immunofluorescens färgning av protein markörer i vår invasiv tumör spheroids, var de fixeras och färgas på 24 eller 72 h. figur 3 visar representativa prover färgas för ataxi-telangiektasi grupp D-associerade Protein (ATDC, även känd som TRIM29), ett protein som spelar en betydande roll i tumourigenesis och cancer progression av mänskliga urinblåsan och pankreas cancer9,10, tubulins (α och β), som bildar mikrotubuli och spela en viktig roll i att forma i cellen och cellulära rörelse11,12, keratin 14 (KRT14), en basal epitelial markör som är involverade i invasionen13och vimentin (VIM), en mesenkymala markör14,15, 16. Dessa bilder visar att visualisering av cellulär och subcellulär strukturer kan utföras med hjälp av denna metod. Den högre förstoring UM-UC14 visar fintrådiga färgning för ATDC (figur 3A). Mycket invasiva cellerna sprids från UM-UC18 spheroids efter 24 h invasion uttrycka hög grad av VIM, en markör för epitelial-till-mesenkymala övergången (EMT, figur 3B).
Införlivandet av olika celltyper (cancer-associerade fibroblaster) i de tumör spheroids är genomförbart och tillhandahåller ett sätt att undersöka heterologa cell-cell interaktioner (figur 4 och Video 6). I det här exemplet som vi använde röd fluorescens protein (RFP)-märkt mänskliga fibroblaster och 253J urinblåsecancer cellinje sensorik med en vektor uttryck av grönt fluorescerande protein (GFP). Dessa celler var blandad till formuläret tumör spheroids och inbäddade i kollagen. Invasion processen övervakas av konfokalmikroskopi. Figur 4 visar att interaktion med fibroblaster kan modulera 253J's invasiva beteende.
Figur 5 visar nyttan av assay systemet att testa hämmare av invasionen. Cytochalasin D är en känd hämmare av cellmigration och invasion som verkar genom att blockera aktin polymerisation17,18 och användes som ett exempel. Cytochalasin D behandling hämmade invasionen av UM-UC9 spheroids (figur 5A). Samma koncentration av cytochalasin D (0,2 µM) är kunna delvis hindra invasionen av UM-UC18 spheroids (figur 5B). Eftersom systemet kan användas till bild flera brunnar och tumör organoids parallellt, är det mottagliga för screening en begränsad panel av farmakologiska agenter för effekt på invasionen.
Figur 1 : Inställningar för 3D-invasion assay med levande cell imaging. (A) Schematisk översikt för 3D-levande cell avbildning och immunofluorescens. (B) täckglas kammare med kollagen och media som används i detta experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Urinblåsan cancer sfäroid invasion. (A) exempel på mänskliga urinblåsan cancer cell linje spheroids inbäddade i en kollagenmatrisen gel. Spheroids visas vid tidpunkten för att bädda in (0 h, översta raden) eller efter 72 h (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J) eller 24 h (UM-UC18). Skalstapeln = 50 µm. (B) exempel av BBN-inducerad mus urinblåsan tumör invasion in i kollagenmatrisen. Pilarna anger invasiva kanten av tumör sfäroid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Immunofluorescens analys av invasiva urinblåsan cancer spheroids. (A) UM-UC14 tumör sfäroid efter 72 h invasion i kollagen. Proverna var målat med konventionella immunofluorescens analysmetod för ATDC (grön), tubulin (violett) och atomkärnor (Hoechst fläcken blå). Vit kvadrat anger området med högre förstoring Visa visas i nedersta raden höger två paneler. Skalstapeln = 50 µm. (B) UM-UC18 tumör spheroids färgas för KRT14 (grön), VIM (röd), ATDC (violett) och atomkärnor (Hoechst fläcken blå) efter 24 h invasion i kollagen. Skalstapeln = 50 µm. vit kvadrat anger området med högre förstoring vyn som visas i nedre högra panelen. Streckad linje anger ungefär gränsen för den ursprungliga tumören sfäroid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Fluorescently-märkt tumör sfäroid införliva fibroblaster. Invasionen av GFP-märkta 253J urinblåsan cancerceller ensam (bottenpaneler) eller