Summary
방광 암 침공을 관리 하는 프로세스는 바이오 마커 및 치료 개발을 위한 기회를 나타냅니다. 여기 우리는 종양 spheroids 시간 경과 화상 진 찰, confocal 현미경 검사 법의 3 차원 문화를 통합 하는 방광 암 침공 모델 제시. 이 기술은 침략 과정의 기능을 정의 하 고 치료제 심사에 대 한 유용 합니다.
Abstract
방광 암은 중요 한 건강 문제 이다. 그것은 추정 이상 16000 사람들 방광 암에서 미국에서 올해를 죽을 것 이다. 방광 암의 75%는 비 침 습과 전이 가능성, 약 25%는 침략 적인 성장 패턴을 진행 합니다. 침 윤 성 암 환자의 절반 최대 치명적인 전이성 재발을 개발할 것입니다. 따라서, 환자 결과 예측 하 고 치명적인 전이 방지 하는 중요 한 이다 방광 암에 침략 적 진행의 메커니즘을 이해. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포 및 기질 구성 요소 vivo에서 발생 하는 조건에서 방광 종양 microenvironment 모방의 설립을 허용 하는 3 차원 암 침공 모델 제시. 이 모델에는 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여 실시간으로에서 침입 과정을 관찰, 블록 침공 가능성 confocal immunofluorescent 이미징 및 화면 화합물을 사용 하 여 관련 된 분자 경로 심문 하 기회를 제공 한다. 이 프로토콜은 방광 암에 초점을 맞추고, 그것은 유사한 방법 침공과 운동 성 뿐만 아니라 다른 종양 유형에서 검사 사용 될 수 가능성이 높습니다.
Introduction
침략은 암 진행, 전이, 필요한 이며 낮은 생존 및 환자에 있는 빈약한 예 지와 관련 있는 중요 한 단계 이다. 인간의 방광 암, 요로 전세계 연간 약 165000 사망 원인의 가장 일반적인 악성 암 단계, 치료 및 예 후는 직접 관련이 침공1의 유무. 방광 암의 경우 약 75%는 비 근육 침략과 관리 지역 절제와 함께. 반면, 근육 침 윤 성 방광 암 (모든 경우의 약 25%) 높은 전이성 속도 공격적인 종양 이며 적극적인 multimodality 치료2,3와 함께 처리 됩니다. 따라서, 이해 하는 분자 경로 침략을 방 아 쇠를 침략 적 진행을 방지할 수 있는 치료 내정간섭을 개발 하 고 더 침략 적 진행의 위험 특성을 필수적 이다.
종양 침 습 진행 복잡 한 3 차원 (3 차원) 환경에서 발생 하 고 다른 종양 세포, 기질, 지하실 멤브레인와 다른 종류의 세포 면역 세포, 섬유 아 세포, 근육 세포를 포함 하 여 종양 세포 상호 작용을 포함 하 고 혈관 내 피 세포입니다. 그들은 실시간으로 침공 과정의 미세한 모니터링을 허용 하지 않습니다 때문에 침투성 지원 (예, Transwell) 분석 결과 시스템은 일반적으로 암 세포 침공4, 하지만이 시스템을 quantitate를 고용 제한 됩니다 및 검색 더 얼룩 및 분자 분석에 대 한 샘플의 도전 이다. 체 외에 시스템의 편의 함께 정의 된 microenvironmental 구성 요소의 설립을 허용 하기 때문에 침공을 공부 하는 3 차원 방광 종양 회전 타원 체 시스템 개발이 바람직합니다.
