Summary
התהליכים השולטים הפלישה סרטן שלפוחית השתן מייצגים הזדמנויות סמן ופיתוח טיפולית. כאן אנו מציגים מודל הפלישה סרטן שלפוחית השתן אשר משלבת תרבות תלת-ממדי של גידול spheroids, הדמיה בצילום מואץ, מיקרוסקופיה קונפוקלית. טכניקה זו שימושית עבור הגדרת התכונות של תהליך פולשני, הקרנת סוכני טיפולית.
Abstract
סרטן שלפוחית השתן היא בעיה בריאותית משמעותית. ההערכה היא כי יותר מ 16,000 אנשים ימותו השנה בארצות הברית מסרטן שלפוחית השתן. בעוד 75% ממקרי סרטן שלפוחית השתן הם לא פולשנית, לא סביר גרורות, כ-25% ההתקדמות דוגמת גידול פולשני. עד חצי של החולים עם סרטן פולשני יפתחו relapse גרורתי קטלני. לפיכך, הבנת המנגנון של התקדמות פולשני בסרטן שלפוחית השתן היא קריטית לחזות תוצאות המטופל וכדי למנוע גרורות קטלניות. במאמר זה, נציג מודל הפלישה סרטן תלת מימדי המאפשר שילוב של תאים סרטניים ורכיבים סטרומה לחקות ויוו מצבים המתרחשים microenvironment הגידול שלפוחית השתן. מודל זה מספק הזדמנות לבחון את תהליך פולשני בזמן אמת באמצעות הדמיה בצילום מואץ, תחקור מסלולים מולקולריים המעורבים באמצעות קונאפוקלית immunofluorescent תרכובות הדמיה ומסך עם פוטנציאל הפלישה בלוק. בעוד פרוטוקול זה מתמקד סרטן שלפוחית השתן, סביר להניח כי ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי לבחון את הפלישה, תנועתיות בסוגי סרטן אחרים גם.
Introduction
הפלישה הוא שלב קריטי בהתקדמות סרטן, אשר נדרש עבור גרורות, והיא קשורה עם הישרדות נמוכה יותר, פרוגנוזה גרועה אצל חולים. ב סרטן שלפוחית השתן אנושי, הגידול הנפוץ ביותר בדרכי השתן הגורמת כ 165,000 מקרי מוות בשנה ברחבי העולם, שלב סרטן, הטיפול והפרוגנוזה אינם קשורים ישירות נוכחות או היעדרות של הפלישה1. כ- 75% מהמקרים של סרטן שלפוחית השתן מנוהלים שאינם שרירים פולשנית ואינם עם כריתה מקומית. לעומת זאת, סרטן פולשני שריר שלפוחית השתן (כ-25% מכלל המקרים) הם גידולים אגרסיביים עם שיעור גרורתי גבוה ומטופלים עם2,טיפול אגרסיבי multimodality3. לכן, הבנה מסלולים מולקולריים המפעילות הפלישה הוא חיוני כדי לאפיין טוב יותר את הסיכון של התקדמות פולשנית וכדי לפתח התערבויות טיפוליות אשר יכול למנוע התקדמות פולשני.
גידול פולשני התקדמות מתרחשת בסביבה מורכבת תלת-ממדיים (3-D), ושכוללת מגע תא הגידול עם תאים סרטניים אחרים, משתית, קרום המרתף של סוגים אחרים של תאים כולל תאים חיסוניים, fibroblasts, תאי שריר ואת כלי הדם תאי אנדותל. תמיכה חדיר (למשל, Transwell) מערכות assay מועסקים בדרך כלל quantitate סרטן התא הפלישה4, אבל מערכות אלה מוגבלים כי הם אינם מאפשרים פיקוח מיקרוסקופיים של תהליך הפלישה בזמן אמת, אחזור דוגמאות נוספות מכתים וניתוח המולקולרי של הוא מאתגר. התפתחות מערכת ספרואיד גידול שלפוחית השתן תלת-ממדי ללמוד הפלישה רצוי כי זה מאפשר שילוב של רכיבים המוגדרים microenvironmental עם הנוחות של מערכות במבחנה .
