Summary
Os processos que regem a invasão do câncer de bexiga representam oportunidades para o desenvolvimento de terapêutico e biomarcador. Aqui nós apresentamos um modelo de invasão de câncer de bexiga que incorpora a cultura 3D de esferoides de tumor, imagem latente de lapso de tempo e microscopia confocal. Essa técnica é útil para definir as características do processo invasivo e para a seleção de agentes terapêuticos.
Abstract
Câncer de bexiga é um problema significativo para a saúde. Estima-se que mais de 16.000 pessoas morrerão este ano nos Estados Unidos de câncer de bexiga. Enquanto 75% dos cânceres de bexiga são invasivos e improvável que metastatizam, cerca de 25% de progresso para um padrão de crescimento invasivo. Até metade dos pacientes com câncer invasivo desenvolverá letal recaída metastática. Assim, compreender o mecanismo de progressão invasiva no câncer de bexiga é crucial para prever os resultados dos pacientes e prevenir metástases letais. Neste artigo, apresentamos um modelo de invasão do câncer tridimensional que permite a incorporação de células tumorais e componentes do estroma para imitar na vivo condições ocorrem no microambiente do tumor de bexiga. Este modelo fornece a oportunidade de observar o processo invasivo em tempo real utilizando imagens de lapso de tempo, interrogar as vias moleculares envolvidos usando compostos de imagem e tela de imunofluorescência confocal com o potencial de invasão de bloco. Enquanto este protocolo centra-se em câncer de bexiga, é provável que métodos semelhantes poderiam ser usados para examinar a invasão e a mobilidade, bem como outros tipos de tumor.
Introduction
Invasão é um passo fundamental na progressão do câncer, que é necessário para a metástase e está associado a baixa sobrevivência e mau prognóstico em pacientes. Em câncer de bexiga humana, a mais comum malignidade do tracto urinário, o que faz com que cerca de 165.000 mortes por ano em todo o mundo, prognóstico, tratamento e estágio do câncer estão diretamente relacionadas com a presença ou ausência de invasão1. Cerca de 75% dos casos de câncer de bexiga são não-músculo invasivo e são gerenciados com ressecção local. Em contraste, os cânceres de bexiga músculo-invasivos (cerca de 25% dos casos) são tumores agressivos com altas taxas de metástases e são tratados com terapia de multimodalidade agressivo2,3. Portanto, compreender as vias moleculares que desencadeiam a invasão é essencial para melhor caracterizar o risco de progressão invasiva e desenvolver intervenções terapêuticas que podem impedir a progressão invasiva.
Progressão do tumor invasivo ocorre num ambiente complexo tridimensional (3D) e envolve a interação de células de tumor com outras células do tumor, estroma, membrana basal e outros tipos de células, incluindo células do sistema imunológico, fibroblastos, células musculares e vasculares células endoteliais. Permeável ao suporte (por exemplo, Transwell), sistemas de ensaio são comumente empregados para dosar de invasão de células de câncer4, mas esses sistemas são limitados porque não permitem monitoramento microscópico do processo de invasão em tempo real e a recuperação de amostras para análise molecular e ainda mais a coloração é um desafio. Desenvolvimento de um sistema de esferoide de tumor de bexiga em 3D para estudar a invasão é desejável porque permite a incorporação de componentes microenvironmental definidos com a conveniência de sistemas em vitro .
Neste protocolo, descrevemos um sistema para interrogar os processos invasivos de células de câncer de bexiga humana usando um ensaio de invasão de esferoide 3D incorporando as matrizes de gel à base de colagénio e microscopia confocal para permitir que os investigadores monitorar a motilidade celular e invasão em tempo real (Figura 1A). Este sistema é versátil e pode ser modificado para interrogar várias configurações/tumor estromal. Pode incorporar a maioria das linhas de células de câncer de bexiga ou bexiga primário tumores e células estromais adicionais tais como cancro associado fibroblastos e células do sistema imunológico5,6,7. Este protocolo descreve uma matriz composta de colágeno tipo 1, mas pode ser modificado para incorporar outras moléculas como fibronectina, laminina ou outras proteínas de colágeno. Processos invasivos podem ser seguidos por 72 horas ou mais dependendo da capacidade do microscópio e sistema utilizado. Fixação e mancha do tumor incorporado na matriz em 3D, antes, durante e depois da invasão da imunofluorescência permite o interrogatório de proteínas upregulated em células invasoras, assim fornecendo informações cruciais que geralmente ausente ou difícil de reunir usando outros modelos de cultura em 3D. Este sistema também pode ser utilizado para compostos de tela que bloqueiam a invasão e para delinear as vias de sinalização afectadas por tais compostos.
