Summary
Processer for blære cancer invasion repræsenterer muligheder for biomarkør og terapeutisk udvikling. Her præsenterer vi en blære kræft invasion model, der indeholder 3D-kultur af tumor spheroids, time-lapse billedbehandling og konfokal mikroskopi. Denne teknik er nyttig til at definere funktioner af den invasive proces og for screening terapeutiske agenter.
Abstract
Blærekræft er et væsentligt sundhedsproblem. Det anslås, at mere end 16.000 mennesker vil dø i år i USA fra blærekræft. Mens 75% af blære kræft er non-invasiv og usandsynligt at metastaserer, ca. 25% gå videre til en invasiv vækstmønster. Op mod halvdelen af patienter med invasiv kræft vil udvikle dødbringende metastatisk tilbagefald. Forstå mekanisme af invasive progression i blærekræft er således afgørende at forudsige patientens resultater og forhindre dødbringende metastaser. I denne artikel præsenterer vi en tre-dimensionelle kræft invasion model, som giver mulighed for indarbejdelsen af tumorceller og stromale komponenter til at efterligne i vivo betingelser, der forekommer i blæren tumor mikromiljø. Denne model giver mulighed for at observere den invasive proces i realtid ved hjælp af time-lapse imaging, afhøre den molekylære veje involveret ved hjælp af Konfokal immunfluorescent imaging og skærmen forbindelser med potentiale til at blokere invasion. Mens denne protokol fokuserer på blærekræft, er det sandsynligt, at lignende metoder kan bruges til at undersøge invasion og motilitet i andre tumortyper.
Introduction
Invasionen er et kritisk skridt i kræft progression, som er nødvendig for metastaser, og er forbundet med lavere overlevelse og dårlig prognose hos patienter. I menneskelige blærekræft, den mest almindelige malignitet i urinvejene, som forårsager omkring 165.000 dødsfald om året på verdensplan, er kræft stadie, behandling og prognose direkte relateret til tilstedeværelsen eller fraværet af invasion1. Omkring 75% af tilfældene af blærekræft er ikke-muskel invasive og er lykkedes med lokale resektion. Derimod muskel-invasive blære kræftformer (ca. 25% af alle tilfælde) er aggressive tumorer med høje metastatisk og behandles med aggressiv multimodalitet terapi2,3. Derfor er forstå de molekylære processer, der udløser invasion væsentligt bedre karakterisere risikoen for invasiv progression og udvikle terapeutiske indgreb, som kan forhindre invasive progression.
Tumor invasive progression opstår i et komplekst tredimensionale (3D) miljø og indebærer tumor celle interaktion med andre tumorceller, stroma, basalmembranen og andre typer af celler, herunder immun celler, fibroblaster, muskelceller og vaskulære endotelceller. Permeable støtte (f.eks.Transwell) assay systemer er ofte ansat til at kvantificere kræft celle invasion4, men disse systemer er begrænset, fordi de ikke tillader mikroskopiske overvågning af invasion processen i real-tid og den hentning af prøver til yderligere farvning og molekylær analyse er udfordrende. Udvikling af en 3D-blære tumor klumpformet system at studere invasion er ønskelig, fordi det giver mulighed for indarbejdning af definerede microenvironmental komponenter med bekvemmeligheden af in vitro- systemer.