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת לחקור את התהליכים פולשנית של תאים סרטניים אנושיים שלפוחית השתן באמצעות assay הפלישה ספרואיד תלת-ממדי הופכים ג'ל מבוססי קולגן מטריצות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לאפשר חוקרים כדי לפקח על תנועתיות תא ו הפלישה ב בזמן אמת (איור 1א'). מערכת זו הוא תכליתי, יכול להיות שונה כדי לחקור את הגדרות סטרומה/גידול שונות. זה ניתן לשלב רוב שורות תאים של סרטן שלפוחית השתן או גידולים בשלפוחית השתן העיקרי, סטרומה תאים נוספים כגון סרטן הקשורים fibroblasts ותאים חיסוניים5,6,7. פרוטוקול זה מתאר מטריצה מורכבת של קולגן מסוג 1, אך יכול להיות שונה כדי לשלב את מולקולות אחרות כגון fibronectin, laminin או לחלבונים קולגן אחרים. יכול להיות מלווה תהליכים פולשניים במשך 72 h או יותר בהתאם היכולת של מיקרוסקופ, מערכת המשמשת. קיבעון, immunofluorescence מכתים של הגידול מוטבע בתוך המטריקס תלת-ממדי לפני, במהלך, ואחרי הפלישה מאפשר חקירת upregulated חלבונים בתאים פולשני, ובכך לספק מידע חיוני זה בדרך כלל נעדר או קשה לאסוף באמצעות דגמים תלת-ממדיים תרבות אחרים. גם יכול להיות מנוצל מערכת זו תרכובות מסך אשר לחסום את הפלישה, ניסחו איתות המסלולים מושפע תרכובות כאלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול סרטן Spheroids
-
גידול מ שורות תאים
- התרבות האנושית שלפוחית השתן התאים הסרטניים תחת מחסידי קונבנציונאלי תא תרבות תנאים ולתחזק ב חממה 37 ° C שסופק עם 5% CO2. לשמור על תאים ב- < 90% confluency.
הערה: תרבות מדיה המשמשת היא של Dulbecco ששינה המדיה מינימלי הכרחי (DMEM) המכילה 4.5 g/L D-גלוקוז-גלוטמין, 110 מ ג/ליטר נתרן פירובט, ויסופק עם 10% עוברית שור סרום (FBS) לאורך כל פרוטוקול זה. - יום אחד לפני תחילת הניסוי, trypsinize (על-ידי שימוש 0.25% טריפסין-EDTA) תאים, לכמת תא ריכוז והפצה של תאים6 עונה 1 פרק 10 מ"ל 3 תרבות המדיה כל טוב של צלחת מצורף 6-ובכן נמוך במיוחד.
- דגירה בתאים תנאי ההחזקה נמוך ב 37 ° C ≥16 h. זה אמור לאפשר מספיק זמן עבור תאים להפעיל עליה פונקציית צבירה לתוך spheroids עבור רוב שורות תאים של סרטן שלפוחית השתן.
הערה: היווצרות של spheroids יכול להיות שנצפו על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר הפוכה. הגודל האופטימלי והמספר של spheroids תלויה ניסויים בודדים, אך נמצא כי spheroids עם קטרים מ- 50 מיקרומטר מיקרומטר 150 מתאימים בדרך כלל זמן לשגות הדמיה באמצעות עדשה המטרה X 20. - כדי לשלב סוגי תאים נוספים, כגון fibroblasts או תאים חיסוניים לתוך spheroids, מערבבים את התאים הרצויים עם תאים סרטניים ביחס הרצוי (1:1, 1:10, וכו.) במצורף נמוך במיוחד צלחת, דגירה ב 37 ° C עבור ≥16 h לאפשר היווצרות מעורבות לתאים מסוג spheroids.
- התרבות האנושית שלפוחית השתן התאים הסרטניים תחת מחסידי קונבנציונאלי תא תרבות תנאים ולתחזק ב חממה 37 ° C שסופק עם 5% CO2. לשמור על תאים ב- < 90% confluency.
-
גידול מ גידולים ראשי
הערה: גידול spheroids יכול להיגזר גם גידול שלפוחית השתן העיקרי ממקורות כגון גידולים התפתח הנוצרות על-ידי גורם מסרטן שלפוחית השתן הגידול מודלים8. כך למשל, גידולים בשלפוחית השתן המופקים עכברים נמאס N-בוטיל - N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN), ניתן לקצור, כתוש לחתיכות קטנות (כ- 0.5 מ מ3) באמצעות כלי ניתוח סטרילי. מתעכל דגימות העיקרי של האדם שלפוחית השתן סרטן יכול להילמד גם במערכת זו.- לאסוף ולשטוף 0.5 מ מ3 גידול חלקים בתוך 5 מ"ל כקרח באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. חזור על שלב זה כביסה פעם אחת.