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Protocol
1. crescente esferoides de câncer
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Crescimento de linhagens celulares
- Células de câncer de bexiga humana cultura sob convencional aderente as condições de cultura de células e mantêm em uma incubadora de 37 ° C, fornecida com 5% de CO2. Manter as células no < confluência de 90%.
Nota: meios de cultura utilizados é de Dulbecco modificado mídia essencial mínima (DMEM) contendo 4,5 g/L D-glicose, piruvato de sódio de 110 mg/L, L-glutamina e fornecido com 10% soro bovino fetal (FBS) ao longo do presente protocolo. - Um dia antes do início do experimento, trypsinize (usando 0,25% Trypsin-EDTA) células, quantificar a concentração de células e distribuir 1 x 106 células em meios de cultura 3 mL em cada poço de uma placa de fixação 6-poços ultra baixo.
- Incube as células em condições de fixação baixo a 37 ° C para ≥16 h. Isto deve permitir um tempo adequado para as células para agregar em esferoides para a maioria das linhas de células de câncer de bexiga.
Nota: A formação de esferoides pode ser observada pelo microscópio invertido de campo brilhante. O tamanho ideal e o número de esferoides podem depender de experiências individuais, mas achamos que esferoides com diâmetro de 50 µm a 150 µm são geralmente adequados para a imagem latente de lapso de tempo usando uma lente de objetiva X 20. - Para incorporar tipos de células adicionais, como fibroblastos ou células imunes para os esferoides, misturar as células desejadas com células cancerosas na proporção desejada (1:1, 01:10, etc.) em um anexo de ultra baixo da placa e incubar a 37 ° C para ≥16 h permitir a formação de mistura de células tipo esferoides.
- Células de câncer de bexiga humana cultura sob convencional aderente as condições de cultura de células e mantêm em uma incubadora de 37 ° C, fornecida com 5% de CO2. Manter as células no < confluência de 90%.
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Crescimento de tumores primários
Nota: Tumor esferoides também podem ser derivados de tumor de bexiga primário fontes tais como tumores, desenvolvidos a partir de modelos de tumor de bexiga induzida por substância cancerígena8. Por exemplo, tumores de bexiga, gerados a partir de ratos alimentados com N-butil - N-(4-hydroxybutyl) nitrosamina (BBN), podem ser colhidas e picada em pedaços pequenos (cerca de 0,5 mm3) usando instrumentos cirúrgicos estéreis. Digerido amostras primárias da bexiga humana cânceres também podem ser estudados neste sistema.- Recolher e lavar os pedaços de tumor de3 0,5 mm em 5 mL gelada fosfato salino (PBS). Centrifugação a 200 x g por 5 min a 4 ° C. Repita essa etapa de lavagem uma vez.
- Recolher pedaços de tumor por centrifugação a 200 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Remover o sobrenadante e adicionar 5 mL de DMEM contendo 10% FBS. Transfira a mistura de esferoide/mídia de tumor em uma chapa de fixação 6-poços ultra baixo. Incubar a 37 ° C para ≥16 h antes da incorporação em matriz de colagénio (ver passo 2.3).
2. preparar a câmara de cultura 3-d
-
Diluir o colágeno tipo 1 (derivado de rabo de rato) em DMEM contendo 10% FBS para fazer uma mistura de 2 mg/mL de acordo com as instruções do fabricante.
- Em suma, misture colágeno com quantidade adequada de solução de NaOH N 1 e DMEM pipetando suave baseado as instruções do fabricante para atingir pH fisiológico.