I denne protokol, vi beskriver et system for at afhøre de invasive processer af menneskelige blære cancerceller ved hjælp af en 3D-klumpformet invasion assay indarbejde kollagen-baseret gel matricer og konfokal mikroskopi til at tillade efterforskere at overvåge celle motilitet og invasion i realtid (fig. 1A). Dette system er alsidige og kan ændres til at afhøre forskellige stromale/tumor indstillinger. Det kan optage de fleste blære cancer cellelinjer eller primære blære tumorer og yderligere stromale celler, såsom kræft forbundet fibroblaster og immunceller5,6,7. Denne protokol beskriver en matrix bestående af type-1 kollagen, men kan ændres til at omfatte andre molekyler såsom fibronektin, laminin eller andre kollagen proteiner. Invasive processer kan følges i 72 timer eller længere afhængigt af evnen til mikroskop og systemet bruges. Fiksering og immunfluorescens farvning af tumor indlejret i matrixen 3D-før, under og efter invasionen tillader afhøring af proteiner upregulated i invasive celler, hvilket giver afgørende oplysninger der normalt fraværende eller vanskeligt at samle ved hjælp af andre modeller, 3D-kultur. Dette system kan også udnyttes, at skærmen forbindelser som blokerer invasion og afgrænse signaling veje ramt af sådanne forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voksende kræft Spheroids
-
Vokser fra cellelinjer
- Kultur menneskelige blære cancerceller under konventionelle tilhænger celle kultur betingelser og vedligehold i et 37 ° C inkubator leveres med 5% CO2. Vedligeholde celler på < 90% confluency.
Bemærk: kultur medier bruges er Dulbeccos modificerede minimum essential medier (DMEM) der indeholder 4,5 g/L D-glucose, L-glutamin, 110 mg/L natrium pyruvat, og leveres med 10% føtal bovint serum (FBS) i hele denne protokol. - En dag i begyndelsen af eksperimentet, trypsinize (ved hjælp af 0,25% Trypsin-EDTA) celler, kvantificere celle koncentration og distribuere 1 x 106 celler i 3 mL kultur medier i hvert hul i en 6-godt Ultra-Low vedhæftede plade.
- Inkuber celler i lav vedhæftede betingelser ved 37 ° C for ≥16 h. Dette bør give tilstrækkelig tid til celler til samlet i spheroids for de fleste blære cancer cellelinjer.
Bemærk: Dannelsen af spheroids kan observeres af inverteret lysfelt mikroskop. Den optimale størrelse og antallet af spheroids kan afhænge af individuelle eksperimenter, men vi finder at spheroids diametre fra 50 µm til 150 µm er generelt egnet til time-lapse imaging ved hjælp af en 20 X mål linse. - For at optage yderligere celletyper, såsom fibroblaster eller immunceller til spheroids, Bland de ønskede celler med kræftceller på ønskede forhold (1:1, 1:10, osv.) i en ultra-lav vedhæftet fil plade og inkuberes ved 37 ° C i ≥16 h til tillader dannelsen af blandet celle type spheroids.
- Kultur menneskelige blære cancerceller under konventionelle tilhænger celle kultur betingelser og vedligehold i et 37 ° C inkubator leveres med 5% CO2. Vedligeholde celler på < 90% confluency.
-
Vokser fra primære tumorer
Bemærk: Tumor spheroids kan også udledes af primære blære tumor kilder såsom tumorer udviklet fra kræftfremkaldende stof-induceret blære tumor modeller8. For eksempel, blære tumorer genereret fra mus fodret med N-butyl - N-(4-hydroxybutyl) Nitrosamin (BBN), kan høstes og hakket i små stykker (ca. 0,5 mm3) ved hjælp af steril kirurgiske instrumenter. Fordøjet primære prøver af menneskelige blære kræftformer kan også studeres i dette system.- Saml og vask 0,5 mm3 tumor stykker i 5 mL iskold fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Centrifugering ved 200 x g i 5 min. ved 4 ° C. Gentag trinnet vask en gang.
- Indsamle tumor stykker ved centrifugering ved 200 x g i 10 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og tilsættes 5 mL af DMEM indeholdende 10% FBS. Overføre tumor klumpformet/media blanding til en 6-godt Ultra-Low vedhæftede plade. Der inkuberes ved 37 ° C i ≥16 h før indkapslet i kollagen matrix (Se trin 2.3).
2. udarbejdelsen af 3D-kultur-kammer
-
Fortynd type 1 kollagen (afledt af rotte hale) i DMEM der indeholder 10% FBS at gøre en 2 mg/mL blanding ifølge producentens anvisninger.
- Kort sagt, bland kollagen med passende mængde 1 N NaOH løsning og DMEM af blid pipettering baseret på producentens vejledning for at opnå fysiologisk pH.