이 프로토콜에서 세포 운동 성 모니터링 조사 관 수 있도록 콜라겐 기반 젤 매트릭스와 confocal 현미경 검사 법 통합 3 차원 회전 타원 체 침공 분석 결과 사용 하 여 인간의 방광 암 세포의 침입 과정을 심문 하는 시스템을 설명 하 고 실시간으로 (그림 1A)에 침공. 이 시스템은 다양 한 고가 다양 한 stromal 종양 설정을 수정할 수 있습니다. 그것은 암 관련 된 섬유 아 세포 및 면역 세포5,,67와 같은 대부분의 방광 암 세포 선 또는 기본 방광 종양와 추가 stromal 세포 통합할 수 있습니다. 이 프로토콜 타입-1 콜라겐으로 구성 된 행렬을 설명 하지만 fibronectin, laminin, 또는 다른 콜라겐 단백질 등 다른 분자를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 현미경을 사용 하는 시스템의 기능에 따라 72 h 이상 침입 프로세스를 다음 수 있습니다. 고정 및 이전, 도중, 그리고 침략 후 3 차원 매트릭스에 포함 된 종양의 면역 형광 얼룩 수 단백질 upregulated 침입 세포에 따라서 일반적으로 결 석 또는 수집 하기 어려운 중요 한 정보를 제공의 심문 다른 3 차원 문화 모델을 사용 하 여. 이 시스템 신호 경로 같은 화합물에 의해 영향을 나타냅니다 하 고 침입을 차단 하는 스크린 화합물에도 활용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 성장 암 Spheroids
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셀 라인에서 성장
- 기존의 점착 아래 문화 인간 방광 암 세포 세포 문화 조건 하 고 5% CO2와 함께 제공 되는 37 ° C 배양 기에서 유지 합니다. 에 셀 유지 < 90 %confluency.
참고: 사용 하는 문화 미디어는 Dulbecco의 최소 필수 미디어 (DMEM) 4.5 g/L D-포도 당, L-글루타민, 110 mg/L 나트륨 pyruvate, 포함 된 수정 하 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)이이 프로토콜을 통해 제공. - 실험의 시작에 앞서 1 일 trypsinize (0.25%를 사용 하 여 트립 신-EDTA) 셀 셀 농도 측정 및 1 x 106 셀 6-잘 매우 낮은 부착 판의 각 잘 3 mL 문화 미디어에 배포.
- ≥16 h에 대 한 37 ° C에서 낮은 첨부 조건 셀을 품 어. 이 셀에 대 한 충분 한 시간을 허용 해야 대부분 방광 암 세포 라인에 대 한 spheroids로 집계 하.
참고: spheroids의 형성은 거꾸로 밝은 분야 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 최적의 크기와 spheroids의 수, 개별 실험에 따라 달라질 수 있습니다 하지만 우리는 50 µ m에서 150 µ m 직경을 가진 spheroids는 일반적으로 렌즈는 20 X를 사용 하 여 시간 경과 영상에 적합 찾을. - 추가 셀 형식, 섬유 아 세포 등 면역 세포는 spheroids로 통합을 원하는 비율로 암 세포를 원하는 세포 혼합 (1:1, 1:10, 등.) 매우 낮은 첨부에 접시와의 형성을 허용 하도록 ≥16 h 37 ° C에서 품 어 혼합된 셀 형식 spheroids입니다.
- 기존의 점착 아래 문화 인간 방광 암 세포 세포 문화 조건 하 고 5% CO2와 함께 제공 되는 37 ° C 배양 기에서 유지 합니다. 에 셀 유지 < 90 %confluency.
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1 차 종양에서 성장
참고: spheroids 또한 기본 방광 종양에서 파생 될 수 있다 종양 종양 발암 물질 유발 방광 종양 모델8개발 같은 소스. 예를 들어 방광 종양 생쥐에서 생성 된 n 먹이-부 틸-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN)을 수확 하 고 무 균 수술 도구를 사용 하 여 (약 0.5 m m3) 작은 조각으로 다진 수. 기본 샘플 암 또한이 시스템에 공부 될 수 있다 인간 방광의 소화.- 수집 하 고 5 mL 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 0.5 m m3 종양 조각 씻어. 4 ° c.에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리 한 번이 세 단계를 반복 합니다.
- 4 ° c.에서 10 분 동안 200 x g 에서 원심 분리에 의해 종양 조각 수집 상쾌한을 제거 하 고 10% 포함 된 DMEM의 5 mL을 추가 FBS. 6 잘 매우 낮은 정판에 종양 회전 타원 체/미디어 혼합물을 전송. ≥16 콜라겐 매트릭스에 포함 하기 전에 h 37 ° C에서 품 어 (단계 2.3 참조).