- לאסוף את השברים הגידול על ידי צנטריפוגה ב x 200 גר' 10 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע והוסף 5 מ של DMEM המכיל 10% FBS. העברה הגידול ספרואיד/מדיה תערובת צלחת מצורף 6-ובכן נמוך במיוחד. דגירה ב 37 ° C עבור ≥16 h לפני הטמעה לתוך מטריצת קולגן (ראה שלב 2.3).
2. הכנת תא תרבות תלת-ממדי
-
לדלל קולגן מסוג 1 (נגזר זנב החולדה) ב- DMEM המכיל 10% FBS להכין תערובת 2 מ"ג/מ"ל לפי הנחיות היצרן.
- בקיצור, לערבב קולגן עם הכמות המתאימה של פתרון 1 N NaOH, DMEM על ידי pipetting עדינה בהתאם להוראות היצרן כדי להשיג את ה-pH הפיזיולוגיות.
- לאחר ערבוב קולגן, DMEM, במהירות מעיל הבארות של השקופית קאמרית (עבור מרבית היישומים, הקאמרית שקופיות עם מספר 1.5 כיסוי-זכוכית הוא אופטימלי) עם התערובת קולגן-DMEM לפני התמצקות (200 µL טוב). לאפשר את השקופית קאמרית מצופה להיות נייח בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
הערה: הרכב מבוססי קולגן מטריקס יכול להיות שונה על-ידי הוספת מרכיבים אחרים של מטריצה חוץ-תאית, כגון fibronectin או laminin, בהתאם למטרות ניסוי.
- בעדינות pipet 500 µL של המדיה המכילה spheroids (או חתיכות הגידול, אם הגידול העיקרי מדגם משמש) מהצלחת מצורף 6-ובכן נמוך במיוחד לתוך צינור microcentrifuge mL 1.5 ריק. לחכות 2 דקות לאפשר את spheroids ליישב לתחתית הצינור.
- הסר בזהירות את תגובת שיקוע מהצינור. להכין עוד שפופרת של קולגן מסוג 1 (2 מ"ג/מ"ל) מעורבב עם DMEM המכיל 10% FBS ולהוסיף במהירות 500 µL של תערובת זו spheroids. מערבבים בעדינות את spheroids ואת קולגן מאת pipetting איטי.
- להוסיף 250 µL תערובת spheroids/קולגן טוב של קולגן טרום-מצופים קאמרית שקופיות. לאפשר את מטריצת קולגן המכיל spheroids לגבש לחלוטין (בערך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס).
- לאחר קולגן המטריצה היא פני השטח למוצק, להוסיף 1 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS כדי מכל קידוח (איור 1B). דגירה השקופית קאמרית ב חממה 37 ° C שסופק עם 5% CO2 עד מוכן עבור הדמיה.
3. חיים תא הדמיה בצילום מואץ
- הפעלת מיקרוסקופ קונפוקלי ההוראות של היצרן ולהבטיח כי תא האקלים מגיע ל- 37 מעלות צלזיוס, מסופק עם 5% CO2.
הערה: המיקרוסקופ ואת החדר שלנו בדרך כלל דורשים h 1 להגיע מערכת שיווי משקל. - בזהירות העברה השקופית קאמרית מתאם שקופיות המצורפת המיקרוסקופ.
- לאתר של spheroids עניין באמצעות מטרה צריכת חשמל נמוכה (למשל, 5 X) ולהתחיל הדמיה עם המטרה כוח גבוה יותר (בפרוטוקול הנוכחי, המטרה X 20 משמש עבור רוב ההדמיה תא בשידור חי עבור איכות התמונה טובה יותר).