- Efter blanding kollagen og DMEM, hurtigt pels wells af diasset kammer (for de fleste applikationer, kammer dias med et antal 1,5 cover-glas er optimal) med kollagen-DMEM blandingen før størkning (200 µL/brønd). Tillad diasset belagt kammer at være stationære ved stuetemperatur i 15 min.
Bemærk: Sammensætning af kollagen-baserede matrix kan ændres ved at tilføje andre ekstracellulære matrix ingredienser, såsom fibronektin eller laminin, efter anvendelsen af eksperiment.
- Forsigtigt afpipetteres 500 µL af medier indeholdende spheroids (eller tumor stykker, hvis primære tumor prøven bruges) fra 6-godt Ultra-Low vedhæftede pladen ind i en tom 1,5 mL microcentrifuge rør. Vente 2 min at lade spheroids bilægge til bunden af røret.
- Fjern forsigtigt supernatanten fra røret. Forberede et andet rør af type-1 kollagen (2 mg/mL) blandes med DMEM som indeholder 10% FBS og hurtigt tilføje 500 µL af denne blanding til spheroids. Forsigtigt blandes spheroids og kollagen ved langsom pipettering.
- Tilføje 250 µL af spheroids/kollagen blanding til et godt af kollagen-pre-belagt kammer dias. Tillad kollagen matrix indeholdende spheroids størkne helt (ca. 30 min ved 37 ° C).
- Når kollagen matrix er størknet, tilsættes 1 mL af DMEM indeholdende 10% FBS til hver brønd (figur 1B). Inkuber diasset kammer i et 37 ° C inkubator leveres med 5% CO2 indtil klar til billedbehandling.
3. levende celle Time-lapse Imaging
- Tænd Konfokal mikroskop efter fabrikantens anvisninger og sikre, at klima kammer når 37 ° C og leveres med 5% CO2.
Bemærk: Vores mikroskop og kammer kræver normalt 1 time at nå system ligevægt. - Omhyggeligt overføre kammer dias til dias adapter knyttet til mikroskop.
- Find spheroids af interesse ved hjælp af et lavt strømforbrug mål (f.eks.5 X) og starte imaging med den højere magt mål (i aktuelle protokol, 20 X mål er anvendt for de fleste af de levende celle tænkelig nemlig dens bedre billedkvalitet).
Bemærk: For primære blære tumor prøver, 5 X og 10 X mål kan være nødvendig for at dække større billeddiagnostiske område. For vores time-lapse imaging, imaging intervallet angives som 30 min og en Z stak bruges til at afbilde den hele klumpformet. Typisk er afstand mellem Z-skiver sat til 4 µm for 20 X mål, og den samlede afstand af Z-akse er omkring 200 µm. billeder kan opnås ved hjælp af DIC og med fluorescens hvis celler/væv harbor fluorescerende protein markører. - Udføre time-lapse imaging for 24-72 h.
Bemærk: Varigheden afhænger af celletype og behovene i eksperimentet.
4. forberedelse af prøven blok der indeholder kræft Spheroids for frossen væv skæring
- Løft forsigtigt blok af kollagen gel og spheroids fra salen dias ved hjælp af små pincet. Placer kollagen gel blok i en plastik histologi skimmel.
- Skyl kollagen gel med 1 x PBS kortvarigt, og derefter løse det med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS i 30 min. ved stuetemperatur.
Forsigtig: PFA er potentiel kræftfremkaldende og skal håndteres med omhu. - Vaske kollagen gel med 1,5 mL 1 x PBS på en shaker i 15 min. Udskift PBS og Gentag de forrige vask trin 3 x.
- Påfør et tyndt lag (ca. 3 mm) for optimal skæring temperatur (OCT) sammensatte til at dække bunden af en ny plast histologi skimmel. Placer den fast og derefter omhyggeligt vaskes kollagen gel på toppen af OLT sammensatte, integrere hele gel ved at udfylde formen med OCT sammensatte samtidig undgå dannelsen af eventuelle luftbobler i OLT.
- Forlade formen ved 4 ° C i 1 time.