2. 3 차원 문화 챔버 준비
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10% 포함 된 DMEM에 타입-1 콜라겐 (쥐 꼬리에서 파생) 희석 FBS 제조업체의 지침에 따라 2 mg/mL의 혼합물을 만들기 위해.
- 즉, 1 N NaOH 솔루션의 적절 한 양의 콜라겐을 혼합 하 고 부드러운 pipetting으로 DMEM 생리 pH를 달성 하는 제조업체의 지침에 따라.
- 콜라겐과 DMEM 혼합 후 신속 하 게 코트 챔버 슬라이드의 우물 (에 대 한 대부분의 응용 프로그램, 숫자 1.5 커버 유리 챔버 슬라이드 최적의) 응고 (200 µ L/잘) 전에 콜라겐 DMEM 혼합. 15 분 동안 실내 온도에 고정 되도록 코팅된 챔버 슬라이드를 수 있습니다.
참고: 콜라겐 기반 매트릭스의 구성을 수정할 수 있습니다 fibronectin 등 laminin, 다른 기질 재료를 추가 하 여 실험의 목적에 따라.
- 부드럽게 피펫으로 500 µ L 빈 1.5 mL microcentrifuge 관으로 6-잘 매우 낮은 정판에서 spheroids (또는 종양, 주 종양 샘플을 사용 하는 경우)를 포함 하는 미디어의. 튜브의 바닥에 침전 하는 spheroids를 2 분 동안 기다립니다.
- 튜브에서는 상쾌한을 조심 스럽게 제거. 10% 포함 된 DMEM 혼합 1 형 콜라겐 (2 mg/mL)의 또 다른 튜브 준비 FBS는 spheroids에이 혼합물의 500 µ L를 신속 하 게 추가. 부드럽게 천천히 pipetting으로 spheroids과 콜라겐을 섞는다.
- 콜라겐 사전 코팅 챔버 슬라이드의 250 µ L spheroids/콜라겐 혼합의 추가. 콜라겐 매트릭스 완전히 응고를 spheroids 포함 된 (37 ° C에서 약 30 분)을 허용 합니다.
- 콜라겐 매트릭스 경화 후 추가 10% 포함 된 DMEM의 1 mL FBS을 각 영역 (그림 1B). 이미징에 대 한 준비까지 5% CO2 와 함께 제공 된 37 ° C 배양 기에서 챔버 슬라이드를 품 어.
3. 라이브 셀 시간 경과 영상
- Confocal 현미경 제조업체의 지침에 따라 켜고 기후 챔버 37 ° C에 도달 하 고 5% CO2와 함께 제공 됩니다.
참고: 우리의 현미경 및 챔버 일반적으로 시스템이 평형에 도달 하는 1 h 필요 합니다. - 신중 하 게 현미경에 부착 된 슬라이드 어댑터 챔버 슬라이드를 전송 합니다.
- 낮은 전력 목표 (예를 들어, 5 X)를 사용 하 여 관심사의 spheroids를 찾아서 높은 전력 목표와 이미징 시작 (현재 프로토콜, 20 X 목표는 그것의 더 나은 이미지 품질에 대 한 라이브 셀 이미징의 대부분).
참고: 기본 방광 종양 샘플, 5 X 10 X 목적과 필요할 수 있습니다 큰 이미지 영역을 커버 하기 위하여. 우리의 시간 경과 영상에 대 한 이미징 간격을 30 분으로 설정 하 고 Z 스택 전체 회전 타원 체의 이미지를 사용 된다. 일반적으로 Z 슬라이스 간의 거리 설정 됩니다 4 µ m에 대 한 목표, 및 Z 축의 총 거리 20 약 200 μ m 이미지 DIC를 사용 하 여 얻을 수 있습니다와 형광 세포/조직 항구 형광 단백질 마커. - 24-72 h에 대 한 시간 경과 영상을 수행 합니다.
