Summary
De processen die blaas kanker invasie vertegenwoordigen mogelijkheden voor biomerker en therapeutische ontwikkeling. Hier presenteren we een blaas kanker invasie model waarin 3D-cultuur tumor spheroïden, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie. Deze techniek is handig voor het definiëren van de kenmerken van de invasieve proces en voor het screenen van therapeutische agenten.
Abstract
Blaaskanker is een belangrijk gezondheidsprobleem. Er wordt geschat dat meer dan 16.000 mensen dit jaar in de Verenigde Staten van blaaskanker sterven zullen. Terwijl 75% van de kankers van de blaas zijn niet-invasieve en onwaarschijnlijk metastaseren, vooruitgang ongeveer 25% naar een invasieve groeipatroon. Bijna de helft van de patiënten met invasieve kankers Nieuwengels dodelijke metastatische herval. Inzicht in het mechanisme van invasieve progressie in blaaskanker is dus cruciaal voor patiëntenoutcomes voorspellen en voorkomen van dodelijke metastasen. In dit artikel presenteren we een driedimensionale kanker invasie model waarmee opneming van tumorcellen en stromale componenten na te bootsen in vivo omstandigheden die zich voordoen in de blaas tumor communicatie. Dit model biedt de mogelijkheid om te observeren de invasieve proces in real time via time-lapse imaging, ondervragen van de moleculaire pathways betrokken confocal immunefluorescentie beeldvorming en scherm verbindingen met het potentieel de invasie van het blok. Dit protocol is gericht op blaaskanker, is het waarschijnlijk dat soortgelijke methoden kunnen worden gebruikt om de invasie en beweeglijkheid in de tumor andersoortige ook onderzoeken.
Introduction
Invasie is een cruciale stap in de progressie van kanker, die is vereist voor metastase, en wordt geassocieerd met lagere overleven en slechte prognose bij patiënten. In menselijke blaaskanker, de meest voorkomende maligniteit van de urinewegen, waardoor ongeveer 165.000 sterfgevallen per jaar wereldwijd, zijn stadium van de kanker, de behandeling en de prognose direct gerelateerd aan de aanwezigheid of afwezigheid van invasie1. Ongeveer 75% van de gevallen van blaaskanker zijn niet-spier invasieve en worden beheerd met lokale resectie. In tegenstelling, spier-invasieve blaas kanker (ongeveer 25% van alle gevallen) zijn agressieve tumoren met een hoog metastatische en worden behandeld met agressieve multimodaliteit therapie2,3. Inzicht in de moleculaire wegen die leiden invasie tot is daarom essentieel beter karakteriseren het risico van invasieve progressie en het ontwikkelen van therapeutische interventies die invasieve progressie kunnen voorkomen.
Invasieve progressie van de tumor zich voordoet in een complexe driedimensionale (3-D) omgeving en vereist tumor cel interactie met andere tumorcellen, stroma, kelder membraan en andere soorten cellen, met inbegrip van immune cellen, fibroblasten, spiercellen en vasculaire endotheliale cellen. Doorlaatbare steun (b.v.Transwell) assay systemen zijn vaak aangewend om te kwantificeren kanker cel invasie4, maar deze systemen zijn beperkt omdat ze niet toestaan microscopisch kleine controle van het proces van de invasie in real-time en de ophalen van monsters voor verdere kleuring en moleculaire analyse is uitdagend. Ontwikkeling van een 3D-blaas tumor sferoïde systeem te bestuderen van de invasie is wenselijk omdat hierdoor de opname van gedefinieerde microenvironmental componenten met het gemak van in vitro -systemen.