- Placer skimmel indeholdende prøve og OCT sammensatte på en 100 mm petriskål flyder på flydende kvælstof. Tillad prøven til flash-fryse helt.
- Gemme den frosne prøve blok ved-80 ° C til fremtidig brug.
5. immunofluorescens tænkelig nemlig frosne sektioneret kræft Spheroids
- Overføre den frosne prøve blok fra-80 ° C fryser til-20 ° C kammer en kryostaten.
-
Udføre konventionelle frosne skæring ved at sætte afsnit intervallet til 7 µm. Lad sektioneret prøver lægger på glas dias uden rynker eller fanget luft.
- Gem dias ved-80 ° C før du udfører yderligere farvning.
Bemærk: Forskellige intervaller kan bruges til at passe eksperimentelle behov.
- Gem dias ved-80 ° C før du udfører yderligere farvning.
- Luft tørre dias i 1 time ved stuetemperatur.
- Permeabilize prøver med PBS, som indeholder 0,5% Triton X-100 for 15 min.
- Vask prøver 3 x med PBS for 10 min pr. vask.
- Omringe prøver på dias med hydrofobe hindringer ved hjælp af en hydrofobe barriere pen.
- Behandle stikprøver med blokerende løsning (1 x PBS indeholdende 5% bovint serumalbumin (BSA)), i 1 time ved stuetemperatur.
- Anvendelse 40 µL af primære antistof-holdige løsning (1 x PBS indeholdende 5% BSA med 1: 100 fortynding af primære antistof) til hver prøve på diaset.
- Glassene inkuberes i primære antistof ved 37 ° C i 1 time eller ved rumtemperatur natten over (inkubationstiden og betingelser varierer afhængigt af primære antistof).
- Vask prøver 3 x med PBS for 15 min (pr. vask).
- Anvendelse 40 µL af sekundær antistof-holdige løsning (1 x PBS indeholdende 5% BSA med 1: 300 sekundær antistof fortynding) til hver prøve på diaset.
- Vask prøver 3 x med PBS for 15 min (pr. vask).
- Pletten prøver med Hoechst 33342 løsning (1 µg/mL, fortyndet i PBS) ved stuetemperatur i 10 min. Derefter vask prøver med PBS i 5 min.
- Montere prøver med montering medium og dække dem med passende størrelse cover underkjoler. Forlade dias i mørke ved stuetemperatur i 24 timer og derefter udføre Konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket skabelse af invasive blære cancer tumor klumpformet kræver dannelsen af passende størrelse tumor spheroids fra cellelinjer eller primære tumorer. Figur 2 A viser korrekt størrelse spheroids udviklet fra fire menneskelige blære cancer cellelinjer (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J og UM-UC18). Figur 2 B viser en tumor klumpformet fra en BBN-genereret mus blære tumor indlejret i kollagen matrix. Disse spheroids var indlejret som beskrevet ovenfor og repræsentative billeder blev fanget ved hjælp af et mikroskop udstyret til levende celle billeddannelse. 20 X mål linsen blev brugt til imaging UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14 og UM-UC18 spheroids, mens musen blære tumor spheroids blev undersøgt ved hjælp af 5 X og 10 X mål linser.
Repræsentative billeder af menneskelige blære celle linje spheroids efter 24-72 timer (fig. 2A) og mus BBN primære blære tumor spheroids (figur 2B) demonstrere blære cancer migration i kollagen matrix. 253J, en non-invasiv cellelinie, forbliver stort set intakt med ringe eller ingen migration (fig. 2A). Videoer 1, 2og 3 demonstrere time-lapse invasion proces for UM-UC9, UM-UC13 og UM-UC14 spheroids, henholdsvis. Video 4 viser egenskaberne invasion af en UM-UC18 klumpformet. Video 5 viser de to områder af musen blære tumor fra 66 h til 87 h efter kollagen indlejring.