- Depois de misturar colágeno e DMEM, rapidamente revestir os poços do slide câmara (para a maioria dos aplicativos, slides de câmara com um vidro de cobertura número 1.5 é ideal) com a mistura de colágeno-DMEM antes da solidificação (200 µ l/poço). Permitir que o slide de câmara revestido ser estacionária em temperatura ambiente por 15 min.
Nota: A composição da matriz baseada em colágeno pode ser modificada com a adição de outros ingredientes, matriz extracelular, como fibronectina ou laminina, de acordo com os fins da experiência.
- Delicadamente Pipetar 500 µ l de mídia contendo esferoides (ou pedaços de tumor, se é utilizada a amostra do tumor primário) da placa de fixação ultra baixo 6-poços em um tubo de microcentrifugadora vazio 1,5 mL. Espere 2 min para deixar os esferoides resolver para o fundo do tubo.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo. Prepare um outro tubo de colágeno tipo 1 (2 mg/mL) misturado com DMEM contendo 10% FBS e rapidamente adicionar 500 µ l de mistura para os esferoides. Misture suavemente o esferoides e colágeno pipetando lento.
- Adicione 250 µ l de mistura de esferoides/colágeno para um poço de slide de colágeno-pré-revestidas de câmara. Permitir que a matriz de colagénio que contêm esferoides para solidificar completamente (cerca de 30 min a 37 ° C).
- Depois que a matriz de colagénio é solidificado, adicionar 1 mL de DMEM contendo 10% FBS a cada poço (Figura 1B). Incube o slide de câmara em uma incubadora de 37 ° C, fornecido com 5% CO2 até que esteja pronto para a imagem latente.
3. live Cell Imaging lapso de tempo
- Ligue o microscópio confocal, seguindo as instruções do fabricante e certifique-se de que a câmara climática atinge 37 ° C e é fornecida com 5% de CO2.
Nota: Nosso microscópio e câmara normalmente requerem 1 h para atingir o equilíbrio do sistema. - Transferi com cuidado o slide de câmara para o adaptador de slide anexado ao microscópio.
- Localize os esferoides de interesse usando um objectivo de baixa potência (por exemplo, 5 X) e começar a imagem com o objectivo de poder mais elevado (no atual protocolo, 20 objetivo X é usado pela maior parte a imagem de célula viva para sua melhor qualidade de imagem).
Nota: Para amostras de tumor primário de bexiga, 5 X e 10 objectivos de X podem ser necessário a fim de cobrir a maior área de imagem. Para a nossa imagem de lapso de tempo, o intervalo de imagem é definido como 30 min e uma pilha de Z é usada para o spheroid todo da imagem. Tipicamente a distância entre Z-fatias é definida como 4 µm para a 20 X objetivo e a distância total do eixo Z é em torno de 200 µm. imagens podem ser obtidas usando DIC e fluorescência se células/tecidos abrigam marcadores de proteína fluorescente. - Realize imagens de lapso de tempo de 24-72 h.
Nota: A duração é determinada pelo tipo de célula e as necessidades do experimento.
4. preparação do bloco de amostra contendo câncer esferoides para corte de tecido congelado
- Cuidadosamente Retire o bloco do gel de colágeno e esferoides de slides a câmara usando pequenas pinças. Coloque o bloco do gel de colágeno em um molde de plástico histologia.
- Lave o gel de colágeno com 1X PBS brevemente e então corrigi-lo com paraformaldeído 4% (PFA) em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
Cuidado: PFA é potencial cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado. - Lave o gel de colágeno com 1,5 mL de 1X PBS num agitador de 15 min. substituir a PBS e repita a etapa anterior de lavar 3x.
- Aplique uma camada fina (cerca de 3 mm) da temperatura de corte ideal (OCT) composta para cobrir o fundo de um novo molde plástico da histologia. Coloque o fixo e gel de colágeno em cima da OCT lavado composto, então cuidadosamente incorporar o gel todo preenchendo o molde com OCT composto, evitando a formação de quaisquer bolhas de ar na OCT.
- Deixe o molde a 4 ° C, durante 1 h.