참고: 기간 셀 종류와 실험의 요구에 의해 결정 됩니다.
4. 냉동된 조직 단면에 대 한 암 Spheroids를 포함 하는 샘플 블록의 준비
- 조심 스럽게 작은 집게를 사용 하 여 콜라겐 젤과 챔버 슬라이드에서 spheroids의 블록을 들어올립니다. 플라스틱 조직학 형에서 콜라겐 젤 블록을 배치 합니다.
- 간단히, 1 x PBS와 콜라겐 젤 린스 하 고 수정 4 %paraformaldehyde (PFA)와 함께 PBS에 실 온에서 30 분.
주의: PFA 잠재적인 발암 물질 이며 신중 하 게 처리 되어야 한다. - 워시 15 분 바꾸기에 대 한 통에 1 x PBS의 1.5 mL와 콜라겐 젤 PBS와 이전 세척 단계 3를 반복.
- 최적의 절삭 온도 (10 월) 새로운 플라스틱 조직학 몰드의 하단 커버 화합물의 얇은 층 (약 3 m m)를 적용 합니다. 고정 배치 하 고 콜라겐 젤 OCT 위에 씻어 화합물, 후 신중 하 게 포함 전체 젤 oct OCT에서 모든 공기 거품의 형성을 피하고 있는 동안 복합 금형을 작성 하 여.
- 1 시간에 4 ° C에서 금형을 둡니다.
- 금형 샘플 및 10 월 복합 액체 질소에 100 mm 페 트리 접시에 놓습니다. 완전히 플래시 동결을 샘플을 수 있습니다.
- 나중에 사용-80 ° C에서 냉동된 샘플 블록을 저장 합니다.
5. 면역 형광 이미징 냉동된 Sectioned 암 Spheroids에 대 한
- 양도 cryostat의 상공 회의소는-20 ° C-80 ° C 냉장고에서 냉동된 샘플 블록.
-
기존의 냉동 단면 7 µ m 단면도 간격을 설정 하 여 수행 합니다. Sectioned 샘플 주름 없이 유리 슬라이드에 연결 하거나 공기 갇혀.
- 더 얼룩을 수행 하기 전에-80 ° C에 슬라이드를 저장 합니다.
참고: 다른 간격으로 실험적인 요구에 맞게 사용할 수 있습니다.
- 더 얼룩을 수행 하기 전에-80 ° C에 슬라이드를 저장 합니다.
- 공기 건조 실 온에서 1 h에 대 한 슬라이드.
- 0.5%를 포함 하는 PBS를 가진 샘플 permeabilize 15 분에 대 한 트라이 톤 X-100.
- 워시 워시 당 10 분에 대 한 PBS 가진 3 배를 샘플링합니다.
- 소수 성 장벽을 펜을 사용 하 여 소수 장벽 슬라이드에 샘플을 둘러싸 자.
- 실 온에서 1 h에 대 한 차단 솔루션 (1 x PBS 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 포함), 샘플을 처리 합니다.
- 기본 포함 하는 항 체 솔루션 (1 x PBS 포함 하는 1 차적인 항 체의 1: 100 희석와 5 %BSA)의 40 µ L 각 샘플 슬라이드에 적용 됩니다.
- 1 차적인 항 체 또는 하룻밤 (보육 시간 및 조건에 따라 다를 1 차적인 항 체) 실 온에서 1 h 동안 37 ° C에서의 슬라이드를 품 어.
- 세척 (세척) 당 15 분에 대 한 PBS 가진 3 배를 샘플링합니다.
- 2 차 항 체를 포함 하 솔루션 (1:300 이차 항 체 희석 BSA의 5%를 포함 하는 1 x PBS)의 40 µ L 각 샘플 슬라이드에 적용 됩니다.
- 세척 (세척) 당 15 분에 대 한 PBS 가진 3 배를 샘플링합니다.
- 10 분 동안 실내 온도에 Hoechst 33342 솔루션 (1 µ g/mL, PBS에 희석) 샘플을 얼룩. 다음 샘플 PBS 가진 5 분 동안 세척.