For at demonstrere mulighederne for ved hjælp af immunofluorescens farvning af protein markører i vores invasive tumor spheroids, var de faste og farves på 24 eller 72 h. figur 3 viser repræsentative prøver farvet for ataksi Telangiectasia gruppe D-forbundet Protein (ATDC, også kendt som TRIM29), et protein, som spiller en betydelig rolle i tumordannelse og kræft progression af menneskelige blære og pancreascancer9,10, tubulins (α og β), som udgør mikrotubuli og spille en central rolle i udformningen af celler og cellulær bevægelse11,12, keratin 14 (KRT14), en basal epitelial markør involveret i invasionen13og vimentin (VIM), en mesenchymale markør14,15, 16. Disse billeder viser, at visualisering af cellulært og subcellulært strukturer kan udføres ved hjælp af denne metode. Visningen højere forstørrelse af UM-UC14 viser trådformede farvning for ATDC (fig. 3A). Meget invasiv cellerne udbredes fra UM-UC18 spheroids efter 24 h invasion express højt niveau af VIM, en markør for epitel til mesenchymale overgang (EMT, figur 3B).
Integreringen af forskellige celletyper (kræft-associerede fibroblaster) i tumor spheroids er realistisk og giver en måde at undersøge heterolog celle-celle interaktioner (figur 4 og Video 6). I dette eksempel brugte vi røde fluorescens protein (RFP)-mærket humane fibroblaster og 253J blære cancer cell line transduced med en vektor for udtryk for grøn fluorescerende proteiner (NGL). Disse celler blev blandet til form tumor spheroids og indlejret i kollagen. Invasion processen overvåges af Konfokal mikroskopi. Figur 4 viser, at interaktion med fibroblaster kan modulere 253J's invasive adfærd.
Figur 5 viser nytten af assay system til at teste hæmmere af invasionen. Cytochalasin D er en kendt hæmmer af celle migration og invasion, som fungerer ved at blokere actin polymerisering17,18 og blev brugt som et eksempel. Cytochalasin D behandling hæmmede invasionen af UM-UC9 spheroids (figur 5A). Den samme koncentration af cytochalasin D (0,2 µM) er i stand til delvist at hæmme invasion af UM-UC18 spheroids (figur 5B). Da systemet kan bruges til at afbilde flere brønde og tumor organoids parallelt, er det modtagelig for screening et begrænset panel af farmakologiske agenter for effekt på invasion.
Figur 1 : Installationsprogrammet til 3D-invasion assay med levende celle imaging. (A) skematisk oversigt for 3D-levende celle imaging og immunfluorescens. (B) Coverslip kammer med kollagen og medier, der anvendes i dette eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Blære cancer klumpformet invasion. (A) eksempler på menneskelige blære kræft celle linje spheroids indlejret i en kollagen gel matrix. Spheroids er vist på tidspunktet for indlejring (0 h, øverste række) eller efter 72 timer (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J) eller 24 h (UM-UC18). Skalalinjen = 50 µm. (B) eksempler af BBN-induceret mus blære tumor invasion i kollagen matrix. Pilene angiver den invasive kanten af tumor klumpformet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Immunofluorescens analyse af invasive blære cancer spheroids. (A) UM-UC14 tumor klumpformet efter 72 h af invasion ind i kollagen. Prøver var plettet af konventionelle immunofluorescens assay for ATDC (grøn), tubulin (violet) og kerner (Hoechst pletten blå). Hvide firkant angiver området med højere forstørrelse Se vist i nederste række lige to paneler. Skalalinjen = 50 µm. (B) UM-UC18 tumor spheroids farves for KRT14 (grøn), VIM (rød), ATDC (violet) og kerner (Hoechst pletten blå) efter 24 h af invasion ind i kollagen. Skalalinjen = 50 µm. hvid firkant angiver området med højere forstørrelse visning vises i nederste højre panel. Stiplet linje angiver nogenlunde grænsen for den oprindelige tumor klumpformet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Fluorescently-mærket tumor klumpformet indarbejde fibroblaster. Invasion af normal god landbrugspraksis-mærket 253J blære cancerceller alene (bunden paneler) eller co kulturperler med RFP-mærket fibroblaster (top paneler) overvåges for 24 h. skala bar = 50 µm. Invasion er forbedret med tilføjelse af fibroblaster kultur-systemet (toppanelet). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Effekt af en lille Molekylær stof målretning actin polymerisering i invasion. (A) UM-UC9 tumor klumpformet behandlet med cytochalasin D (0,2 µM) eller DMSO (køretøj kontrol) og overvåges for 72 h. b UM-UC18 tumor klumpformet behandlet med cytochalasin D eller DMSO for 24 h. skala bar = 50 µm. stiplet linie angiver grænsen for oprindelige klumpformet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Muligt problem | Anbefalet løsning |