הערה: עבור דגימות הגידול העיקרי שלפוחית השתן, 5 X ויעדים X 10 עשוי להיות נחוץ כדי לכסות שטח גדול יותר הדמיה. עבור הדמיה בצילום מואץ שלנו, מרווח הזמן דימות שוכן כ 30 דקות, ערימה Z משמש לשיקוף ספרואיד כל. בדרך כלל המרחק בין Z-פרוסות מוגדר 4 מיקרומטר עבור 20 X המטרה את המרחק הכולל של ציר Z הוא בסביבות 200 מיקרומטר. תמונות יכולה להיות מושגת באמצעות DIC, עם פלורסצנטיות אם תאים/רקמות הנמל סמני חלבון פלואורסצנטי. - לבצע הדמיה בצילום מואץ של 24-72 שעות.
הערה: המשך נקבע לפי סוג התא ולצרכים של הניסוי.
4. הכנת המדגם בלוק המכיל Spheroids סרטן של רקמות קפוא חלוקתה
- בזהירות הרימו את הבלוק של קולגן ג'ל spheroids מהשקופיות קאמרית באמצעות מלקחיים קטנים. מקם את הבלוק ג'ל קולגן תבנית היסטולוגיה פלסטיק.
- לשטוף את הג'ל קולגן עם 1 x PBS לזמן קצר ולאחר מכן לתקן אותו עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
התראה: PFA הוא מסרטן אפשרי ויש לטפל בזהירות. - לשטוף הג'ל קולגן עם 1.5 מ ל 1 x PBS ב מטרף במשך 15 דקות להחליף את PBS, חזור על השלב הקודם כביסה 3 x.
- למרוח שכבה דקה (כ 3 מ מ) לטמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) מתחם לכסות בתחתית תבנית פלסטיק היסטולוגיה חדש. המקום הקבוע, שטף קולגן ג'ל על גבי OCT מורכבים, ואז בזהירות מטביע את כל הג'ל ממלא את התבנית OCT מורכבים תוך הימנעות היווצרות בועות אוויר ב- OCT.
- להשאיר את התבנית 4 ° C עבור 1 h.
- מניחים את התבנית המכילה את הדגימה ואת OCT המורכב על צלחת פטרי 100 מ מ צף על חנקן נוזלי. לאפשר את הדגימה כדי הקפאה לחלוטין.
- חנות הרחוב דגימה קפוא ב- 80 ° C לשימוש עתידי.
5. immunofluorescence הדמיה עבור סרטן משרטוטי קפוא Spheroids
- העברה הרחוב דגימה קפוא מהמקפיא-80 ° C לשכת-20 ° C cryostat.
-
לבצע חלוקתה קפוא המקובלת על-ידי הגדרת מרווח סעיף 7 מיקרומטר. תן דוגמאות משרטוטי לצרף השקופית זכוכית ללא קמטים או לכוד אוויר.
- אחסן את השקופיות ב-80 מעלות צלזיוס לפני ביצוע נוסף מכתים.
הערה: ניתן להשתמש במרווחי זמן שונים כדי שיתאים לצרכים ניסיוני.
- אחסן את השקופיות ב-80 מעלות צלזיוס לפני ביצוע נוסף מכתים.
- האוויר יבש השקופיות לשעה בטמפרטורת החדר.
- Permeabilize את הדגימות עם PBS המכילה 0.5% טריטון X-100 למשך 15 דקות.
- שטיפת דוגם x 3 עם PBS 10 דקות לכל לשטוף.
- להקיף את הדגימות בשקופית מחסומים הידרופובי באמצעות עט הידרופובי המכשול.
- פנקו את הדגימות עם חסימה פתרון (1 x PBS המכילה 5% אלבומין שור (BSA)), לשעה בטמפרטורת החדר.
- µL 40 של ראשי המכיל נוגדנים פתרון (המכילה 5% BSA עם בטחונות דילול של נוגדן ראשוני PBS 1 x) חלות על כל מדגם בשקופית.
- דגירה השקופיות הראשית נוגדנים ב 37 ° C עבור 1 h או בטמפרטורת החדר למשך הלילה (זמן הדגירה והתנאים משתנים בהתאם נוגדן ראשוני).
- שטיפת דוגם x 3 עם PBS למשך 15 דקות (לכל לשטוף).
- µL 40 של פתרון המכיל נוגדנים משניים (המכילה 5% של BSA עם 1:300 נוגדנים משניים דילול PBS 1 x) חלות על כל מדגם בשקופית.
- שטיפת דוגם x 3 עם PBS למשך 15 דקות (לכל לשטוף).
- כתם הדגימות עם פתרון Hoechst 33342 (1 µg/mL, מדולל ב- PBS) בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן לשטוף דגימות עם PBS במשך 5 דקות.