samtidig odlade med RFP-märkt fibroblaster (översta paneler) övervakas för 24 h. skala bar = 50 µm. Invasion har förbättrats med tillägg av fibroblaster till kultur systemet (övre panelen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Effekten av en små molekylära drog inriktning aktin polymerisation i invasion. (A) UM-UC9 tumör sfäroid behandlas med cytochalasin D (0,2 µM) eller DMSO (kontroll av fordon) och övervakas för 72 h. b UM-UC18 tumör sfäroid behandlas med cytochalasin D eller DMSO för 24 h. skala bar = 50 µm. streckad linje anger gränsen för ursprungligen sfäroid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Möjliga problem | Rekommenderad lösning |
| Låga antalet livskraftiga spheroids | • Öka antalet celler odlade i suspension • Säkerställa att > 90% celler är livskraftiga efter typsinization • Kontrollera celler för kontaminering • Upprätthålla celler i logaritmisk tillväxt före typsinizing • Optimera cell kulturmassmedia • Ändra kultur tiden i suspension skick • Prova alternativa cellinjer |
| Spheroids är för stor eller för liten | • Justera antalet celler till låga attachment plate • Använd mild pipettering för att bryta ner större cell aggregat |
| Svårt att fokusera under inbillar | • Justera tjockleken av kollagen gel. För mål med korta arbetsavstånd, försök att göra kollagen gel tunnare. • Se till att kammaren bild eller täckglas är #1.5 • Optimera storleken på spheroids (50 – 150 µm i diameter) |
| Cellerna migrerar ut ur zonen imaging under invasionen assay | • Minska storleken på spheroids • Centrera igen zonen imaging varje 24 h vid behov • Engagera plattsättning bildteknik (om tillämpligt) för att täcka större yta • Överväga användningen av alternativa cellinjer |
| I kammaren bilden torkar ut | • Se till att det finns inget läckage i klimat kammare setup • Kontrollera fukt kontrollmekanismen är funktionella |
Tabell 1: Felsökning 3D-invasion modellen.
Video 1: Time-lapse video visar UM-UC9 sfäroid odlade i kollagen från 0 till 72 h. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2: Time-lapse video som visar kollektiva migreringen av UM-UC13 sfäroid odlade i kollagen från 0 till 72 h. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 3: Time-lapse video av UM-UC14 sfäroid odlade i kollagen från 0 till 72 h. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 4: Time-lapse video av UM-UC18 sfäroid odlade i kollagen från 0 till 24 h. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 5: Time-lapse video av BBN-inducerad mus urinblåsan tumörer 66–84 h efter kollagen inbäddning. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 6: Time-lapse video som visar cancer spheroids bildas från GFP-märkta 253J cellerna blandas med RFP-märkt mänskliga fibroblaster (vänster) eller GFP-märkta 253J celler ensam (höger). Spheroids bäddades i kollagen och övervakas för 24 h. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en 3D-tumör sfäroid modell som tillåter realtid observation av urinblåsan cancer invasion som är kritiska för cancer progression och metastasering. Detta system är mottagliga för införlivandet av olika stromaceller och cellulära komponenter så att utredarna att bättre sammanfatta den vävnad mikromiljö där urinblåsan cancer invasion sker. Urinblåsan cancer spheroids kan genereras från olika källor såsom cellinjer (inklusive genetiskt modifierade cellinjer som är användbar för undersökning av signalering vägar som påverkar invasion processer), och musen primära tumörer (beskrivs här). Det kan eventuellt också anpassas för mänskliga primärtumör analys. Beroende på imaging system används, kan fluorescens övervakas i realtid eller genom fixering och immunofluorescens färgning vid olika tidpunkter. Systemet kan också användas för att testa potentiell hämmare av invasionen. Detta gör systemet en mångsidig och kraftfullt verktyg för att bedöma urinblåsan cancerbiologi.