In dit protocol, beschrijven we een systeem om te ondervragen van de invasieve processen van menselijke blaas kankercellen met behulp van een 3D-sferoïde invasie bepaling opnemen op basis van collageen gel matrices en confocale microscopie om onderzoekers te controleren van de beweeglijkheid van de cel en invasie inreal-time (Figuur 1). Dit systeem is veelzijdig en kan worden aangepast voor verschillende stromale tumor/instellingen ondervragen. Het kan de meeste blaas kanker cellijnen of primaire blaas tumoren en extra stromale cellen nemen zoals kanker geassocieerd fibroblasten en immuuncellen5,6,7. Dit protocol beschrijft een matrix bestaat uit collageen type-1, maar kan worden aangepast voor het nemen van andere moleculen zoals fibronectin, laminin of andere collageen-eiwitten. Invasieve processen kunnen worden gevolgd gedurende 72 uur of langer afhankelijk van de capaciteit van het systeem gebruikt en Microscoop. Fixatie en immunofluorescentie kleuring van de tumor die is ingesloten in de 3D-matrix vóór, tijdens en na de invasie kunt de ondervraging van upregulated van de eiwitten in invasieve cellen, waardoor cruciale informatie dat meestal afwezig of moeilijk te verzamelen met behulp van andere 3D-cultuur-modellen. Dit systeem kan ook worden gebruikt op scherm stoffen die het blokkeren van invasie, en af te bakenen signaalroutes beïnvloed door dergelijke verbindingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. groeiende kanker spheroïden
-
Groeien uit cellijnen
- Cultuur menselijke blaas kankercellen onder conventionele aanhanger cel kweekomstandigheden en onderhouden in een incubator van de 37 ° C bij 5% CO2geleverd. Handhaven van cellen op < 90% confluentie.
Opmerking: Kweekmedia gebruikt is Dulbecco van minimale essentiële media (DMEM) met 4,5 g/L D-glucose, L-Glutamine, 110 mg/L natrium pyruvaat, bewerkt en geleverd met 10% foetale runderserum (FBS) in dit protocol. - Een dag vóór de aanvang van het experiment, trypsinize (met behulp van 0,25% trypsine-EDTA) cellen, kwantificeren cel concentratie en distribueren van 1 x 106 cellen in 3 mL voedingsbodems in ieder putje van een 6-well ultra-lage bijlage plaat.
- Incubeer de cellen in lage bijlage omstandigheden bij 37 ° C ≥16 uur. Hierdoor moeten voldoende tijd voor cellen tot totaal in spheroïden voor de meeste blaas kanker cellijnen.
Opmerking: De vorming van spheroïden kan worden waargenomen door omgekeerde helder veld Microscoop. Het optimale aantal en grootte van spheroïden kunnen afhangen van individuele experimenten, maar wij vinden dat spheroïden met een diameter van 50 µm tot 150 µm zijn over het algemeen geschikt voor time-lapse geschikt zijn met behulp van een 20 X-objectief. - Om op te nemen van de extra celtypen, zoals fibroblasten of immuuncellen in de spheroïden, meng de gewenste cellen met kankercellen op de gewenste verhouding (1:1, 1:10, enz.) in een ultra-lage bijlage plaat en Incubeer bij 37 ° C voor ≥16 h dat de vorming van Gemengde cel type spheroïden.
- Cultuur menselijke blaas kankercellen onder conventionele aanhanger cel kweekomstandigheden en onderhouden in een incubator van de 37 ° C bij 5% CO2geleverd. Handhaven van cellen op < 90% confluentie.
-
Groeien uit primaire tumoren
Opmerking: Tumor spheroïden kunnen ook worden afgeleid uit primaire blaas tumor bronnen zoals tumoren ontwikkeld uit carcinogeen-geïnduceerde blaas tumor modellen8. Bijvoorbeeld tumoren van de blaas gegenereerd op basis van muizen gevoed met N-butyl-(4-hydroxybutyl), N - nitrosamine (BBN), kan worden geoogst en gehakt in kleine stukjes (ongeveer 0,5 mm3) met behulp van steriele chirurgische instrumenten. Verteerd primaire monsters van menselijke blaas kanker kunnen ook bestudeerd worden in dit systeem.- Verzamelen en wassen van 0.5 mm3 tumor stukken in 5 mL ijskoud-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Deze wassen stap eenmaal herhaald.
- Het verzamelen van stukken van de tumor door centrifugeren bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en voeg 5 mL van DMEM bevattende 10 gewichtspercenten FBS. Tumor sferoïde/media mengsel overbrengen in een 6-well ultra-lage bijlage plaat. Incubeer bij 37 ° C voor ≥16 h voordat het inbedden in collageen matrix (zie stap 2.3).
2. voorbereiding van de 3D-cultuur-zaal
-
Type-1 collageen (afgeleid van de staart van de rat) in DMEM met 10% verdunnen FBS te maken van een 2 mg/mL van het mengsel volgens de instructies van de fabrikant.
- Kortom, het mengen van collageen met passend bedrag van 1 N NaOH-oplossing en DMEM door zachte pipetteren gebaseerd op instructies van de fabrikant voor het bereiken van fysiologische pH.
