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Cancer Research

3-डी सेल संस्कृति प्रणाली आक्रमण अध्ययन और मूत्राशय कैंसर में चिकित्सकीय मूल्यांकन के लिए

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58345
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Departments of Internal Medicine, Hematology/Oncology Division, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 2Department of Urology, Division of GU Oncology, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 3Departments of Surgery and Pathology, Perlmutter Cancer Center, NYU Langone Health

Summary

मूत्राशय कैंसर के आक्रमण शासी प्रक्रियाओं के लिए अवसरों का प्रतिनिधित्व करते है और चिकित्सकीय उपचारात्मक विकास । यहां हम एक मूत्राशय कैंसर आक्रमण मॉडल जो ट्यूमर spheroids, समय चूक इमेजिंग और फोकल माइक्रोस्कोप की 3 डी संस्कृति को शामिल वर्तमान । इस तकनीक इनवेसिव प्रक्रिया की सुविधाओं को परिभाषित करने के लिए और चिकित्सकीय एजेंटों स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है ।

Abstract

मूत्राशय कैंसर एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य समस्या है । यह अनुमान है कि अधिक से अधिक १६,००० लोगों को इस साल मर जाएगा संयुक्त राज्य अमेरिका में मूत्राशय कैंसर से । जबकि मूत्राशय कैंसर के ७५% गैर इनवेसिव और metastasize के लिए संभावना नहीं है, एक इनवेसिव विकास पैटर्न के बारे में 25% प्रगति । आक्रामक कैंसर के साथ रोगियों के आधे तक घातक मेटास्टेटिक पतन का विकास होगा । इस प्रकार, मूत्राशय के कैंसर में इनवेसिव प्रगति के तंत्र को समझने रोगी परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण है और घातक मेटास्टेसिस को रोकने के । इस अनुच्छेद में, हम एक त्रि-आयामी कैंसर आक्रमण मॉडल प्रस्तुत करते हैं जो ट्यूमर कोशिकाओं और stromal घटकों को शामिल करने के लिए vivo मूत्राशय ट्यूमर microenvironment में होने वाली स्थितियों में नकल करने की अनुमति देता है । इस मॉडल समय चूक इमेजिंग का उपयोग कर वास्तविक समय में इनवेसिव प्रक्रिया का पालन करने का अवसर प्रदान करता है, आणविक मार्ग आक्रमण ब्लॉक करने के लिए क्षमता के साथ फोकल immunofluorescent इमेजिंग और स्क्रीन यौगिकों का उपयोग शामिल पूछताछ. हालांकि इस प्रोटोकॉल मूत्राशय कैंसर पर केंद्रित है, यह संभावना है कि इसी तरह के तरीकों के लिए अंय ट्यूमर प्रकार में आक्रमण और गतिशीलता की जांच के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

आक्रमण कैंसर प्रगति में एक महत्वपूर्ण कदम है, जो मेटास्टेसिस के लिए आवश्यक है, और कम जीवित रहने और रोगियों में गरीब रोग का निदान के साथ जुड़ा हुआ है । मानव मूत्राशय के कैंसर में, जो दुनिया भर में प्रति वर्ष १६५,००० मौतों के बारे में कारण बनता है मूत्र पथ का सबसे आम द्रोह, कैंसर चरण, उपचार और रोग का निदान सीधे उपस्थिति या1आक्रमण की अनुपस्थिति से संबंधित हैं । मूत्राशय कैंसर के मामलों के ७५% के आसपास गैर मांसपेशी इनवेसिव रहे है और स्थानीय लकीर के साथ प्रबंधित कर रहे हैं । इसके विपरीत, स्नायु-इनवेसिव मूत्राशय कैंसर (सभी मामलों के बारे में 25%) उच्च मेटास्टेटिक दरों के साथ आक्रामक ट्यूमर हैं और आक्रामक multimodality थेरेपी2,3के साथ इलाज कर रहे हैं । इसलिए, आणविक रास्ते को समझने कि आक्रमण ट्रिगर बेहतर इनवेसिव प्रगति के जोखिम को चिह्नित करने के लिए और चिकित्सकीय हस्तक्षेप जो आक्रामक प्रगति को रोकने कर सकते हैं विकसित करने के लिए आवश्यक है ।