- 설치 매체와 함께 샘플을 탑재 하 고 적절 한 크기의 덮개 미 끄 러 짐으로 그들을 커버. 24 h에 대 한 실 온에서 어둠 속에서 슬라이드를 두고 confocal 현미경 검사 법을 수행.
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Representative Results
침 윤 성 방광 암 종양 회전 타원 체의 성공적인 창조 적절 한 크기의 종양 세포 선 또는 1 차 종양에서 spheroids의 형성을 필요합니다. 그림 2 A 4 인간의 방광 암 세포 선 (UM UC9, UM UC13, UM UC14, 253J, 및 UM UC18)에서 개발 하는 적절 한 크기의 spheroids를 보여 줍니다. 그림 2 B 콜라겐 매트릭스에 포함 된 BBN 생성 마우스 방광 종양에서 종양 회전 타원 체를 보여줍니다. 위에서 설명한 대로 이러한 spheroids 포함 했다 고 대표 이미지 라이브 셀 이미징에 대 한 장비는 현미경을 사용 하 여 체포 되었다. 마우스 방광 종양 spheroids 5 X 10 X 렌즈를 사용 하 여 시험 되었다 반면 20 X 객관적 렌즈 이미징 UM UC9, UM UC13, UM-UC14, 및 UM UC18 spheroids 항목으로 사용 되었다.
후 24-72 h (그림 2A) 인간의 방광 셀 라인 spheroids의 대표 이미지와 마우스 BBN 기본 방광 종양 spheroids (그림 2B) 방광 암 마이그레이션을 콜라겐 매트릭스로 보여 줍니다. 253J, 비-침략 적 셀 라인 크게 거의 없거나 전혀 없는 마이그레이션 (그림 2A) 그대로 유지 됩니다. 동영상 1, 2및 3 입증 시간 경과 침공 과정 UM UC9, UM-UC13, 및 UM UC14 spheroids, 각각. 비디오 4 UM UC18 회전 타원 체의 침공 속성을 보여 줍니다. 비디오 5 87 h 후 콜라겐 포함 하 66 h에서 마우스 방광 종양의 두 영역이 표시 됩니다.
면역 형광 염색 우리의 침략 적인 종양 spheroids에서 단백질 마커의 사용의 타당성을 보여, 그들은 고정 되었고 24 또는 72 h. 그림 3 보여 줍에서 대표 샘플 증 Telangiectasia 그룹에 대 한 스테인드 스테인드 D 관련 단백질 (ATDC, 일컬어 TRIM29), 인간의 방광과 췌장암9,10, tubulins (α와 β) microtubules 양식 tumorigenesis 및 암 진행에 중요 한 역할을 담당 하는 단백질 및 세포와 세포 운동11,12, 각 질 14 (KRT14), 기저 상피 마커 침공13, vimentin (VIM), 엽 마커14,15에서 형성에 중요 한 역하시오 16. 이러한 이미지의 세포 및 subcellular 구조 시각화가이 방법론을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 보여 줍니다. UM-UC14의 높은 확대 보기 ATDC(그림 3)에 대 한 얼룩 filamentous 보여줍니다. 매우 침략 적 셀의 24 h 익스프레스 VIM, 상피-엽 전환 (응급, 그림 3B)의 감 적의 높은 수준의 후 UM UC18 spheroids에서 전파.
종양 spheroids에 다른 종류의 세포 (섬유 아 세포를 암 관련) 설립 가능 하 고 분리 셀 상호 작용 (그림 4 및 비디오 6)를 검사 하는 방법을 제공 합니다. 이 예제에서는 빨간색 형광 단백질 (RFP)를 사용 하는 우리에-레이블된 인간의 섬유 아 세포와 253J 방광 암 세포 선 녹색 형광 단백질 (GFP)의 표현에 대 한 벡터와 함께 불리고. 이 세포 형태 종양 spheroids를 혼합 하 고 콜라겐에 포함 했다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 감시 하는 침입 과정. 그림 4 는 섬유 아 세포와의 상호 작용 253J의 침략 적 행동을 조절 수 있습니다 보여 줍니다.