- Coloque o molde contendo a amostra e OCT composto em um prato de Petri de 100mm flutuando em nitrogênio líquido. Permitir que a amostra congelar completamente.
- Loja do bloco de amostra congelada a-80 ° C para uso futuro.
5. imunofluorescência Imaging para câncer secionado congelados esferoides
- O bloco de amostra congelada no freezer-80 ° C para a câmara de-20 ° C de um criostato de transferência.
-
Execute corte congelado convencional definindo o intervalo de seção de 7 µm. Deixe amostras secionadas anexar para a lâmina de vidro, sem rugas ou preso o ar.
- Armazene os slides a-80 ° C antes de realizar a coloração ainda mais.
Nota: Intervalos diferentes podem ser usados para atender às necessidades de experimentais.
- Armazene os slides a-80 ° C antes de realizar a coloração ainda mais.
- Ar seco os slides por 1h à temperatura ambiente.
- Permeabilize as amostras com PBS contendo 0,5% Triton X-100 por 15 min.
- Lavagem de amostras 3x com PBS por 10 min por lavagem.
- Cercam as amostras no slide com barreiras hidrofóbicos, usando uma caneta de barreira hidrofóbica.
- Trate as amostras com solução de bloqueio (1X PBS contendo 5% albumina de soro bovino (BSA)), por 1h à temperatura ambiente.
- Aplica 40 µ l de solução contendo anticorpos primária (1X PBS contendo 5% BSA com diluição de 1: 100 de anticorpo primário) para cada amostra no slide.
- Incube os slides no anticorpo primário a 37 ° C por 1 h ou na temperatura de quarto durante a noite (o tempo de incubação e condições variam dependendo do anticorpo primário).
- Lavagem de amostras 3x com PBS por 15 min (por lavagem).
- Aplica 40 µ l de solução contendo anticorpos secundária (1X PBS contendo 5% de BSA com diluição de 1: 300 anticorpo secundário) para cada amostra no slide.
- Lavagem de amostras 3x com PBS por 15 min (por lavagem).
- Manche as amostras com solução de Hoechst 33342 (1 µ g/mL, diluído em PBS) à temperatura ambiente por 10 min. Em seguida, lave as amostras com PBS por 5 min.
- Montar as amostras com meio de montagem e cubra-os com o tamanhos adequado de lamínulas. Deixe os slides no escuro à temperatura ambiente por 24 h e em seguida, executar a microscopia confocal.
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Representative Results
Criação bem sucedida de esferoide de tumor de câncer de bexiga invasivo requer a formação de esferoides tumor tamanho de tumores primários ou linhas de célula. Figura 2 A mostra de esferoides apropriadamente dimensionados, desenvolvidos a partir de quatro as linhas da célula humana bexiga câncer (UC9-UM, UM-UC13, UM UC14, 253J e UM UC18). Figura 2 B mostra um esferoide de tumor de um tumor de bexiga BBN-gerado rato incorporado em matriz de colagénio. Esses esferoides foram incorporados como descrito acima e imagens representativas foram capturadas usando um microscópio equipado para geração de imagens de células vivas. A 20 lente objetiva X foi usado para imagem UC9-UM, UM-UC13, UM UC14 e UM UC18 esferoides, Considerando que esferoides de tumor de bexiga de rato foram examinados usando 5 X e 10 X objectivas.
Imagens representativas de esferoides de linha celular bexiga humana após 24-72 h(Figura 2)e esferoides (Figura 2B) tumor primário da bexiga do BBN rato demonstram migração de câncer de bexiga na matriz de colágeno. 253J, uma linhagem de células não-invasiva, permanecem em grande parte intacta, com pouca ou nenhuma migração(Figura 2). Vídeos 1, 2e 3 demonstram o processo de invasão de lapso de tempo para UM-UC9, UM UC13 e UM UC14 esferoides, respectivamente. 4 vídeo mostra as propriedades de invasão de um esferoide UM-UC18. Video 5 mostra as duas áreas de tumor de bexiga de rato de 66 h para incorporação de pós-colágeno 87 h.