ट्यूमर इनवेसिव प्रगति एक जटिल तीन आयामी (3 डी) वातावरण में होता है और अन्य ट्यूमर कोशिकाओं, स्ट्रोमा, तहखाने झिल्ली, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं, fibroblasts, मांसपेशी कोशिकाओं और संवहनी सहित कोशिकाओं के अन्य प्रकार के साथ ट्यूमर सेल बातचीत शामिल है endothelial कक्ष । पारगंय समर्थन (जैसे, Transwell) परख प्रणालियों सामांयतः quantitate कैंसर सेल4आक्रमण करने के लिए कार्यरत हैं, लेकिन इन प्रणालियों सीमित है क्योंकि वे वास्तविक समय में आक्रमण की प्रक्रिया की सूक्ष्म निगरानी की अनुमति नहीं है और आगे धुंधला और आणविक विश्लेषण के लिए नमूनों की पुनर्प्राप्ति चुनौतीपूर्ण है । एक 3-डी मूत्राशय ट्यूमर अंडाकार आकृति प्रणाली के विकास के आक्रमण का अध्ययन वांछनीय है क्योंकि यह इन विट्रो प्रणालियों में की सुविधा के साथ परिभाषित microenvironmental घटकों के शामिल करने की अनुमति देता है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम एक प्रणाली का वर्णन करने के लिए मानव मूत्राशय कैंसर एक 3-डी अंडाकार आकृति आक्रमण परख कोलेजन शामिल का उपयोग कर कोशिकाओं के इनवेसिव प्रक्रियाओं पूछताछ आधारित जेल मैट्रिक्स और फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए जांचकर्ताओं को सेल गतिशीलता पर नजर रखने की अनुमति और वास्तविक समय में आक्रमण (चित्रा 1ए) । इस प्रणाली बहुमुखी है और विभिन्न stromal/ट्यूमर सेटिंग्स पूछताछ करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । यह सबसे मूत्राशय कैंसर कोशिका लाइनों या प्राथमिक मूत्राशय ट्यूमर और अतिरिक्त stromal कोशिकाओं को शामिल कर सकते है जैसे कैंसर से जुड़े fibroblasts और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को5,6,7। इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक प्रकार से बना मैट्रिक्स-1 कोलेजन, लेकिन ऐसे fibronectin, laminin, या अंय कोलेजन प्रोटीन के रूप में अंय अणुओं को शामिल संशोधित किया जा सकता है । इनवेसिव प्रक्रियाओं के लिए पीछा किया जा सकता है ७२ ज या अब माइक्रोस्कोप और प्रणाली का इस्तेमाल किया की क्षमता पर निर्भर करता है । निर्धारण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस 3 में एंबेडेड ट्यूमर के दाग-डी मैट्रिक्स से पहले, के दौरान, और उसके बाद आक्रमण की अनुमति देता है प्रोटीन की पूछताछ इनवेसिव कोशिकाओं में विनियमित, इस प्रकार महत्वपूर्ण जानकारी है कि आम तौर पर अनुपस्थित या इकट्ठा करने के लिए मुश्किल प्रदान अंय 3-डी संस्कृति मॉडल का उपयोग करना । इस प्रणाली को भी स्क्रीन यौगिकों जो आक्रमण ब्लॉक करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, और संकेत चित्रित ऐसे यौगिकों से प्रभावित रास्ते ।

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Protocol

1. बढ़ रहा है कैंसर Spheroids

  1. सेल लाइनों से बढ़ रहा है
    1. संस्कृति मानव मूत्राशय कैंसर की कोशिकाओं के तहत पारंपरिक अनुयाई सेल संस्कृति की स्थिति और बनाए रखने में एक ३७ ° c मशीन 5% CO2के साथ आपूर्ति की । कक्ष को < 90% पर प्रवाहित बनाए रखें ।
      नोट: संस्कृति मीडिया का इस्तेमाल किया है Dulbecco संशोधित ंयूनतम आवश्यक मीडिया (DMEM) युक्त ४.५ g/l D-ग्लूकोज, l-Glutamine, ११० mg/l सोडियम पाइरूवेट, और इस प्रोटोकॉल में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ आपूर्ति की ।
    2. प्रयोग की शुरुआत करने से पहले एक दिन, trypsinize (०.२५% Trypsin-EDTA) कोशिकाओं का उपयोग करके, कोशिका एकाग्रता को बढ़ाता है और एक 6-well अल्ट्रा कम लगाव प्लेट के प्रत्येक कुआं में 3 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया में 1 x 106 कोशिकाओं को वितरित ।
    3. ≥ 16 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कम लगाव की स्थिति में कोशिकाओं की मशीन । यह सबसे मूत्राशय कैंसर सेल लाइनों के लिए spheroids में समग्र करने के लिए कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय की अनुमति चाहिए ।
      नोट: spheroids के गठन औंधा उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप द्वारा मनाया जा सकता है । इष्टतम आकार और spheroids की संख्या व्यक्तिगत प्रयोगों पर निर्भर हो सकता है, लेकिन हम पाते है कि spheroids ५० µm से १५० µm के लिए व्यास के साथ एक 20X उद्देश्य लेंस का उपयोग कर समय चूक इमेजिंग के लिए आम तौर पर उपयुक्त हैं ।
    4. इस तरह के fibroblasts या spheroids में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में अतिरिक्त सेल प्रकार, शामिल करने के लिए, एक अल्ट्रा कम लगाव प्लेट में वांछित अनुपात (1:1, 1:10, आदि) में कैंसर कोशिकाओं के साथ वांछित कोशिकाओं को मिश्रण और ≥ 16 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के गठन की अनुमति के लिए मिश्रित कक्ष प्रकार spheroids ।
  2. प्राथमिक ट्यूमर से बढ़ रही है
    नोट: ट्यूमर spheroids भी प्राथमिक मूत्राशय ट्यूमर स्रोतों से जैसे कि कैंसर प्रेरित मूत्राशय ट्यूमर मॉडल8से विकसित ट्यूमर के रूप में व्युत्पंन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, मूत्राशय ट्यूमर n-butyl-n-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN) के साथ खिलाया चूहों से उत्पंन, काटा जा सकता है और छोटे टुकड़ों में कीमा बनाया हुआ (के बारे में ०.५ mm3) बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग कर । मानव मूत्राशय के कैंसर के पचा प्राथमिक नमूनों को भी इस प्रणाली में अध्ययन किया जा सकता है ।
    1. लीजिए और 5 मिलीलीटर बर्फ ठंडा फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) में ०.५ mm3 ट्यूमर टुकड़े धो लो । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक । इस वाशिंग स्टेप को एक बार दोहराएं ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा ट्यूमर टुकड़े इकट्ठा । supernatant निकालें और 10% FBS युक्त DMEM के 5 मिलीलीटर जोड़ें । स्थानांतरण ट्यूमर अंडाकार आकृति/मीडिया मिश्रण करने के लिए एक 6-अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेट । ≥ के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी कोलेजन मैट्रिक्स में एंबेडिंग से पहले 16 एच (२.३ कदम देखें) ।