Konfokalmikroskopi systemet med en klimatkammare som ger temperaturkontroll, fuktkontroll och CO2 leverans är en viktig del av utrustningen för att konstruera den modell som beskrivs i detta protokoll.
Det har rapporterats vida att 3D-kulturer ger specialiserad mikromiljö vilket bättre efterlikna infödda vävnader för cell biologi och cancer studier19,20. Många studier är beroende av högpermeabla membran infoga analyser som inte avspeglar under förhållanden som invasion inträffar i vivo. Dessutom tillåter dessa konventionella studier enkel övervakning av invasion processen i en realtid mode varken detaljerad analys av prover under eller följande invasionen. Häri vi beskrev ett system som är användbar för både realtid och endpoint förhör av invasiv cancerbiologi.
Kollagen är en viktig komponent i den extracellulära matrisen (ECM), och finns i många former. Kollagen typ 1 är den dominerande formen av fibrillar kollagen typ 4 kollagen är en nonfibrillar kollagen som gör upp de basalmembran21. Cancerceller måste tränga igenom basalmembranet och flytta genom typ 1 kollagen under utvecklingen från icke-invasiva invasiva tumörer22. Tanke på dess allestädes närvaro i ECM, har typ 1 kollagen använts som matris för att bygga 3D-kulturer, som efterliknar ECM bättre än den tvådimensionella kultur maträtt5,6,23. Medan systemet beskrivs här baseras på en typ 1 kollagenmatrisen, det kan ändras för att inkludera andra stromal beståndsdelar baserat på experimentella fråga och behöver.
Den metod som vi använder för att generera urinblåsan cancer spheroids från cellinjer innebär cellkultur i låg-attachment förhållanden och cell aggregering. Inte alla celler kan tolerera dessa odlingsbetingelser och några kan genomgå apoptos eller bildandet av lös aggregat som separerar under kollagen inbäddning process. Ändra kulturtid, kan mobiltelefonnummer eller införliva andra celltyper i suspension förbättra resultatet. De cellinjer som valts för denna analys är beroende av syftet med experimentet. Vi har framgångsrikt använt denna teknik med 7/7 unika mänskliga urinblåsan cancer cellinjer. Det är dock möjligt att vissa cellinjer inte kanske är lämplig för detta experiment. Vissa har dessutom en mycket invasiva fenotyp, vilket leder till tidiga avståndstagande av spheroids och cancerceller flyttar ut ur området observation under time-lapse experimentet. Pilotförsök för att förstå det allmänna beteendet av cellinjer rekommenderas att avgöra de bästa tidsramarna för studier. Felsökning av vanliga problem med sfäroid generation och imaging är listade i tabell 1.
Detta system är lämpligt för begränsad screening av farmakologiska föreningar med potential att blockera cancer cell invasion. Häri används vi Cytochalasin D, en cell-permeable hämmare av aktin polymerisation, för att illustrera denna potentiella ansökan18. Som visas ovan, hämmar 0,2 µM av cytochalasin D effektivt invasionen av UM-UC9 och UM-UC18 spheroids. Genom att utnyttja flera kamrar diabilder och automatiserade mikroskopiska bordstyrningen, är effekten av flera föreningar på tumör sfäroid invasion genomförbart.
Även om dessa analyser är bäst lämpade att kvalitativt beskriva invasiva beteende, är kvantifieringen av omfattningen av migration och invasion också möjlig. Förvärv av bilder av spheroids i början av experiment och vid olika tidpunkter, och efterföljande bildanalys att mäta längst linjära avståndet av invasion i X, Y eller Z riktningar kan ge kvantifiering av invasiva flyttande beteende. Mer avancerade bild analys med fluorescently märkta celler kunde användas för att definiera och kvantifiera enskild cell eller cell typ beteende beroende på den experimentella behov eller fråga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Howard Crawford (University of Michigan) laboratoriet för teknisk support och som tillhandahåller material och utrustning för denna studie, och Alan Kelleher för teknisk support.
Detta arbete finansierades genom bidrag från University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), kan YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M.
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M.