- Na het mengen van collageen en DMEM, snel jas de putten van de kamer-dia (voor de meeste toepassingen, kamer dia's met een aantal 1.5 cover-glas is optimale) met het mengsel van de collageen-DMEM voorafgaand aan de stolling (200 µL per putje). Laat de dia gecoate kamer als stationaire bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
Opmerking: De samenstelling van collageen gebaseerde matrix kan worden gewijzigd door de toevoeging van andere ingrediënten van de extracellulaire matrix, zoals fibronectine of laminin, volgens de toepassing van experiment.
- Zachtjes Pipetteer 500 µL van media met spheroïden (of tumor stukken, als primaire tumor monster wordt gebruikt) van de 6-well ultra-lage bijlage plaat in een lege 1,5 mL microcentrifuge buis. Wacht 2 minuten om te laten de spheroïden regelen naar de onderkant van de buis.
- Verwijder het supernatant voorzichtig uit de buis. Bereiden van een andere buis van type-1 collageen (2 mg/mL) gemengd met DMEM met 10% FBS en snel 500 µL van dit mengsel aan de spheroïden toevoegen. Meng voorzichtig de spheroïden en collageen door langzame pipetteren.
- 250 µL van spheroïden/collageen mengsel aan een putje van collageen-pre-coated kamer dia toevoegen. Laat de collageen-matrix met spheroïden te stollen volledig (ongeveer 30 minuten bij 37 ° C).
- Nadat de collageen-matrix is gestold, voeg 1 mL DMEM met 10% FBS aan elk putje (Figuur 1B). Incubeer de kamer dia in een incubator van de 37 ° C bij 5% CO2 geleverd tot klaar voor imaging.
3. levende cel Time-lapse Imaging
- Inschakelen van de confocal microscoop na instructies van de fabrikant en ervoor zorgen dat de kamer klimaat bereikt van 37 ° C en wordt geleverd met 5% CO2.
Opmerking: Onze Microscoop en de kamer meestal nodig 1 h te bereiken evenwicht van het systeem. - Zorgvuldig overbrengen in de kamer-dia de dia adapter aangesloten op de Microscoop.
- Zoek de spheroïden van belang met behulp van de doelstelling van een laag energieverbruik (bijvoorbeeld5 X) en imaging te starten met het hogere doel van de macht (in het huidige protocol, 20 X doelstelling wordt gebruikt voor de meeste van de levende cel beeldvorming voor de betere beeldkwaliteit).
Opmerking: Voor primaire blaas tumor monsters, 5 X en 10 X doelstellingen kunnen nodig zijn ter dekking van grotere opnamegebied. Voor onze time-lapse imaging, het imaging interval ligt 30 min en een Z-stack wordt gebruikt om het imago van de hele sferoïde. Doorgaans is de afstand tussen Z-segmenten ingesteld op 4 µm voor de 20 X doelstelling, en de totale afstand van de Z-as is ongeveer 200 µm. beelden kunnen worden verkregen met behulp van DIC en met fluorescentie als cellen/weefsels fluorescent proteïne markeringen haven. - Time-lapse imaging voor 24-72 h uitvoeren.
Opmerking: De duur wordt bepaald door het celtype en de behoeften van het experiment.
4. bereiding van de monster blok bevat kanker spheroïden voor bevroren weefsel segmenteren
- Trek voorzichtig het blok van collageen gel en spheroïden uit de kamer dia's met behulp van kleine pincet. Plaats het collageen gel blok in een mal van kunststof histologie.
- Spoel de collageen gel met 1 x PBS kort, en vervolgens repareren met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Let op: PFA potentieel kankerverwekkend is en moet met zorg worden behandeld. - Wassen van de collageen-gel met 1,5 mL 1 x PBS op een shaker voor 15 min. vervangen de PBS en herhaal de vorige stap voor wassen 3 x.
- Breng een dunne laag (ongeveer 3 mm) van optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde ter dekking van de onderkant van een nieuwe mal van kunststof histologie. Plaats de vaste en gewassen collageen gel op de top van de LGO samengestelde, vervolgens zorgvuldig insluiten de hele gel van de mal vullen met LGO samengestelde terwijl het vermijden van de vorming van alle luchtbellen in de LGO.
- Laat de schimmel bij 4 ° C gedurende 1 uur.