2.3 डी संस्कृति चैंबर की तैयारी

  1. पतला प्रकार-1 कोलेजन (चूहे की पूंछ से व्युत्पंन) DMEM में 10% FBS युक्त निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक 2 मिलीग्राम/एमएल मिश्रण करने के लिए ।
    1. संक्षेप में, 1 N NaOH समाधान और कोमल pipetting द्वारा DMEM के उपयुक्त राशि के साथ मिश्रण कोलेजन निर्माता के निर्देश पर आधारित शारीरिक पीएच प्राप्त करने के लिए ।
    2. मिश्रण कोलेजन और DMEM के बाद, जल्दी से चैंबर स्लाइड के कुओं (सबसे अनुप्रयोगों के लिए, एक नंबर के साथ चैंबर स्लाइड १.५ आवरण-कांच इष्टतम है) कोलेजन के साथ DMEM मिश्रण से पहले solidification (२०० µ l/ लेपित चैंबर स्लाइड 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर होने की अनुमति दें ।
      नोट: कोलेजन की रचना-मैट्रिक्स आधारित अंय extracellular मैट्रिक्स सामग्री, जैसे fibronectin या laminin, प्रयोग के प्रयोजनों के अनुसार जोड़ने के द्वारा संशोधित किया जा सकता है ।
  2. धीरे प्लास्टिक ५०० spheroids युक्त मीडिया के µ एल (या ट्यूमर के टुकड़े, यदि प्राथमिक ट्यूमर नमूना प्रयोग किया जाता है) से 6-well अल्ट्रा कम लगाव प्लेट एक खाली १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में । 2 मिनट के लिए रुको spheroids ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए ।
  3. ध्यान से supernatant को ट्यूब से हटा दें । प्रकार के एक और ट्यूब तैयार-1 कोलेजन (2 मिलीग्राम/एमएल) 10% FBS युक्त DMEM के साथ मिश्रित और जल्दी से इस मिश्रण के ५०० µ एल जोड़ने के लिए spheroids । धीरे धीमी pipetting द्वारा spheroids और कोलेजन मिश्रण ।
  4. जोड़ें २५० µ spheroids के एल/कोलेजन मिश्रण के लिए एक अच्छी तरह से कोलेजन-पूर्व लेपित चैंबर स्लाइड । spheroids युक्त कोलेजन मैट्रिक्स को पूरी तरह से जमना (३७ डिग्री सेल्सियस पर लगभग 30 मिनट) की अनुमति दें ।
  5. के बाद कोलेजन मैट्रिक्स जम जाता है, एक अच्छी तरह से 10% FBS युक्त DMEM के 1 मिलीलीटर जोड़ें (चित्रा 1बी) । एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में चैंबर स्लाइड मशीन इमेजिंग के लिए तैयार जब तक 5% सह2 के साथ आपूर्ति की ।

3. लाइव सेल समय-चूक इमेजिंग

  1. निर्माता के निर्देशों के बाद फोकल माइक्रोस्कोप पर मुड़ें और सुनिश्चित करें कि जलवायु चैंबर ३७ डिग्री सेल्सियस तक पहुंचता है और 5% सह2के साथ आपूर्ति की है ।
    नोट: हमारे माइक्रोस्कोप और चैंबर आमतौर पर सिस्टम संतुलन तक पहुंचने के लिए 1 h की आवश्यकता होती है ।
  2. सावधानीपूर्वक कक्ष स्लाइड को माइक्रोस्कोप से अनुलग्न स्लाइड एडेप्टर पर स्थानांतरित करें ।
  3. कम पावर उद्देश्य (उदा., 5x) का उपयोग करके रुचि के spheroids का पता लगाएँ और उच्च शक्ति उद्देश्य के साथ इमेजिंग प्रारंभ करें (वर्तमान प्रोटोकॉल में, 20X उद्देश्य अपनी बेहतर छवि गुणवत्ता के लिए लाइव सेल इमेजिंग के अधिकांश के लिए उपयोग किया जाता है) ।
    नोट: प्राथमिक मूत्राशय ट्यूमर के नमूनों के लिए, 5x और 10x उद्देश्यों के क्रम में बड़ा इमेजिंग क्षेत्र को कवर करने की जरूरत हो सकती है । हमारे समय चूक इमेजिंग के लिए, इमेजिंग अंतराल 30 मिनट के रूप में सेट और एक जेड ढेर पूरे अंडाकार आकृति छवि के लिए प्रयोग किया जाता है । आमतौर पर z-स्लाइस के बीच की दूरी 20X उद्देश्य के लिए 4 µm के लिए सेट है, और z अक्ष की कुल दूरी २०० µm के आस-पास है । छवियां और प्रतिदीप्ति के साथ डिक का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है अगर कोशिकाओं/
  4. 24 के लिए समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन-72 एच ।
    नोट: अवधि कक्ष प्रकार और प्रयोग की आवश्यकताओं द्वारा निर्धारित की जाती है ।