Para demonstrar a viabilidade do uso de mancha da imunofluorescência de marcadores de proteína em nossas esferoides tumor invasivo, foram fixadas e manchados em 24 ou 72 mostra Figura 3 h. amostras representativas manchadas por grupo Ataxia-Telangiectasia Proteína associada a D (ATDC, também conhecido como TRIM29), uma proteína que desempenha um papel significativo na progressão tumorigênese e câncer da bexiga humana e cânceres pancreáticos9,10, tubulinas (α e β), que constituem os microtúbulos e desempenham um papel fundamental na formação da célula e movimento celular11,12, queratina 14 (KRT14), um marcador epitelial basal envolvidos na invasão13e vimentina (VIM), um marcador mesenquimal14,15, 16. Essas imagens demonstram que a visualização das estruturas celulares e subcelulares pode ser executada usando esta metodologia. A maior exibição de ampliação de UM-UC14 mostra filamentosa mancha para ATDC(Figura 3). As células altamente invasivas disseminadas pelo UC18 UM esferoides após 24h de invasão express de alto nível do VIM, um marcador de transição epitelial-para-mesenquimais (EMT, Figura 3B).
Incorporação de diferentes tipos de células (fibroblastos associada a câncer) os esferoides de tumor viável e fornece uma maneira para examinar interações célula-célula heteróloga (Figura 4 e 6 de vídeo). Neste exemplo, usamos a proteína de fluorescência vermelha (RFP)-linha transfectada com um vector para a expressão da proteína verde fluorescente (GFP) de células de fibroblastos humanos rotulados e o câncer de bexiga 253J. Estas células foram misturadas de esferoides de tumor de forma e incorporadas em colágeno. O processo de invasão, monitorado pela microscopia confocal. A Figura 4 demonstra que interação com fibroblastos pode modular o comportamento invasivo do 253J.
A Figura 5 demonstra a utilidade do sistema de ensaio para testar inibidores da invasão. Cytochalasin D é um conhecido inibidor da migração celular e invasão, que atua através do bloqueio de17,de polimerização de actina18 e foi usado como um exemplo. Tratamento de Cytochalasin D inibiu a invasão de UM-UC9 esferoides (Figura 5A). A mesma concentração de citocalasina D (0,2 µM) é capaz de inibir parcialmente a invasão de esferoides UM-UC18 (Figura 5B). Desde que o sistema pode ser usado para a imagem de vários poços e organoids de tumor em paralelo, é passível de um painel limitado de agentes farmacológicos para efeito na invasão de triagem.
Figura 1 : Instalação para ensaio de invasão em 3D com imagens ao vivo de celular. (A) visão geral esquemática para imagens 3D de células vivas e imunofluorescência. (B) lamela de câmara com colágeno e suportes utilizados neste experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Invasão de esferoide de câncer de bexiga. (A) exemplos de bexiga humana câncer célula linha esferoides incorporados em uma matriz de gel de colágeno. Esferoides são mostrados no momento da incorporação (0 h, linha superior) ou após 72 h (UM-UC9, UM UC13, UM UC14, 253J) ou 24 h (UM-UC18). Barra de escala = 50 µm. (B) exemplos de BBN-induzido do rato bexiga tumor invasão na matriz de colágeno. As setas indicam a borda invasiva do esferoide de tumor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise de imunofluorescência de esferoides de câncer de bexiga invasivo. (A) UC14 de UM esferoide de tumor após 72 h de invasão em colágeno. As amostras foram coradas pelo ensaio de imunofluorescência convencional para ATDC (verde), tubulina (violeta) e núcleos (Hoechst mancha azul). Quadrado branco indica que a área com maior visão de ampliação mostrada na parte inferior linha bem dois painéis. Barra de escala = 50 µm. (B) UC18 de UM tumor esferoides manchados para KRT14 (verde), VIM (vermelho), ATDC (violeta) e núcleos (Hoechst mancha azul) após 24 h de invasão em colágeno. Barra de escala = 50 µm. quadrado branco indica a área com maior visão de ampliação mostrada no painel à direita inferior. Linha tracejada indica aproximadamente o limite do spheroid tumor original. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Esferoide fluorescente-etiquetadas tumor incorporando fibroblastos. Invasão de GFP-etiquetado 253J bexiga as células cancerosas sozinhos (painéis de fundo) ou co cultivadas com fibroblastos RFP-rotulado (top painéis), monitorados por 24 h. escala barra = 50 µm. invasão é reforçada com a adição dos fibroblastos para o sistema de cultura (painel superior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Efeito de uma droga molecular pequeno direcionamento polimerização de actina em invasão. (A) UC9-UM esferoide de tumor tratados com citocalasina D (0,2 µM) ou DMSO (controle do veículo) e monitorado por esferoide de tumor 72 h. (B) UM-UC18 tratados com citocalasina D ou DMSO por 24 h. escala barra = 50 µm. linha tracejada indica o limite do original esferoide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Possível problema | Solução recomendada |
| Reduzido número de esferoides viáveis | • Aumentar o número de células cultivadas em suspensão • Certifique-se > 90% células viáveis após typsinization • Seleção de células para a contaminação • Manter as células em crescimento logarítmica antes typsinizing • Otimizar os meios de cultura celular • Modificar o tempo de cultura em estado de suspensão • Experimente a linha celular alternativo |
| Esferoides são muito grande ou muito pequeno | • Ajustar o número de células adicionado à placa de ligação de baixa • Uso suave de pipetagem para quebrar grandes agregados de células |
| Difícil de se concentrar durante a imaginar | • Ajustar a espessura do gel de colágeno. Para objectivos com a curta distância de trabalho, tente fazer com que o colágeno mais fina do gel. • Certifique-se que a câmara slide ou lamela é #1.5 • Otimizar o tamanho de esferoides (50-150 µm de diâmetro) |
| As células migram da zona de imagem durante o ensaio de invasão | • Reduzir o tamanho de esferoides • Re-centralizar a zona de imagem cada 24 h se necessário • Engajar-se lado a lado tecnologia de imagem (se aplicável) para cobrir a maior área • Considerar a utilização de linha celular alternativo |
| O slide de câmara seca | • Garantir que não haja nenhum escapamento na configuração da câmara climática • Assegurar que o mecanismo de controle de umidade é funcional |
Tabela 1: Solução de problemas o modelo 3-d de invasão.
Vídeo 1: Time-Lapse vídeo mostrando UM-UC9 esferoide cultivada em colágeno de 0-72 h. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 2: Time-Lapse vídeo mostrando a migração coletiva de UC13 de UM esferoide cultivada em colágeno de 0-72 h. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 3: Time-Lapse video de UC14 de UM esferoide cultivada em colágeno de 0-72 h. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 4: Time-Lapse video de UC18 de UM esferoide cultivada em colágeno de 0-24 h. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Video 5: vídeo Time-Lapse de tumores de bexiga de rato induzida por BBN 66–incorporação de pós-colágeno 84 h. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 6: Time-Lapse vídeo mostrando esferoides câncer formados a partir de células GFP-etiquetado 253J misturado com RFP-rotulado fibroblastos humanos (à esquerda) ou GFP-etiquetado 253J células sozinha (direita). Esferoides foram incorporados em colágeno e monitorado por 24 h. , por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Aqui descrevemos um modelo de esferoide de tumor em 3D que permite a observação em tempo real da invasão de câncer de bexiga que é crítico para metástase e progressão do câncer. Este sistema é favorável à incorporação de vários componentes do estroma e celulares para permitir que os investigadores melhor recapitular o microambiente do tecido onde ocorre invasão do câncer de bexiga. Esferoides de câncer da bexiga pode ser gerados a partir de várias fontes, tais como linhas de célula (incluindo linhas de células geneticamente modificados úteis para o exame da sinalização de caminhos que afetam processos de invasão) e mouse primários tumores (descritas aqui). Potencialmente pode também ser adaptado para a análise do tumor primário humano. Dependendo do sistema de imagens utilizado, a fluorescência pode ser monitorada em tempo real ou por fixação e mancha nos vários pontos de tempo. O sistema também pode ser usado para testar potenciais inibidores da invasão. Isto torna o sistema uma ferramenta versátil e poderosa para avaliar a biologia do câncer de bexiga.