- Plaats de schimmel met de steekproef en de LGO samengestelde op een 100 mm petrischaal drijvend op vloeibare stikstof. Toestaan dat de steekproef aan flash-freeze volledig.
- Het blok van de bevroren monster bij-80 ° C voor toekomstig gebruik opslaan.
5. immunofluorescentie Imaging voor bevroren verdeelde kanker spheroïden
- Het blok bevroren monster uit de diepvries-80 ° C naar de kamer van-20 ° C van een cryostaat overbrengen.
-
Conventionele bevroren afdelen door de sectie interval in te stellen naar 7 µm uitvoeren Laat verdeelde monsters hechten aan het glasplaatje zonder rimpels of gevangen lucht.
- De dia's bij-80 ° C opslaan voordat u verdere kleuring.
Opmerking: Verschillende intervallen kunnen worden gebruikt voor experimentele behoeften.
- De dia's bij-80 ° C opslaan voordat u verdere kleuring.
- Lucht drogen de dia's gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Permeabilize van de monsters met PBS met 0,5% Triton X-100 gedurende 15 minuten.
- Wash monsters 3 x met PBS voor 10 min per wasbeurt.
- Omcirkelen de monsters op de dia met de hydrofobe belemmeringen met behulp van een pen hydrofobe barrière.
- Behandeling van de monsters met blokkerende oplossing (1 x PBS met 5% bovien serumalbumine (BSA)), gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Breng elk monster op de dia 40 µL van het primaire antilichaam-bevattende oplossing (1 x PBS met 5% BSA met 1:100 verdunning van primair antilichaam).
- Incubeer de dia's in primair antilichaam bij 37 ° C gedurende 1 uur, of bij kamertemperatuur 's nachts (de incubatietijd verkoopvoorwaarden afhankelijk primair antilichaam).
- Wash monsters 3 x met PBS gedurende 15 minuten (per wasbeurt).
- Breng elk monster op de dia 40 µL van secundair antilichaam-bevattende oplossing (1 x PBS met 5% BSA met 1:300 secundair antilichaam verdunning).
- Wash monsters 3 x met PBS gedurende 15 minuten (per wasbeurt).
- Vlek de monsters met Hoechst 33342 oplossing (1 µg/mL, verdund in PBS) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Daarna wassen monsters met PBS voor 5 min.
- Monteren van de monsters met montage medium en bestrijk ze met de gepaste afmetingen cover slips. Laat de dia's in donker bij kamertemperatuur gedurende 24 uur en voer confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succes bij de oprichting van invasieve blaas kanker tumor sferoïde vereist de vorming van gepaste afmetingen tumor spheroïden van cellijnen of primaire tumoren. Figuur 2 A toont gepaste afmetingen spheroïden ontwikkeld op basis van vier menselijke blaas kanker cellijnen (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J en UM-UC18). Figuur 2 B toont een sferoïde tumor van een muis BBN gegenereerde blaas tumor ingebed in collageen matrix. Deze spheroïden werden ingesloten zoals hierboven beschreven en representatieve beelden werden gemaakt met behulp van een microscoop voorzien voor levende cellen imaging. De 20 X objectief was gebruikt voor imaging-UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14 en UM-UC18 spheroïden, terwijl de muis blaas tumor spheroïden werden onderzocht met behulp van de 5 X en 10 X objectieven.
Representatieve beelden van menselijke blaas cel lijn spheroïden na 24-72 uur(Figuur 2)en muis BBN primaire blaas tumor spheroïden (Figuur 2B) demonstreren blaas kanker migratie naar de collageen-matrix. 253J, een niet-invasieve cellijn, blijven grotendeels intact met weinig of geen migratie(Figuur 2). Video's 1, 2en 3 bewijs leveren van het proces van time-lapse invasie voor UM-UC9, UM-UC13 en UM-UC14 spheroïden, respectievelijk. Video 4 toont de eigenschappen van de invasie van een sferoïde UM-UC18. Video 5 toont de twee gebieden van muis blaas tumor van 66 h tot 87 h na collageen insluiten.