4. जमे हुए ऊतक अनुभाग के लिए कैंसर Spheroids युक्त नमूना ब्लॉक की तैयारी

  1. ध्यान से छोटे संदंश का उपयोग करके कक्ष स्लाइड से कोलेजन जेल और spheroids के ब्लॉक उठा । एक प्लास्टिक प्रोटोकॉल मोल्ड में कोलेजन जेल ब्लॉक प्लेस ।
  2. कुल्ला 1x पंजाबियों के साथ कोलेजन जेल संक्षेप में, और फिर यह 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ पंजाब में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ठीक है ।
    सावधानी: पीएफए संभावित यलो है और इसकी देखभाल के साथ हैंडल किया जाना चाहिए ।
  3. 15 मिनट के लिए एक शेखर पर 1x पंजाबियों के १.५ मिलीलीटर के साथ कोलेजन जेल धो लो । पंजाबियों की जगह और पिछले वाशिंग चरण 3x दोहराने ।
  4. लागू एक पतली परत (के बारे में 3 मिमी) इष्टतम काटने के तापमान (OCT) के लिए एक नया प्लास्टिक प्रोटोकॉल मोल्ड के नीचे कवर यौगिक । अक्टूबर यौगिक के शीर्ष पर फिक्स्ड और धोया कोलेजन जेल प्लेस, तो ध्यान से अक्टूबर यौगिक के साथ मोल्ड भरने के द्वारा पूरे जेल एंबेड जबकि oct में किसी भी हवा के बुलबुले के गठन से परहेज ।
  5. 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मोल्ड छोड़ दें ।
  6. नमूना युक्त मोल्ड प्लेस और एक १०० mm पेट्री तरल नाइट्रोजन पर तैर पकवान पर अक्टूबर यौगिक । पूरी तरह से फ्लैश-फ्रीज करने के लिए नमूना की अनुमति दें ।
  7. भविष्य में उपयोग के लिए-८० ° c पर जमे हुए नमूना ब्लॉक की दुकान ।

5. जमे हुए खोदी गई कैंसर Spheroids के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग

  1. एक cryostat के-20 ° c चैंबर के लिए-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से जमे हुए नमूना ब्लॉक स्थानांतरण ।
  2. 7 µm के लिए खंड अंतराल की स्थापना करके पारंपरिक जमे हुए अनुभाग प्रदर्शन । खोदी गई नमूनों को बिना झुर्री या फँसे हवा के काँच की स्लाइड में देते हैं.
    1. आगे धुंधला प्रदर्शन करने से पहले-८० ° c पर स्लाइड की दुकान ।
      नोट: अलग अंतराल प्रयोगात्मक जरूरतों फिट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. हवा 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड शुष्क ।
  4. 15 मिनट के लिए ०.५% ट्राइटन X-१०० युक्त पंजाबियों के साथ नमूनों Permeabilize ।
  5. धो के नमूने 3x 10 मिनट प्रति धो के लिए पंजाबियों के साथ ।
  6. एक hydrophobic बाधा पेन का उपयोग करके hydrophobic बाधाओं के साथ स्लाइड पर नमूने घेरना ।
  7. समाधान अवरुद्ध के साथ नमूनों का इलाज (1x 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) युक्त), कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान के ४० µ एल लागू करें (1x पंजाबन प्राथमिक एंटीबॉडी के 1:100 कमजोर पड़ने के साथ 5% BSA युक्त) स्लाइड पर प्रत्येक नमूने के लिए ।
  9. ३७ ° c में 1 घंटे के लिए या कमरे के तापमान पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी में स्लाइड गर्मी (मशीन समय और शर्तों प्राथमिक एंटीबॉडी के आधार पर बदलती हैं) ।
  10. 15 मिनट (प्रति वाश) के लिए पंजाब के साथ 3x नमूनों को धो लें ।
  11. ४० माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान के µ एल लागू (1x पंजाब 1:300 माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के साथ BSA के 5% युक्त) स्लाइड पर प्रत्येक नमूने के लिए ।
  12. 15 मिनट (प्रति वाश) के लिए पंजाब के साथ 3x नमूनों को धो लें ।
  13. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर Hoechst ३३३४२ समाधान (1 µ g/एमएल, पंजाब में पतला) के साथ नमूने दाग । फिर 5 मिनट के लिए पंजाबियों के साथ नमूनों को धो लें ।
  14. बढ़ते माध्यम के साथ नमूने माउंट और उंहें कवर उचित आकार के साथ कवर फिसल जाता है । 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में स्लाइड छोड़ दो और फिर फोकल माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन ।