- הר הדגימות הרכבה בינונית ולכסות עם שער גולשת בגודל מתאים. להשאיר את השקופיות בחושך בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ולאחר מכן בצע מיקרוסקופיה קונפוקלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יצירה מוצלחת של ספרואיד גידול סרטן שלפוחית השתן פולשנית דורש את היווצרות גידול בגודל מתאים spheroids של שורות תאים או גידולים העיקרי. איור 2 א מראה בגודל מתאים spheroids התפתח ארבע האנושי שלפוחית השתן סרטן שורות תאים (אום-UC9, אום-UC13, אום-UC14, 253J ו- UM-UC18). איור 2 B מראה על גידול ספרואיד בגלל גידול שלפוחית השתן שנוצר על-ידי BBN העכבר בתוך מטריצת קולגן. Spheroids אלו הוטבעו כמתואר לעיל, להחליפן בתמונות נלכדו באמצעות מיקרוסקופ מצויד עבור הדמיה תא חי. העדשה המטרה X 20 שימש הדמיה UM-UC9, אום-UC13, אום-UC14 ו- UM-UC18 spheroids, בעוד העכבר שלפוחית השתן הגידול spheroids נבחנו באמצעות 5 X ו- 10 X המטרה עדשות.
הנציגה של שלפוחית השתן האדם תא קו spheroids לאחר 24-72 h (איור 2א) ותמונות העכבר BBN שלפוחית השתן העיקרי הגידול spheroids (איור 2B) מדגימים העברה סרטן שלפוחית השתן לתוך מאטריקס קולגן. 253J, קו תא לא פולשנית, להישאר שלם ברובו עם מעט או ללא העברה (איור 2א). קטעי וידאו 1, 2ו- 3 מדגימים את הפלישה בצילום מואץ התהליך עבור UM-UC9, אום-UC13 ו- UM-UC14 spheroids, בהתאמה. וידאו 4 מציג את מאפייני הפלישה ספרואיד UM-UC18. 5 וידאו מציג שני האזורים של גידול שלפוחית השתן העכבר מ 66 h להטבעת קולגן שלאחר 87 h.
כדי להדגים את הכדאיות של שימוש immunofluorescence מכתים של סמני חלבונים שלנו spheroids גידול פולשני, היו קבועות, צבעונית ב 24 או 72 ה' איור 3 מראה מדגמים מייצגים צבעונית עבור קבוצת תסמונת אטקסיה טלנגיאקטזיה D-הקשורים חלבון (ATDC, הידוע גם בשם TRIM29), חלבון אשר ממלא תפקיד משמעותי התקדמות tumorigenesis וסרטן שלפוחית השתן אנושי,9,סרטן הלבלב10, tubulins (α וβ), המהווים microtubules, לשחק תפקיד מפתח בעיצוב את התא ואת התנועה הסלולרית11,12, קרטין 14 (KRT14), סמן אפיתל הבזליים מעורב הפלישה13, ו vimentin (VIM), סמן mesenchymal14,15, 16. תמונות אלה מדגימים כי ויזואליזציה של מבנים הסלולר subcellular יכול להתבצע באמצעות מתודולוגיה זו. הנוף הגדלה גבוהה יותר של UM-UC14 מראה filamentous מכתים עבור ATDC (איור 3א). התאים פולשני ביותר המופץ מ- UM-UC18 spheroids לאחר 24 שעות של פלישה אקספרס רמה גבוהה של VIM, סמן של המעבר אפיתל-אל-mesenchymal (החובשים, איור 3ב').
השתלבות של סוגי תאים שונים (סרטן הקשורים fibroblasts) spheroids גידול ריאלי ומספק דרך לבדוק אינטראקציות תא heterologous-תא (איור 4 ו- 6 וידאו). בדוגמה זו, השתמשנו חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP)-שכותרתו fibroblasts האנושי וסרטן שלפוחית השתן 253J תא קו transduced עם וקטור להבעה של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). תאים אלה היו מעורבים על הטופס גידול spheroids, המוטבעות קולגן. התהליך הפלישה בפיקוח מיקרוסקופיה קונפוקלית. איור 4 מדגים כי אינטראקציה עם fibroblasts יכול לווסת את התנהגות פולשנית של 253J.