Om aan te tonen de haalbaarheid van het gebruik van de immunofluorescentie kleuring van eiwit markers in onze invasieve tumor spheroïden, waren ze vastgesteld en gekleurd op 24 of 72 h. Figuur 3 shows representatieve monsters gekleurd voor ataxie Telangiectasia groep D-geassocieerde proteïne (ATDC, ook bekend als TRIM29), een eiwit dat een belangrijke rol speelt in de progressie van het tumorvorming en kanker van menselijke blaas en alvleesklier kanker9,10, tubulins (α en β), die vormen van microtubuli en een belangrijke rol bij het vormgeven van de cel en cellulaire beweging11,12, keratine 14 (KRT14), een basale epitheliale marker die betrokken zijn bij de invasie13, en vimentin (VIM), een mesenchymale marker14,15, 16. Deze beelden tonen dat visualisatie van cellulaire en subcellular structuren kan worden uitgevoerd met gebruikmaking van deze methodiek. De hogere vergroting van UM-UC14 weergegeven filamenteuze kleuring voor ATDC (Figuur 3A). De sterk invasieve cellen verspreid van UM-UC18 spheroïden na 24 h van invasie express hoog beschermingsniveau VIM, een marker van epitheliale-naar-mesenchymale overgang (EMT, Figuur 3B).
Opneming van verschillende soorten cellen (kanker-geassocieerde fibroblasten) in de spheroïden van de tumor is haalbaar en biedt een manier om de onderzoeken van heterologe cel interacties (Figuur 4 en 6 van de Video). In dit voorbeeld gebruikten we rode fluorescentie eiwit (RFP)-gelabelde menselijke fibroblasten en de 253J blaaskanker cel lijn getransduceerde met een speerpunt voor de expressie van groen fluorescent proteïne (GFP). Deze cellen werden gemengd aan formulier tumor spheroïden en ingebed in collageen. De invasie proces gecontroleerd door confocale microscopie. Figuur 4 toont dat interactie met de fibroblasten 253J van invasieve gedrag moduleren kan.
Figuur 5 toont het nut van het test systeem te testen remmers van invasie. Cytochalasin D is een bekende remmer van cel migratie en invasie die werkt door het blokkeren van actine polymerisatie17,18 en werd gebruikt als een voorbeeld. Cytochalasin D behandeling geremd de invasie van UM-UC9 spheroïden (Figuur 5A). Dezelfde concentratie van cytochalasin D (0,2 µM) vermag gedeeltelijk remmen invasie van UM-UC18 spheroïden (Figuur 5B). Aangezien het systeem kan worden gebruikt om het imago van meerdere wells en tumor organoids parallel, is het vatbaar voor screening van een beperkte panel van farmacologische agenten voor effect op de invasie.
Figuur 1 : Instellingen voor 3D-invasie assay met levende cel beeldvorming. (A) schematisch overzicht voor 3D-levende cel beeldvorming en immunofluorescentie. (B) dekglaasje aan kamer met collageen en media die worden gebruikt in dit experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Blaas kanker sferoïde invasie. (A) voorbeelden van menselijke blaas kanker cel lijn spheroïden ingesloten in een matrix van collageen gel. Spheroïden staan op het moment van insluiten (0 h, bovenste rij) of na 72 uur (UM-UC9 UM-UC13, UM-UC14, 253J) of 24 h (UM-UC18). Schaal bar = 50 µm. (B) voorbeelden van BBN-geïnduceerde muis blaas tumor invasie in de collageen-matrix. Pijlen geven de invasieve rand van tumor sferoïde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Immunofluorescentie analyse van invasieve blaas kanker spheroïden. (A) UM-UC14 tumor sferoïde na 72 uur van een invasie in collageen. Monsters werden gekleurd door conventionele immunofluorescentie assay voor ATDC (groen), tubuline (Violette) en kernen (Hoechst vlek blauw). Wit vierkant geeft het gebied met hogere vergroting weergave weergegeven in de onderste rij rechts twee panelen. Schaal bar = 50 µm. (B) UM-UC18 tumor spheroïden gekleurd voor KRT14 (groen), VIM (rood), ATDC (violet) en kernen (Hoechst vlek blauw) na 24 h van invasie in collageen. Schaal bar = 50 µm. witte vierkante geeft het gebied met hogere vergroting weergave weergegeven in de onderste juiste paneel. Stippellijn geeft ongeveer aan de grens van de oorspronkelijke tumor sferoïde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Fluorescently-geëtiketteerden tumor sferoïde integratie van fibroblasten. Invasie van GFP-label 253J blaas kankercellen alleen (onderste panelen) of mede gekweekte met RFP-geëtiketteerden fibroblasten (bovenste panelen) gecontroleerd voor 24 h. schaal bar = 50 µm. invasie is verbeterd met de toevoeging van de fibroblasten aan het systeem van de cultuur (bovenste paneel). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Effect van een kleine moleculaire drug targeting actine polymerisatie in invasie. (A) UM-UC9 tumor sferoïde behandeld cytochalasin D (0,2 µM) of DMSO (voertuig control) en gecontroleerd voor 72 h. (B) UM-UC18 tumor sferoïde behandeld cytochalasin D of DMSO voor 24 h. schaal bar = 50 µm. stippellijn geeft aan de grens van het origineel sferoïde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Mogelijk probleem | Aanbevolen oplossing |