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Representative Results

इनवेसिव मूत्राशय कैंसर ट्यूमर के सफल निर्माण अंडाकार आकृति कोशिका लाइनों या प्राथमिक ट्यूमर से उचित आकार ट्यूमर spheroids के गठन की आवश्यकता है । चित्रा 2 एक दिखाता है उचित आकार चार मानव मूत्राशय कैंसर सेल लाइनों से विकसित spheroids (उम-UC9, उम-UC13, उम-UC14, 253J, और उम-UC18) । चित्रा 2 बी एक BBN से एक ट्यूमर अंडाकार आकृति से पता चलता है-माउस मूत्राशय कोलेजन मैट्रिक्स में एंबेडेड ट्यूमर जनित । इन spheroids ऊपर वर्णित है और प्रतिनिधि छवियों के रूप में एंबेडेड थे एक खुर्दबीन लाइव सेल इमेजिंग के लिए सुसज्जित का उपयोग कर कब्जा कर लिया । 20X उद्देश्य लेंस का उपयोग इमेजिंग UM-UC9, um-UC13, um-UC14 और um-UC18 spheroids के लिए किया गया था, जबकि माउस ब्लैडर ट्यूमर spheroids 5x और 10x उद्देश्य लेंसों का उपयोग करके जांचा गया ।

मानव मूत्राशय सेल लाइन spheroids के प्रतिनिधि छवियां 24 के बाद-72 ज (चित्रा 2ए) और माउस BBN प्राथमिक मूत्राशय ट्यूमर spheroids (चित्रा 2ख) कोलेजन मैट्रिक्स में मूत्राशय कैंसर प्रवास का प्रदर्शन । 253J, एक गैर इनवेसिव सेल लाइन, कम या नहीं प्रवास (चित्रा 2ए) के साथ काफी हद तक बरकरार रहते हैं । वीडियो 1, 2और 3 , क्रमशः um-UC9, um-UC13, और um-UC14 spheroids के लिए समय-चूक आक्रमण प्रक्रिया प्रदर्शित करता है । 4 वीडियो एक उम के आक्रमण गुण-UC18 अंडाकार आकृति से पता चलता है । 5 वीडियो माउस मूत्राशय ट्यूमर के दो क्षेत्रों से पता चलता है ६६ h से ८७ h पद कोलेजन embedding ।

हमारे इनवेसिव ट्यूमर spheroids में प्रोटीन मार्करों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग करने की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करने के लिए, वे तय किए गए थे और दाग 24 या ७२ ज. चित्रा 3 से पता चलता है प्रतिनिधि नमूने गतिभंग-Telangiectasia समूह के लिए सना हुआ D-एसोसिएटेड प्रोटीन (ATDC, भी TRIM29 के रूप में जाना जाता है), एक प्रोटीन जो मानव मूत्राशय और अग्नाशय के कैंसर के tumorigenesis और कैंसर की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है9,10, tubulins (α और β), जो फार्म microtubules और सेल और सेलुलर आंदोलन11,12, केरातिन 14 (KRT14), एक बेसल उपकला13आक्रमण में शामिल मार्कर को आकार देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और vimentin (विम), एक mesenchymal मार्कर14,15, 16. इन छवियों को प्रदर्शित करता है कि सेलुलर और सेलुलर संरचनाओं के दृश्य इस पद्धति का उपयोग किया जा सकता है । UM-UC14 का उच्च आवर्धन दृश्य ATDC (चित्रा 3A) के लिए रेशा धुंधला दिखाता है । अत्यधिक इनवेसिव UM से प्रसार कोशिकाओं-UC18 spheroids आक्रमण एक्सप्रेस के 24 घंटे के बाद शक्ति का उच्च स्तर, उपकला के लिए mesenchymal संक्रमण (EMT, चित्रा 3बी) के एक मार्कर ।

ट्यूमर spheroids में विभिन्न कोशिका प्रकार (कैंसर से जुड़े fibroblasts) का शामिल करना संभव है और heterologous सेल-सेल इंटरैक्शन (चित्रा 4 और वीडियो 6) की जांच करने का एक तरीका प्रदान करता है. इस उदाहरण में हम लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन (आरएफपी) का इस्तेमाल किया-मानव fibroblasts लेबल और 253J मूत्राशय कैंसर सेल लाइन ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (transduced) की अभिव्यक्ति के लिए एक सदिश के साथ GFP । इन कोशिकाओं को ट्यूमर spheroids फार्म और कोलेजन में एंबेडेड मिश्रित थे । आक्रमण की प्रक्रिया फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा निगरानी की । चित्रा 4 को दर्शाता है कि fibroblasts के साथ बातचीत 253J's इनवेसिव व्यवहार मिलाना कर सकते हैं ।

चित्रा 5 परख प्रणाली की उपयोगिता को दर्शाता है कि आक्रमण के अवरोधकों परीक्षण । Cytochalasin डी सेल प्रवास और आक्रमण के एक ज्ञात अवरोधक जो actin बहुलकीकरण17,18 अवरुद्ध द्वारा कार्य करता है और एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है । Cytochalasin डी उपचार उम के आक्रमण को बाधित-UC9 spheroids (चित्रा 5ए) । cytochalasin डी (०.२ µ मीटर) की ही एकाग्रता आंशिक रूप से उम के आक्रमण को बाधित करने में सक्षम है-UC18 spheroids (चित्रा 5बी). के बाद से प्रणाली कई कुओं और समानांतर में ट्यूमर organoids छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह आक्रमण पर प्रभाव के लिए औषधीय एजेंटों की एक सीमित पैनल स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदाई है ।