O sistema de microscopia confocal com uma câmara climática que fornece controle de temperatura, controle de umidade e CO2 entregas é uma peça chave do equipamento para a construção do modelo descrito neste protocolo.
Tem sido amplamente relatado que culturas 3D fornecem microambiente especializado que melhor imitam tecidos nativos para celular biologia e câncer estudos19,20. Muitos estudos dependem de ensaios de inserção de membrana permeável que não refletem as condições sob as qual invasão ocorre na vivo. Além disso, esses estudos convencionais permitem fácil monitoramento do processo de invasão de uma forma em tempo real, nem análise detalhada das amostras durante ou invasão seguinte. Neste documento descrevemos um sistema que é útil para ambos em tempo real e interrogatório de ponto de extremidade de biologia do câncer invasivo.
Colágeno é um componente importante da matriz extracelular (ECM) e existe em muitas formas. Colágeno tipo 1 é a forma predominante de colágeno fibrillar enquanto colágeno tipo-4 é um nonfibrillar colágeno compõem a membrana basal de21. As células cancerosas devem penetrar a membrana basal e mover-se através do colágeno tipo 1 durante a progressão do não-invasiva para tumores invasivos22. Dada sua presença ubíqua em ECM, colágeno tipo 1 tem sido usado como matriz para a construção de culturas em 3D, que imitam o ECM melhor do que a cultura bidimensional prato5,6,23. Enquanto o sistema descrito aqui é baseado em uma matriz de colágeno tipo 1, pode ser modificado para incluir outros constituintes do estroma com base na pergunta experimental e precisa.
A metodologia que usamos para gerar esferoides de câncer de bexiga de linha celular envolve a cultura de células em condições de baixa fixação e agregação de célula. Nem todas as células podem tolerar estas condições de cultura e alguns podem sofrer apoptose ou formação de agregados soltos que dissociam durante o processo de incorporação de colágeno. Modificando o tempo de cultura, número de celular ou incorporando outros tipos de células em suspensão pode melhorar o resultado. As linhas de célula selecionadas para este ensaio dependem o objetivo do experimento. Temos usado com sucesso esta técnica com linhas de células de câncer de bexiga humana original 7/7. No entanto, é possível que algumas linhas de célula não podem ser apropriadas para esta configuração experimental. Além disso, algumas linhas de célula tem um fenótipo muito invasivo, o que leva à dissociação precoce de esferoides e as células cancerosas, movendo-se fora da área de observação durante o experimento de lapso de tempo. Experiências piloto para a compreensão do comportamento geral de linhas celulares são altamente recomendadas para determinar os melhores prazos para estudos. Solução de problemas para problemas comuns com geração de esferoide e imagem está listada na tabela 1.
Este sistema é adequado para a seleção limitada de compostos farmacológicos com potencial de invasão de células de câncer de bloco. Aqui usamos citocalasina D, um célula-permeável inibidor da polimerização de actina, para ilustrar este potencial aplicação18. Como mostrado acima, 0,2 µM de citocalasina D efetivamente inibe a invasão de esferoides UC9-UM e UM-UC18. Utilizando slides de múltiplas câmaras e controle automatizados fase microscópica, o efeito de vários compostos na invasão de tumor esferoide é viável.
Embora estes ensaios são mais adequados para descrever qualitativamente o comportamento invasivo, a quantificação da extensão da migração e invasão também é viável. Imagem de aquisição de imagens de esferoides no início do experimento e em vários pontos de tempo e posterior análise para medir a distância linear a mais distante da invasão em X, Y ou Z direções podem proporcionar quantificação do comportamento migratório invasiva. Mais avançado análise imagem usando fluorescente rotulados células poderia ser usado para definir e quantificar células individuais ou o comportamento de tipo celular dependendo da necessidade experimental ou pergunta.
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Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer o laboratório do Dr. Howard Crawford (Universidade de Michigan) para suporte técnico e fornecer materiais e equipamentos para este estudo e Alan Kelleher para suporte técnico.
Este trabalho foi financiado por doações da Universidade de Michigan Rogel Cancer Center núcleo Grant CA046592-26S3, CA201335 de NIH K08-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
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