| Lavt antal levedygtige spheroids | • Øge antallet af celler dyrkes i suspension • Sikre > 90% celler er levedygtigt efter typsinization • Check celler for forurening • Opretholde celler i logaritmisk vækst før typsinizing • Optimere celle Kulturmedier • Ændre kultur tid i suspension tilstand • Prøv alternative cellelinjer |
| Spheroids er for stor eller for lille | • Juster antallet af celler føjes til lav vedhæftede plade • Brug blide pipettering for at nedbryde større celle aggregater |
| Svært at fokusere i løbet Forestil | • Justere tykkelsen af kollagen gel. For målene med korte arbejde afstand, forsøge at gøre kollagen gel tyndere. • Sikre, at salen dias eller coverslip er #1.5 • Optimere størrelsen af spheroids (50-150 µm i diameter) |
| Cellerne vandrer ud af zonen imaging under invasionen assay | • Reducere størrelsen af spheroids • Re center zonen imaging hver 24 timer, hvis det er nødvendigt • Engagerende flisebelægning imaging-teknologi (hvis relevant) til at dække større område • Overvej brug af alternative cellelinjer |
| Diasset kammer tørrer ud | • Sikre, at der er ingen lækage i klima kammer setup • Sikre fugt kontrolmekanisme er funktionel |
Tabel 1: Fejlfinding 3D-invasion model.
Video 1: Time-lapse video viser UM-UC9 klumpformet kulturperler i kollagen fra 0 til 72 h. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 2: Time-lapse video viser kollektive overførsel af UM-UC13 klumpformet kulturperler i kollagen fra 0 til 72 h. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 3: Time-lapse video af UM-UC14 klumpformet kulturperler i kollagen fra 0 til 72 h. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 4: Time-lapse video af UM-UC18 klumpformet kulturperler i kollagen fra 0 til 24 h. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 5: Time-lapse video af BBN-induceret mus blære tumorer 66–84 h efter kollagen embedding. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 6: Time-lapse video viser kræft spheroids dannet fra normal god landbrugspraksis-mærket 253J celler blandet med RFP-mærket humane fibroblaster (til venstre) eller normal god landbrugspraksis-mærket 253J celler alene (højre). Spheroids blev integreret i kollagen og overvåges for 24 h. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en 3D-tumor klumpformet model, der giver mulighed for real-time observation af blære kræft invasion, som er kritiske for kræft progression og metastaser. Dette system er indstillet til inddragelsen af forskellige stromale og cellulære komponenter at tillade efterforskere at bedre sammenfatte væv mikromiljø hvor blære cancer invasion finder sted. Blære cancer spheroids kan genereres fra forskellige kilder såsom cellelinjer (herunder genetisk modificerede cellelinjer nyttige for undersøgelsen af signalering veje, der påvirker invasion processer), og musen primære tumorer (beskrevet her). Det kan potentielt også tilpasses for menneskelig primær tumor analyse. Afhængigt af imaging system anvendes, kan fluorescens overvåges i realtid eller af fiksering og immunfluorescens farvning på forskellige tidspunkter. Systemet kan også bruges til at teste potentielle hæmmere af invasionen. Dette gør systemet et alsidigt og kraftfuldt værktøj til at vurdere blære cancer biologi.
Konfokal mikroskopi system med et klima kammer, som giver temperaturkontrol, fugt kontrol og CO2 levering er et afgørende stykke udstyr til at konstruere modellen beskrevet i denne protokol.