| Lage aantal haalbare spheroïden | • Stijging aantal cellen gekweekt in suspensie • Zorgen voor > 90% cellen zijn levensvatbare na typsinization • Check cellen voor besmetting • Onderhouden van cellen in logaritmische groei voor typsinizing • Optimaliseren van cel kweekmedia • Het tijdstip van de cultuur in schorsing staat niet gewijzigd • Probeer alternatieve cellijnen |
| Spheroïden zijn te groot of te klein | • Het aantal cellen toegevoegd aan lage bijlage plaat aanpassen • Gebruik zachte pipetteren om te breken grotere cel aggregaten |
| Moeilijk zich te concentreren tijdens het verbeelden | • De dikte van collageen gel aanpassen. Voor doelstellingen met korte afstand, proberen te maken van de collageen gel dunner. • Ervoor zorgen dat de kamer dia of dekglaasje aan #1.5 • Optimaliseren van de grootte van spheroïden (50 – 150 µm in diameter) |
| De cellen migreren uit de imaging zone tijdens de invasie assay | • De grootte van spheroïden verkleinen • Center opnieuw de imaging zone elke 24 h indien nodig • Boeiende betegeling imaging technologie (indien van toepassing) ter dekking van grotere gebied • Gebruik van alternatieve cellijnen |
| De kamer dia uitdroogt | • Ervoor te zorgen is er geen lekkage in de setup van de kamer klimaat • Zorgen dat het vocht controlemechanisme is functioneel |
Tabel 1: Oplossen van problemen met de invasie van de 3D-model.
Video 1: Time-lapse video weergegeven: UM-UC9 sferoïde gekweekt in collageen van 0 aan 72 h. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2: Time-lapse video toont collectieve migratie van UM-UC13 sferoïde gekweekt in collageen van 0 aan 72 h. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 3: Time-lapse video van UM-UC14 sferoïde gekweekt in collageen van 0 aan 72 h. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 4: Time-lapse video van UM-UC18 sferoïde gekweekt in collageen van 0 tot 24 h. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 5: Time-lapse video van tumoren van de blaas BBN-geïnduceerde muis 66-84 h na collageen insluiten. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 6: Time-lapse video toont kanker spheroïden gevormd uit GFP-label 253J cellen gemengd met RFP-geëtiketteerden menselijke fibroblasten (links) of GFP-label 253J cellen alleen (rechts). Spheroïden werden ingesloten in collageen en gecontroleerd voor 24 h. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een 3D-tumor sferoïde model waarmee real-time opvolgen van blaas kanker invasie die essentieel is voor progressie van kanker en metastase. Dit systeem is vatbaar voor de integratie van verschillende stromale en cellulaire componenten waarmee onderzoekers aan betere recapituleren het weefsel communicatie waar blaas kanker invasie plaatsvindt. Blaas kanker spheroïden kan worden gegenereerd uit diverse bronnen zoals cellijnen (inclusief genetisch gemodificeerde cellijnen nuttig voor de behandeling van signalering van trajecten die invloed hebben op de invasie processen), en muis primaire tumoren (hier beschreven). Het kan mogelijk ook worden aangepast voor de analyse van de menselijke primaire tumor. Afhankelijk van de imaging systeem gebruikt, kan de fluorescentie worden gecontroleerd in real-time of door fixatie en kleuring op verschillende tijdstippen immunofluorescentie. Het systeem kan ook worden gebruikt om te testen potentiële remmers van de invasie. Dit maakt het systeem een veelzijdige en krachtige tool om te beoordelen van de blaas Kankerbiologie.
Het systeem van de confocal microscopie met de kamer van een klimaat waarin temperatuurregeling, vochtigheidsmanagement en CO2 levering is een belangrijke stuk van apparatuur voor de bouw van het model, als beschreven in dit protocol.