איור 5 מדגים את תוכנית השירות של מערכת assay לבחון מעכבי הפלישה. Cytochalasin D הוא מעכב הידוע של נדידת תאים, פלישה אשר פועלת על ידי חסימת17,פלמור אקטין18 שימש כדוגמה. טיפול Cytochalasin D עכבות הפלישה של UM-UC9 spheroids (איור 5א). ריכוז זהה של cytochalasin D (0.2 µM) היא היכולת לעכב חלקית את הפלישה של UM-UC18 spheroids (איור 5B). מאז המערכת יכול לשמש כדי תמונה מרובים בארות, גידול organoids במקביל, זה נוטה הקרנת פאנל מוגבלת של סוכנים תרופתי השפעה על הפלישה.
איור 1 : כיוונון עבור assay הפלישה תלת-ממדי עם הדמיה תא בשידור חי- (א) סקירה סכמטית עבור הדמיה תלת-ממדי תא חי ו- immunofluorescence. (B) Coverslip קאמרית עם קולגן, מדיה המשמשת בניסוי זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : הפלישה ספרואיד סרטן שלפוחית השתן- (א) דוגמאות האנושי שלפוחית השתן סרטן תא קו spheroids מוטבע במטריצה ג'ל קולגן. Spheroids מוצגים בזמנו הטבעה (0 h, השורה העליונה) או לאחר 72 h (אום-UC9, אום-UC13, אום-UC14, 253J) או 24 שעות (אום-UC18). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) דוגמאות של BBN-induced העכבר שלפוחית השתן הגידול פלישת קולגן המטריצה. חיצים מציינים קצה ספרואיד גידול פולשני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : ניתוח immunofluorescence של סרטן שלפוחית השתן פולשני spheroids. (א) UM-UC14 ספרואיד הגידול לאחר 72 h של פלישת קולגן. דוגמאות היו מוכתם על ידי קונבנציונאלי immunofluorescence assay ATDC (ירוק), טובולין (סגול) של גרעינים (Hoechst כתם כחול). ריבוע לבן מציין את האזור עם נוף הגדלה גבוהה יותר המוצגים בשורה התחתונה ממש שני לוחות. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) UM-UC18 הגידול spheroids מוכתם KRT14 (ירוק), VIM (אדום), ATDC (סגול), גרעינים (Hoechst כתם כחול) לאחר 24 שעות של פלישת קולגן. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. לבן מרובע מציין את האזור עם נוף הגדלה גבוהה יותר המוצגים בחלונית התחתונה ימינה. קו מקווקו מציין בערך גבול ספרואיד הגידול המקורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : Fluorescently התווית על-ידי הגידול ספרואיד שילוב fibroblasts. הפלישה 253J GFP שכותרתו שלפוחית השתן תאים סרטניים לבד (לוחות התחתון) או תרבותי משותף עם התווית על-ידי RFP fibroblasts (לוחות העליון) במעקב במשך 24 ה סולם בר = 50 מיקרומטר. הפלישה משופרת עם תוספת של fibroblasts במערכת התרבות (החלונית העליונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : השפעת תרופה מולקולרי קטן מיקוד פלמור אקטין ב הפלישה. (א) UM-UC9 הגידול ספרואיד שטופלו cytochalasin D (0.2 µM) או דימתיל סולפוקסיד (בקרת הרכב) ולעקוב אחר עבור ה 72 (ב) UM-UC18 הגידול ספרואיד שטופלו cytochalasin D או דימתיל סולפוקסיד עבור 24 ה סולם בר = 50 מיקרומטר. קו מקווקו מציין את הגבול של המקור ספרואיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| בעיה אפשרית | הפתרון המומלץ |
| מספר נמוך של spheroids קיימא | • הגדלת מספר התאים תרבותי ההשעיה • ודא > 90% תאים הם קיימא לאחר typsinization • בדיקת תאים עבור זיהום • לשמור על תאי גידול לוגריתמי לפני typsinizing • למטב מדיה תרבות תא • שינוי הזמן תרבות במצב השעיה • נסה שורות תאים חלופי |
| Spheroids אתה גדול מדי או קטן מדי | • להתאים את מספר התאים הוסיף לצלחת מצורף נמוך • שימוש עדין pipetting לשבור אגרגטים תא גדול יותר |
| קשה להתרכז במהלך מדמיין | • להתאים את העובי של קולגן ג'ל. עבור מטרות עם מרחק עבודה קצר, נסה לעשות הקולגן ג'ל מדלל. • ודא כי השקופית קאמרית או coverslip הוא #1.5 • הגודל אופטימיזציה של spheroids (מיקרומטר 50 – 150 קוטר) |
| התאים נודדים מאזור הדמיה assay הפלישה | • לצמצם את הגודל של spheroids • מרכז מחדש לאזור הדימות כל 24 שעות אם יש צורך ריצוף מרתקים • הדמיה טכנולוגיה (אם ישים) כדי לכסות שטח גדול יותר • שקול שימוש שורות תאים חלופי |
| השקופית קאמרית מתייבש | • ודא יש זליגת בכיוונון קאמרית אקלים • להבטיח מנגנון בקרת לחות הוא פונקציונלי |
טבלה 1: פתרון בעיות הדגם התלת-ממדי הפלישה.