Det har været almindeligt rapporterede, at 3D-kulturer giver specialiserede microenvironments, som bedre efterligne indfødte væv for celle biologi og kræft undersøgelser19,20. Mange undersøgelser stole på permeabel membran Indsæt assays, der ikke afspejler de betingelser, under hvilke invasion opstår i vivo. Yderligere, disse konventionelle undersøgelser tillader hverken nem overvågning af invasion processen i en real-time mode, eller detaljeret analyse af prøver under eller følgende invasion. Heri vi beskrevet et system, som er nyttige for både real-time og slutpunkt forhør af invasiv cancer biologi.
Kollagen er en vigtig del af den ekstra cellulære matrix (ECM), og findes i mange former. Type-1 kollagen er den fremherskende form af fibrillar kollagen Type-4 kollagen er en nonfibrillar kollagen udgør basalmembranen21. Kræftceller skal trænge basalmembranen og bevæge sig gennem type 1 kollagen under progression fra non-invasiv til invasive tumorer22. Givet sin allestedsnærværende tilstedeværelse i ECM, er type 1 kollagen blevet brugt som matrix til at konstruere 3D-kulturer, som efterligner ECM bedre end to-dimensionelle kultur fad5,6,23. Mens systemet beskrevet her er baseret på en type-1 kollagen matrix, det kan ændres til at omfatte andre stromale bestanddele baseret på eksperimentel spørgsmål og har brug for.
Den metode, vi bruger til at generere blære cancer spheroids fra cellelinjer indebærer cellekultur i low-attachment betingelser og celle sammenlægning. Ikke alle celler kan tåle disse dyrkningsbetingelserne og nogle kan undergå apoptose eller dannelsen af løs aggregeringer, der tager afstand under kollagen indlejring proces. Ændre kultur tid, kan cellulære antallet eller indarbejde andre celletyper i suspension forbedre resultatet. Cellelinjer udvalgt til dette assay afhænge af målet med forsøget. Vi har med succes brugt denne teknik med 7/7 enestående menneskelige blære cancer cellelinjer. Det er imidlertid muligt, at nogle cellelinjer ikke kan være egnet til denne eksperimentelle opsætning. Desuden, nogle cellelinjer har en meget invasiv fænotype, hvilket fører til tidlig afstandtagen spheroids og kræftceller bevæger sig ud af området observation under time-lapse eksperimentet. Pilotforsøg for at forstå cellelinjer generelle adfærd er stærkt anbefales at bestemme de bedste tidsrammer for undersøgelser. Fejlfinding af almindelige problemer med klumpformet generation og billedbehandling er angivet i tabel 1.
Dette system er velegnet til begrænset screening af farmakologiske forbindelser med potentiale til at blokere kræft celle invasion. Heri brugte vi Cytochalasin D, en celle-gennemtrængelige hæmmer af actin polymerisering, til at illustrere denne potentielle anvendelse18. Som vist ovenfor, hæmmer 0,2 µM af cytochalasin D effektivt invasionen af UM-UC9 og UM-UC18 spheroids. Ved at udnytte multi kamre lysbilleder og automatiserede mikroskopiske fase kontrol, er effekten af flere forbindelser på tumor klumpformet invasion mulig.
Selv om disse assays er bedst egnet til kvalitativt beskriver invasive opførsel, er kvantificering af omfanget af migration og invasion også muligt. Erhvervelse af billeder af spheroids i begyndelsen af eksperimentet og på forskellige tidspunkter, og efterfølgende billede analyse til at måle den længst lineær afstand af invasionen i X, Y eller Z retninger kan give kvantificering af invasive vandrende adfærd. Mere avancerede billede analyse brug fluorescently mærkede celler kunne bruges til at definere og kvantificere enkelte celle eller celle type adfærd afhængig af eksperimentelle behov eller spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Howard Crawford (University of Michigan) laboratoriet for teknisk support og leverer materialer og udstyr til denne undersøgelse, og Alan Kelleher for teknisk support.
Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra University of Michigan Rogel kræft Center kerne Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BKAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M.
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M.