Figure 1
चित्रा 1 : लाइव सेल इमेजिंग के साथ 3 डी आक्रमण परख के लिए सेटअप । (A) 3-डी लाइव सेल इमेजिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए योजनाबद्ध अवलोकन. (ख) इस प्रयोग में प्रयुक्त कोलेजन और मीडिया के साथ Coverslip चैंबर. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : मूत्राशय कैंसर अंडाकार आकृति आक्रमण । (क) मानव मूत्राशय कैंसर कोशिका लाइन spheroids एक कोलेजन जेल मैट्रिक्स में एंबेडेड के उदाहरण । Spheroids (0 h, शीर्ष पंक्ति) एंबेडिंग के समय या ७२ h के बाद दिखाए जाते है (um-UC9, um-UC13, um-UC14, 253J) या 24 h (um-UC18) । स्केल बार = ५० µm. (ख) कोलेजन मैट्रिक्स में BBN-प्रेरित माउस मूत्राशय ट्यूमर आक्रमण के उदाहरण । तीर ट्यूमर अंडाकार आकृति के इनवेसिव किनारे से संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : इनवेसिव मूत्राशय कैंसर spheroids के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण । (क) उम-UC14 ट्यूमर अंडाकार आकृति के बाद ७२ कोलेजन में आक्रमण के एच । नमूनों ATDC (हरा), tubulin (बैंगनी), और नाभिक (Hoechst दाग नीला) के लिए पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख द्वारा दाग थे । सफेद वर्ग नीचे पंक्ति सही दो पैनलों में दिखाया गया उच्च आवर्धन दृश्य के साथ क्षेत्र को इंगित करता है । स्केल बार = ५० µm. (ख) उम-UC18 ट्यूमर spheroids के लिए दाग KRT14 (हरा), विम (लाल), ATDC (बैंगनी), और नाभिक (Hoechst दाग नीला) के बाद 24 कोलेजन में आक्रमण के एच । स्केल बार = ५० µm. White स्क्वायर नीचे दाएं फलक में दिखाए गए उच्च आवर्धन दृश्य के साथ क्षेत्र को इंगित करता है । डैश्ड रेखा मोटे तौर पर मूल ट्यूमर अंडाकार आकृति की सीमा को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : फ्लोरोसेंट-लेबल ट्यूमर अंडाकार आकृति शामिल fibroblasts । GFP के आक्रमण-लेबल 253J मूत्राशय कैंसर अकेले कोशिकाओं (नीचे पैनलों) या सह आरएफपी के साथ संस्कृति-लेबल fibroblasts (शीर्ष पैनलों) 24 घंटे के लिए निगरानी = ५० µm. आक्रमण संस्कृति प्रणाली (शीर्ष पैनल) के लिए fibroblasts के अलावा के साथ बढ़ाया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : आक्रमण में एक छोटी सी आणविक औषध लक्ष्यीकरण actin बहुलकीकरण का प्रभाव. (क) उम-UC9 ट्यूमर अंडाकार आकृति cytochalasin डी (०.२ µ एम) या DMSO (वाहन नियंत्रण) के साथ इलाज किया और ७२ एच के लिए निगरानी की । (ख) उम-UC18 ट्यूमर अंडाकार आकृति इलाज cytochalasin डी या DMSO के लिए 24 ज. स्केल बार = ५० µM. डैश्ड रेखा मूल की सीमा को इंगित करता है अंडाकार आकृति. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

संभावित समस्या अनुशंसित समाधान
व्यवहार्य spheroids की कम संख्या • निलंबन में प्रसंस्कृत कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि
• सुनिश्चित करें > 90% कोशिकाओं typsinization के बाद व्यवहार्य हैं
• प्रदूषित करने के लिए कोशिकाओं की जांच
• typsinizing से पहले लघुगणकीय विकास में कोशिकाओं को बनाए रखें
• अनुकूलन सेल संस्कृति मीडिया
• निलंबन की स्थिति में संस्कृति समय को संशोधित
• वैकल्पिक सेल लाइनों का प्रयास करें
Spheroids बहुत बड़े या बहुत छोटे हैं • कम लगाव प्लेट को जोड़ा कोशिकाओं की संख्या को समायोजित
• बड़ा सेल समुच्चय को तोड़ने के लिए कोमल pipetting का प्रयोग करें
कल्पना के दौरान ध्यान देना मुश्किल • कोलेजन जेल की मोटाई को समायोजित करें । कम काम दूरी के साथ उद्देश्यों के लिए, कोलेजन जेल पतले बनाने की कोशिश करो ।
• यह सुनिश्चित करें कि चैंबर स्लाइड या coverslip #1 .5
• spheroids के आकार का अनुकूलन (50 – व्यास में 150 µm)
कोशिकाओं आक्रमण परख के दौरान इमेजिंग क्षेत्र से बाहर पलायन • spheroids का आकार कम करें
• पुन: इमेजिंग क्षेत्र हर 24 एच अगर जरूरत केंद्र
• उलझाने टाइलिंग इमेजिंग प्रौद्योगिकी (यदि लागू हो) बड़े क्षेत्र को कवर करने के लिए
• वैकल्पिक सेल लाइनों के उपयोग पर विचार
चैंबर स्लाइड बाहर सूख जाता है • सुनिश्चित करें कि जलवायु चैंबर सेटअप में कोई रिसाव नहीं है
• सुनिश्चित करें कि नमी नियंत्रण तंत्र कार्यात्मक है