1 וידאו: בסה כ מציג וידאו זמן לשגות UM-UC9 ספרואיד תרבותי ב קולגן מ-0 ל ה 72 אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
2 וידאו: צילומי הווידאו מציג ההגירה הקולקטיבית של ספרואיד UM-UC13 תרבותי ב קולגן מ-0 ל ה 72 אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
וידאו 3: צילומי הווידאו של UM-UC14 ספרואיד תרבותי ב קולגן מ-0 ל ה 72 אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
4 וידאו: צילומי הווידאו של UM-UC18 ספרואיד תרבותי ב קולגן מ-0 עד ה 24 אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
5 וידאו: צילומי הווידאו של גידולים בשלפוחית השתן העכבר BBN-induced 66–84 h קולגן שלאחר הטבעה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
וידאו 6: צילומי הווידאו מציג spheroids סרטן נוצר מתאי GFP שכותרתו 253J מעורבב עם התווית על-ידי RFP האנושי fibroblasts (משמאל) או 253J GFP שכותרתו תאים לבד (מימין). Spheroids הוטבעו ב קולגן, במעקב במשך 24 ה אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן נתאר מודל תלת-ממדי הגידול ספרואיד המאפשר תצפית בזמן אמת של פלישה של סרטן שלפוחית השתן אשר הוא קריטי עבור התקדמות סרטן, גרורות. מערכת זו היא נוטה שילוב של רכיבים סטרומה וסלולריות שונים כדי לאפשר חוקרים כדי לסכם טוב יותר microenvironment את רקמת שם מתקיים הפלישה סרטן שלפוחית השתן. Spheroids סרטן שלפוחית השתן ניתן להפיק ממקורות שונים כגון שורות תאים (כולל שורות תאים מהונדסים שימושי עבור הבחינה של מסלולי להשפיע על תהליכים הפלישה איתות), ועכבר העיקרי גידולים (המתוארים כאן). זה יכול להיות גם להיות מותאם לניתוח הגידול העיקרי אנושי. תלוי במערכת דימות המשמש, קרינה פלואורסצנטית ניתן לנטר בזמן אמת או על ידי קיבוע immunofluorescence מכתים בנקודות זמן שונות. המערכת יכולה לשמש גם כדי לבדוק את מעכבי פוטנציאל הפלישה. זה הופך המערכת כלי רב-תכליתי, עוצמה להעריך וביולוגיה של סרטן שלפוחית השתן.
מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית עם תא האקלים אשר מספק בקרת טמפרטורה, בקרת לחות, אספקת2 CO היא פיסת ציוד לבניית המודל המתואר ב פרוטוקול זה.
נרחב דווח כי תרבויות תלת-ממדי מספקים microenvironments מיוחדים המחקות עדיף מקורי רקמות תאים ביולוגיה וסרטן מחקרים19,20. מחקרים רבים להסתמך על מבחני הוספה קרום חדיר אשר אינן משקפות את התנאים תחת אילו הפלישה מתרחשת ויוו. עוד יותר, מחקרים אלה קונבנציונלי לאפשר פיקוח קל של תהליך הפלישה אופנה בזמן אמת, וגם ניתוח מפורט של דגימות במהלך או הפלישה הבאים. בזאת אנו המתואר מערכת אשר שימושית עבור שניהם בזמן אמת והחקירה קצה לביולוגיה סרטן פולשני.