그림 5 의 억제제를 테스트 분석 결과 시스템의 유틸리티를 보여 줍니다. Cytochalasin D 셀 마이그레이션 및 말라 합17,18 를 차단 하 여 작동 하 고 예를 들어 사용 되었다 침입의 알려진된 억제제 이다. Cytochalasin D 치료 UM UC9 spheroids (그림 5A)의 침공을 저해. Cytochalasin D의 동일한 농도 (0.2 µ M) 부분적으로 UM UC18 spheroids (그림 5B)의 침략을 억제 수 있다. 시스템은 여러 개의 우물과 동시에 종양 organoids 이미지를 사용할 수 있습니다, 이후 침공에 효과 대 한 약리학 적인 에이전트의 제한 된 패널 심사 받을입니다.
그림 1 : 라이브 셀 이미징 분석 결과 3 차원 침공에 대 한 설치. (A) 3 차원 라이브 셀 이미징 및 면역 형광 검사에 대 한 도식 개요. (B) Coverslip 콜라겐와이 실험에 사용 된 미디어 챔버. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 방광 암 회전 타원 체 침략. (A) 인간의 방광 암 세포 선 spheroids 콜라겐 젤 매트릭스에 포함의 예. Spheroids 포함 (0 h, 맨 위 행) 또는 후 72 h (UM UC9, UM UC13, UM-UC14, 253J) 또는 24 시간 (UM-UC18)에 표시 됩니다. 눈금 막대 50 µ m. (B) 예의 BBN 유도 마우스 방광 종양에 침략 콜라겐 매트릭스 =. 화살표는 종양 회전 타원 체의 침략 지를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 침 윤 성 방광 암 spheroids의 면역 형광 분석. (A) 콜라겐에 침략의 72 h 후 UM UC14 종양 회전 타원 체. 샘플은 ATDC (녹색), tubulin (보라색), 및 핵 (Hoechst 얼룩 블루)에 대 한 기존의 면역 형광 분석 결과 의해 얼룩이 있었다. 흰색 사각형은 높은 확대 보기 맨 아래 행 바로 두 개의 패널에 표시 된 영역을 나타냅니다. 눈금 막대 = 50 µ m. (B) UM UC18 종양 spheroids 콜라겐에 침략의 24 시간 후 KRT14 (녹색), 대 한 VIM (레드), ATDC (바이올렛), 및 핵 (Hoechst 얼룩 블루) 스테인드. 눈금 막대 = 50 µ m. 화이트 스퀘어 더 높은 확대 전망 하단 오른쪽 패널에 표시 된 영역을 나타냅니다. 파선은 대략 원래 종양 회전 타원 체의 경계를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 종양 붙일 레이블 회전 타원 체 fibroblasts 통합. GFP 표시 253J 방광 암 세포 혼자 (하단 패널)의 내 습 또는 RFP 표시 된 섬유 아 세포 (상단 패널) 24 h. 규모에 대 한 감시와 공동 경작 바 = 50 µ m. 침략 문화 시스템 (상단 패널)에 섬유 아 세포의 추가 향상 된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 침략에 말라 합을 대상으로 작은 분자 약물의 효과. (A) UM UC9 종양 회전 타원 체 cytochalasin D로 치료 (0.2 μ M) 또는 DMSO (차량 통제)에 72 h. (B) UM UC18 종양 회전 타원 체로 치료 cytochalasin D 또는 DMSO 24 h. 규모에 대 한 모니터링 및 바 = 50 µ m. 점선된 라인의 경계를 나타냅니다 회전 타원 체입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 가능한 문제 | 권장된 솔루션 |
| 가능한 spheroids의 낮은 수 | • 증가 수가 셀에 양식 • 보장 > 90% 셀은 typsinization 후 가능한 오염에 대 한 • 검사 셀 • 셀 typsinizing 전에 로그 성장 유지 • 세포 배양 최적화 • 수정 문화 시간 정지 상태에서 • 시도 대체 셀 라인 |
| Spheroids는 너무 크거나 너무 작은 | • 낮은 정판에 추가 하는 셀의 수를 조정 • 더 큰 셀 집계 뜨 pipetting 부드러운 사용 |
| 하드 상상 하는 동안 초점을 | •는 콜라겐 젤의 두께 조정 합니다. 짧은 거리와 목표에 대 한 얇은 젤 콜라겐을 확인 하려고 합니다. • 챔버 슬라이드 또는 coverslip #1.5 인지 확인 •는 Spheroids (직경에서 50-150 µ m)의 크기를 최적화 |
| 세포 이미징 영역 침공 분석 결과 중 마이그레이션 | •는 Spheroids의 크기를 줄일 • 다시 필요한 경우 이미징 영역 마다 24 h 센터 • 매력적인 기와 이미징 기술 (있는 경우) 더 큰 영역을 커버 • 대체 셀 라인의 사용을 고려 |
| 챔버 슬라이드 밖으로 마르면 | • 기후 챔버 설정에서 되지 있는지 확인 • 수 분 제어 메커니즘은 작동 확인 |
표 1: 3 차원 침공 모델 문제 해결.