तालिका 1:3-डी आक्रमण मॉडल समस्या निवारण ।

Movie 1
वीडियो 1: टाइम-चूक वीडियो दिखा रहा है उम-UC9 अंडाकार आकृति से कोलेजन में कल्चरित 0 ७२ ज । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
2 वीडियो: समय चूक उम के सामूहिक प्रवास-UC13 अंडाकार आकृति 0 से ७२ ज कोलेजन में संस्कृति दिखा वीडियो । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 3
3 वीडियो: समय चूक उम के वीडियो-UC14 कोलेजन में अंडाकार आकृति 0 से ७२ ज । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 4
4 वीडियो: समय चूक उम के वीडियो-UC18 अंडाकार आकृति में संस्कृति से कोलेजन 0 से 24 ज । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 5
5 वीडियो: BBN-प्रेरित माउस मूत्राशय ट्यूमर की समय चूक वीडियो ६६-८४ एच के बाद कोलेजन embedding । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 6
6 वीडियो: समय चूक वीडियो दिखा कैंसर spheroids GFP से गठन-लेबल 253J आरएफपी के साथ मिश्रित कोशिकाओं-लेबल मानव fibroblasts (बाएं) या GFP-लेबल 253J अकेले कोशिकाओं (दाएं)। Spheroids कोलेजन में एंबेडेड और 24 घंटे के लिए निगरानी में थे कृपया यहां क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

यहाँ हम एक 3-डी ट्यूमर अंडाकार आकृति मॉडल है कि मूत्राशय के कैंसर के आक्रमण की वास्तविक समय अवलोकन जो कैंसर प्रगति और मेटास्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है की अनुमति देता है का वर्णन । इस प्रणाली के लिए विभिंन stromal और सेलुलर घटकों के शामिल करने के लिए जांचकर्ताओं को बेहतर दोहराऊंगा ऊतक microenvironment जहां मूत्राशय कैंसर के आक्रमण जगह लेता है के लिए उत्तरदाई है । मूत्राशय कैंसर spheroids सेल लाइनों के रूप में विभिंन स्रोतों से उत्पंन किया जा सकता है (आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल लाइनों संकेतन मार्ग है कि आक्रमण प्रक्रियाओं को प्रभावित करने की परीक्षा के लिए उपयोगी सहित), और माउस प्राथमिक ट्यूमर (यहां वर्णित) । यह संभवतः भी मानव प्राथमिक ट्यूमर विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इमेजिंग प्रणाली के आधार पर इस्तेमाल किया, प्रतिदीप्ति वास्तविक समय में या निर्धारण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विभिंन समय पर दाग-अंक से निगरानी की जा सकती है । प्रणाली भी आक्रमण के संभावित अवरोधकों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इससे मूत्राशय कैंसर जीव विज्ञान का आकलन करने के लिए प्रणाली एक बहुमुखी और शक्तिशाली उपकरण बनाती है ।

एक जलवायु चैंबर जो तापमान नियंत्रण, नमी नियंत्रण प्रदान करता है, और सह2 आपूर्ति के साथ फोकल माइक्रोस्कोपी प्रणाली इस प्रोटोकॉल में वर्णित मॉडल के निर्माण के लिए उपकरणों की एक प्रमुख टुकड़ा है ।

यह व्यापक रूप से बताया गया है कि 3 डी संस्कृतियों विशेष microenvironments जो बेहतर सेल जीवविज्ञान और कैंसर अध्ययन19,20के लिए देशी ऊतकों की नकल प्रदान करते हैं । कई अध्ययनों पारगंय झिल्ली डालने परख जो शर्तों के तहत जो आक्रमण vivo मेंहोता है प्रतिबिंबित नहीं पर भरोसा करते हैं । इसके अलावा, इन पारंपरिक अध्ययनों से न तो एक वास्तविक समय फैशन में आक्रमण की प्रक्रिया की आसान निगरानी की अनुमति है, और न ही नमूने के दौरान या आक्रमण के बाद विस्तृत विश्लेषण । इस के साथ साथ हम एक प्रणाली है जो दोनों वास्तविक समय और इनवेसिव कैंसर जीव विज्ञान के समापन बिंदु पूछताछ के लिए उपयोगी है वर्णित है ।

कोलेजन अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स (ECM) का एक महत्वपूर्ण घटक है, और कई रूपों में मौजूद है । प्रकार-1 कोलेजन fibrillar कोलेजन का प्रमुख रूप है, जबकि प्रकार-4 कोलेजन एक nonfibrillar ऊपर तहखाने झिल्ली21बनाने कोलेजन है । कैंसर की कोशिकाओं को तहखाने झिल्ली घुसना चाहिए और प्रकार के माध्यम से कदम-1 कोलेजन से प्रगति के दौरान गैर इनवेसिव इनवेसिव ट्यूमर के लिए22। ECM, प्रकार में अपनी सर्वव्यापी उपस्थिति को देखते हुए-1 कोलेजन 3 के निर्माण के लिए मैट्रिक्स के रूप में इस्तेमाल किया गया है डी संस्कृतियों, जो दो आयामी संस्कृति पकवान5,6,23से बेहतर ECM नकल । जबकि यहां उल्लिखित प्रणाली एक प्रकार-1 कोलेजन मैट्रिक्स पर आधारित है, यह अंय stromal प्रयोगात्मक प्रश्न और जरूरत के आधार पर घटक शामिल संशोधित किया जा सकता है ।