Het is wijd gemeld dat 3D-culturen bieden gespecialiseerde microenvironments die beter inheemse weefsels voor cel biologie en kanker studies19,20 nabootsen. Veel studies, is afhankelijk van permeabel membraan invoegen testen die komen niet overeen met de voorwaarden onder welke invasie in vivo plaatsvindt. Verder, deze conventionele studies kunnen gemakkelijk toezicht op het proces van de invasie in een real-time mode, noch gedetailleerde analyse van de monsters tijdens of volgende invasie. Hierin beschreven we een systeem dat handig voor zowel real-time is en eindpunt ondervraging van invasieve Kankerbiologie.
Collageen is een belangrijk onderdeel van de extra-cellulaire matrix (ECM), en bestaat in vele vormen. Collageen type 1 is de overheersende vorm van fibrillar collageen, terwijl collageen Type-4 is een nonfibrillar collageen die deel uitmaken van de kelder membraan-21. Kankercellen moeten de kelder membraan te penetreren en doorlopen collageen type-1 tijdens de progressie van niet-invasieve invasieve tumoren22. Gezien de alomtegenwoordige aanwezigheid in de ECM, is collageen type 1 gebruikt als matrix voor het maken van 3D-culturen, die de ECM beter dan de twee-dimensionale cultuur schotel5,6,23na te bootsen. Terwijl het hier geschetste systeem is gebaseerd op een matrix van het type 1 collageen, het kan worden aangepast voor het opnemen van andere stromale bestanddelen die op basis van experimentele vraag en nodig.
De methodologie die wij gebruiken voor het genereren van blaas kanker spheroïden van cellijnen omvat celcultuur in lage-gehechtheid voorwaarden en aggregatie van de cel. Niet alle cellen kunnen tolereren deze kweekomstandigheden en sommige kunnen ondergaan apoptosis of vorming van losse aggregaten die tijdens het proces te embedding collageen distantiëren. U wijzigt de tijd van de cultuur, kan mobiele nummer of integratie van andere celtypes in suspensie verbeteren de uitkomst. De cellijnen geselecteerd voor deze test, is afhankelijk van het doel van het experiment. We hebben deze techniek met succes gebruikt met 7/7 unieke menselijke blaas kanker cellijnen. Het is echter mogelijk dat sommige cellijnen mogelijk niet geschikt voor deze experimentele opzet. Bovendien hebben sommige cellijnen een zeer invasieve fenotype, wat leidt tot vroege scheiding van spheroïden en kankercellen verplaatsen uit het gebied van de observatie tijdens het time-lapse experiment. Proefprojecten voor het begrip van het algemene gedrag van cellijnen zijn sterk aanbevolen om het bepalen van de beste termijnen voor studies. Probleemoplossing voor veelvoorkomende problemen met sferoïde generatie en beeldvorming is vermeld in tabel 1.
Dit systeem is geschikt voor beperkte screening van farmacologische stoffen met potentieel blok kanker cel invasie. Hierin hebben we gebruikt Cytochalasin D, een cel-permeabele inhibitor van actine polymerisatie, ter illustratie van dit potentiële toepassing18. Zoals hierboven vermeld, remt 0,2 µM van cytochalasin D effectief de invasie van UM-UC9 en UM-UC18 spheroïden. Door gebruik te maken van meerdere kamers dia's en geautomatiseerde microscopische fase controle, is het effect van meerdere verbindingen op tumor sferoïde invasie haalbaar.
Hoewel deze tests zijn zeer geschikt om te beschrijven kwalitatief invasieve gedrag, is kwantificering van de omvang van de migratie en invasie ook mogelijk. Verwerving van beelden van spheroïden aan het begin van experiment en op verschillende tijdstippen, en de daaropvolgende image analyse voor het meten van de verste lineaire afstand van invasie in X, Y of Z richtingen kunnen een kwantificering van invasieve trekgedrag. Meer geavanceerde beeld analyse met behulp van fluorescently geëtiketteerd cellen kan worden gebruikt om te definiëren en te kwantificeren van afzonderlijke cel of een cel type gedrag afhankelijk van de experimentele behoefte of vraag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs bedank het laboratorium van Dr. Howard Crawford (University of Michigan) voor technische ondersteuning bieden materialen en apparatuur voor deze studie, en Alan Kelleher voor technische ondersteuning.
Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan de University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3 NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M.
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M.