קולגן הוא מרכיב חשוב של המטריקס סלולרית נוספת (ECM), קיים בצורות רבות. קולגן מסוג 1 היא הצורה הדומיננטית של קולגן fibrillar ואילו קולגן סוג-4 קולגן nonfibrillar ממציא את קרום המרתף21. תאים סרטניים חייבים לחדור קרום המרתף, להעביר באמצעות קולגן מסוג 1 במהלך ההתקדמות לא פולשנית גידולים פולשניים22. לנוכח נוכחותו בכל מקום ECM, קולגן מסוג 1 שימש כמו מטריקס עבור בניית תרבויות תלת-ממדי, המחקות את ECM טוב יותר מימדי התרבות מנה5,6,23. בעוד מערכת שמפורטות כאן היא מבוססת על מטריצה קולגן מסוג 1, זה יכול להיות שונה כדי לכלול אחרים בשילובם סטרומה על סמך ניסיוני שאלה ואתה צריך.
המתודולוגיה שאנו משתמשים כדי ליצור spheroids סרטן שלפוחית השתן מתוך שורות תאים כרוך תרבית תאים בתוך תא צבירת ותנאים נמוכים-מצורף. לא כל התאים יכולים לסבול תנאים אלה התרבות, חלקם עלול לעבור אפופטוזיס או היווצרות של אגרגטים רופף זה מביצועם במהלך הקולגן הטמעת תהליך. שינוי הזמן תרבות, מספר הטלפון או שילוב סוגי תאים אחרים ההשעיה עשוי לשפר את התוצאה. הקווים התא שנבחר עבור assay הזה תלוי המטרה של הניסוי. אנחנו משתמשים בהצלחה טכניקה זו עם שורות תאים של סרטן שלפוחית השתן אנושי ייחודי 7/7. עם זאת, ייתכן כי שורות תאים מסוימים עשויים להיות לא מתאימים עבור הגדרת הניסוי הזה. יתר על כן, יש כמה שורות תאים הפנוטיפ מאוד פולשנית, מה שמוביל השיוך מוקדמת של spheroids, תאים סרטניים לנוע אל מחוץ לאזור התצפית במהלך הניסוי זמן לשגות. טייס הניסויים להבנת ההתנהגות הכללית של שורות תאים מומלץ מאוד כדי לקבוע את מסגרות הזמן הטוב ביותר ללימודים. פתרון בעיות עבור בעיות נפוצות עם דור ספרואיד והדמיה מפורט בטבלה1.
מערכת זו מתאימה להקרנה מוגבלת של תרכובות תרופתי עם פוטנציאל לחסום סרטן התא לפלישה. במסמך זה השתמשנו Cytochalasin D, מעכב תא חדיר של פלמור אקטין, כדי להדגים את זה יישום אפשריות18. כמתואר לעיל, 0.2 µM של cytochalasin D מעכב ביעילות את הפלישה של UM-UC9 ו- UM-UC18 spheroids. על ידי ניצול צ'יימברס מרובת שקופיות ובקרה אוטומטיות הבמה מיקרוסקופיים, ההשפעה של תרכובות מרובים על הפלישה ספרואיד הגידול הוא ריאלי.
למרות אלה מבחני המתאימה ביותר לתיאור התנהגות פולשנית איכותית, כימות היקף ההעברה, הפלישה היא גם אפשרית. רכישת תמונות של spheroids בתחילת הניסוי של, בנקודות זמן שונות, ובעקבות ניתוח כדי למדוד את מרחק ליניארי המרוחק ביותר של הפלישה ב- X תמונה, Y או Z כיוונים יכול לספק כימות של התנהגות פולשנית הנדידה. מתקדמים יותר תמונות ניתוח באמצעות fluorescently מתויג תאים יכול לשמש כדי להגדיר, quantitate תא בודד או בהתנהגות סוג התא בהתאם הצורך ניסויית או שאלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות המעבדה של ד ר הווארד קרופורד (אוניברסיטת מישיגן) עבור תמיכה טכנית מתן וחומרים במחקר זה ציוד אלן קילר לקבלת תמיכה טכנית.
עבודה זו מומן על ידי מענקים מן האוניברסיטה של מישיגן רוגל סרטן מרכז הליבה גרנט CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (פיפ), ניתן YIA (פיפ), CA17483601A1 R01 NIH (DMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M.
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M.