हम कोशिका रेखाओं से मूत्राशय कैंसर spheroids उत्पन्न करने की पद्धति का उपयोग कम-अनुलग्नक स्थितियों और सेल एकत्रीकरण में कोशिका संस्कृति को शामिल करते हैं । नहीं सभी कोशिकाओं को इन संस्कृति की स्थिति को सहन कर सकते है और कुछ apoptosis या ढीला समुच्चय है कि कोलेजन embedding प्रक्रिया के दौरान अलग कर देना के गठन से गुजरना हो सकता है । संस्कृति समय, सेलुलर संख्या या निलंबन में अन्य कोशिका प्रकार को शामिल संशोधित करने के परिणाम में सुधार हो सकता है. इस परख के लिए चयनित सेल लाइनें प्रयोग के लक्ष्य पर निर्भर करती हैं । हम सफलतापूर्वक 7/7 अद्वितीय मानव मूत्राशय कैंसर सेल लाइनों के साथ इस तकनीक का इस्तेमाल किया है । हालांकि, संभव है कि कुछ सेल लाइन इस प्रायोगिक सेटअप के लिए उपयुक्त न हो । इसके अलावा, कुछ सेल लाइनों एक बहुत आक्रामक phenotype है, जो spheroids की जल्दी संबद्धता की ओर जाता है, और कैंसर की कोशिकाओं को समय चूक प्रयोग के दौरान प्रेक्षण क्षेत्र से बाहर घूम रहा है । सेल लाइनों के सामांय व्यवहार को समझने के लिए पायलट प्रयोगों अत्यधिक अध्ययन के लिए सबसे अच्छा समय फ्रेम निर्धारित करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं । अंडाकार आकृति जनरेशन और इमेजिंग के साथ सामान्य समस्याओं के लिए समस्या निवारण तालिका 1में सूचीबद्ध है ।

इस प्रणाली के कैंसर सेल आक्रमण को ब्लॉक करने की क्षमता के साथ औषधीय यौगिकों की सीमित स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है । इस के साथ साथ हम Cytochalasin डी, actin बहुलकीकरण के एक सेल पारगंय अवरोधक, इस्तेमाल के लिए इस संभावित आवेदन18वर्णन । जैसा कि ऊपर दिखाया गया है, cytochalasin D के ०.२ µ m प्रभावी रूप से um-UC9 और um-UC18 spheroids के आक्रमण को रोकता है । बहु कक्षों स्लाइड और स्वचालित सूक्ष्म चरण नियंत्रण का उपयोग करके, ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण पर कई यौगिकों के प्रभाव संभव है.

हालांकि इन परख सबसे अच्छा गुणात्मक इनवेसिव व्यवहार का वर्णन करने के लिए अनुकूल हैं, प्रवास और आक्रमण की सीमा के ठहराव भी संभव है । प्रयोग की शुरुआत में spheroids की छवियों के अधिग्रहण और विभिंन समय अंक पर, और बाद में छवि विश्लेषण के लिए एक्स, वाई या जेड दिशाओं में आक्रमण के दूर रैखिक दूरी को मापने के लिए आक्रामक प्रवासी व्यवहार के ठहराव प्रदान कर सकते हैं । अधिक उन्नत छवि विश्लेषण फ्लोरोसेंट लेबल वाले कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए परिभाषित करने और प्रयोगात्मक आवश्यकता या प्रश्न के आधार पर व्यक्तिगत सेल या सेल प्रकार व्यवहार quantitate करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

लेखकों तकनीकी सहायता के लिए डॉ हावर्ड क्रॉफर्ड (मिशिगन विश्वविद्यालय) की प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा और इस अध्ययन के लिए सामग्री और उपकरण उपलब्ध कराने, और तकनीकी सहायता के लिए एलन Kelleher ।

यह काम मिशिगन विश्वविद्यालय के Rogel कैंसर सेंटर कोर ग्रांट CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (डीएमएस) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
DMEM cell culture medium Thermo Fisher Scientific 11995065
Fetal bovine serum  Thermo Fisher Scientific 26140079
Antibiotic-Antimycotic (100x) Thermo Fisher Scientific 15240062
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3803
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4  Thermo Fisher Scientific 10010023
Costar Ultral-low attachment 6-well cluster  Corning 3471
Conventional inverted microscope  Carl Zeiss 491206-0001-000 General use for cell culture and checking spheroids
Collagen type 1 from rat tail, high concentration  Corning 354249
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155382
Confocal microscope  Carl Zeiss LSM800 A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function 
Cryostat micromtome Leica Biosystems CM3050 S
Zen 2 Image processing software  Carl Zeiss
Paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15710
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen Vector Laboratories  H4000
O.C.T compound  Thermo Fisher Scientific 23730571
Hoechst 33342 solution  Thermo Fisher Scientific 62249
Anti-ATDC (Trim29) antibody Sigma-Aldrich HPA020053
Anti-Cytokeratin 14 antibody Abcam ab7800
Anti-Vimentin antibody Abcam ab24525
ProLong Diamond  Mounting medium

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३९ मूत्राशय कैंसर 3-डी संस्कृति कोलेजन आक्रमण extracellular मैट्रिक्स गतिशीलता
3-डी सेल संस्कृति प्रणाली आक्रमण अध्ययन और मूत्राशय कैंसर में चिकित्सकीय मूल्यांकन के लिए
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Wang, Y., Day, M. L., Simeone, D.… More

Wang, Y., Day, M. L., Simeone, D. M., Palmbos, P. L. 3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer. J. Vis. Exp. (139), e58345, doi:10.3791/58345 (2018).

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