비디오 1: 0에서 72 h.에 콜라겐에서 교양 시간 경과 비디오 보여주는 UM UC9 회전 타원 체 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 2: 0에서 72 h.에 콜라겐에서 교양 UM UC13 회전 타원 체의 집단 이주를 보여주는 시간 경과 비디오 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 3: 0에서 72 h.에 콜라겐에서 교양 UM UC14 회전 타원 체의 시간 경과 비디오 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 4: 0에서 24 h.에 콜라겐에서 교양 UM UC18 회전 타원 체의 시간 경과 비디오 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 5: BBN 유도 마우스 방광 종양 66의 시간 경과 비디오-84 h 후 콜라겐 포함. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 6: 암 spheroids GFP 표시 된 253J 세포에서 형성을 보여주는 시간 경과 비디오 RFP 표시 된 인간 섬유 아 세포 (왼쪽)와 혼합 또는 253J GFP 표시 된 셀만 (오른쪽). Spheroids는 콜라겐에 포함 했다 고 모니터링 24 h. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
여기는 방광 암은 암 진행과 전이 대 한 중요 한 침입의 실시간 관찰을 허용 하는 3 차원 종양 회전 타원 체 모델에 설명 합니다. 이 시스템은 다양 한 기질과 세포 구성 요소 있도록 더 나은 정리를 조사 조직 microenvironment 방광 암 침공 수행의 의무가 있습니다. 방광 암 spheroids (를 포함 하 여 유전자 변형된 세포 선을 침공 프로세스에 영향을 주는 경로 신호의 검사에 유용), 셀 라인 등 다양 한 소스에서 생성 될 수 있습니다 및 기본 마우스 종양 (여기에 설명 된). 그것은 잠재적으로 수 또한 인간의 기본 종양 분석에 대 한 적응. 이미징 시스템 사용에 따라 실시간으로 또는 고정 및 다양 한 시간 포인트에서 얼룩 면역 형광 형광을 모니터링할 수 있습니다. 시스템 내 습의 잠재적인 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다. 이것은 시스템 방광 암 생물학을 평가 하기 위해 다양 하 고 강력한 도구.
기후 챔버 온도 제어, 습도 제어, 및 CO2 공급을 제공 하는 confocal 현미경 시스템이이 프로토콜에서 설명 하는 모델을 생성 하기 위한 장비의 주요 작품 이다.
그것은 널리 알려졌다 3 차원 문화 전문된 microenvironments는 더 나은 모방 세포 생물학 및 암 연구19,20에 대 한 기본 조직 제공. 많은 연구는 침공 vivo에서수행할 조건을 반영 하지 않습니다 투과성 막 삽입 분석 실험에 의존 합니다. 또한, 이러한 기존의 연구 허용 쉬운 실시간 패션에 침공 과정의 감시도 동안 샘플 또는 다음 침공의 상세한 분석. 여기 우리 모두 실시간으로 유용 하는 시스템을 설명 하 고 침략 암 생물학의 끝점 심문.
콜라겐 엑스트라 세포 매트릭스 (ECM)의 중요 한 요소 이며 여러 형태로 존재 합니다. 반면 유형 4 콜라겐은 지하실 막21를 만드는 nonfibrillar 콜라겐 type 1 콜라겐 원 콜라겐의 주된 형태입니다. 암 세포 지하실 막에 침투 하 고 침략 적인 종양22에 비-침략 적에서 진행 하는 동안 1 형 콜라겐을 통해 이동 해야 합니다. ECM에서의 유비 쿼터 스 존재를 감안할 때, 타입-1 콜라겐 사용 되었습니다 매트릭스로 2 차원 문화 접시5,,623보다 더 나은 ECM 모방 3 차원 문화 건설에 대 한. 여기에 설명 된 시스템은 type 1 콜라겐 매트릭스에 근거한 실험적인 질문에 따라 다른 stromal 성분을 포함 하도록 수정할 수 있습니다 그것과 필요.
셀 라인에서 방광 암 spheroids를 생성 하기 위해 사용 하는 방법 낮은 첨부 조건 및 셀 집계에서 세포 배양을 포함 한다. 모든 세포는 이러한 문화 조건 참을 수 있는 하 고 일부 apoptosis 또는 느슨한 집계 과정을 포함 하는 콜라겐 동안 해리의 형성을 받을 수 있습니다. 문화 시간 수정, 휴대 전화 번호 또는 다른 세포 유형 현 탁 액에서 통합은 결과 높일 수 있습니다. 이 분석 결과 대해 선택한 셀 라인 실험의 목표에 따라 달라 집니다. 7/7 독특한 인간의 방광 암 세포 선으로이 기술을 성공적으로 사용 했습니다. 그러나, 그것은 일부 셀 라인은이 실험적인 체제에 대 한 적합 하지 않을 수 있습니다. 또한, 일부 셀 라인 매우 침략 적 표현 형, spheroids, 및 시간 경과 실험 기간 동안 관측 지역에서 이동 하는 암 세포의 이른 분열에 이르게 했습니다. 셀 라인의 일반적인 동작을 이해 하기 위한 파일럿 실험은 연구에 대 한 최고의 시간 프레임을 결정 하기 위해 좋습니다. 회전 타원 체 생성 및 이미징 일반적인 문제에 대 한 문제 해결 표 1에 나열 됩니다.
이 시스템은 블록 암 세포 침공 가능성이 약리학 적인 화합물의 제한 상영에 적합 합니다. 여기 우리는18이 잠재적인 응용 프로그램 설명 하기 위해 Cytochalasin D, 말라 합의 세포 투과성 억제제를 사용 합니다. 위와 같이, cytochalasin D의 0.2 µ M UM UC9와 UM UC18 spheroids의 침공을 효과적으로 억제. 멀티 챔버 슬라이드 및 자동화 된 현미경 단계 제어를 이용 하 여 종양 회전 타원 체 침략에 여러 화합물의 효과 가능 합니다.
비록 이러한 분석은 질적으로 침략 적 행동을 설명 하기 위해 가장 적합, 마이그레이션 및 내 습의 넓이의 정량화 실현 이기도 합니다. 실험의 다양 한 시간 점, 그리고 후속 시작에서 spheroids의 이미지 수집 이미지 x에서의 멀리 선형 거리를 측정 하는 분석, Y 또는 Z 방향 침략 철새 동작의 정량화를 제공할 수 있습니다. 고급 이미지 분석을 사용 하 여 붙일 셀을 표시 하는 것은 정의 하 고 개별 셀 또는 셀 형식 동작 실험 필요 또는 질문에 따라 quantitate 사용 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원 및 제공 자료와이 연구에 대 한 장비 및 기술 지원에 대 한 앨런 Kelleher 박사 하 워드 크로포드 (미시간 대학)의 실험실을 감사 하 고 싶습니다.
이 작품은 미시간 Rogel 암 센터 코어 그랜트 CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS)의 대학에서 교부 금에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
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