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Cancer Research

Système de Culture cellulaire 3D pour étudier l’Invasion et l’évaluation thérapeutique dans le Cancer de la vessie

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58345
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Departments of Internal Medicine, Hematology/Oncology Division, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 2Department of Urology, Division of GU Oncology, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 3Departments of Surgery and Pathology, Perlmutter Cancer Center, NYU Langone Health

Summary

Les processus d’invasion du cancer de la vessie représentent des occasions de biomarqueurs et de développement thérapeutique. Ici, nous présentons un modèle d’invasion de cancer de la vessie qui intègre la culture 3D des sphéroïdes de tumeur, Time-lapse imagerie et microscopie confocale. Cette technique est utile pour définir les caractéristiques du processus invasif et pour le dépistage des agents thérapeutiques.

Abstract

Cancer de la vessie est un problème de santé important. On estime que plus de 16 000 personnes mourront cette année aux Etats-Unis d’un cancer de la vessie. Alors que 75 % des cancers de la vessie sont non invasif et peu susceptible de métastaser, environ 25 % évoluer vers un modèle de croissance invasive. Jusqu'à la moitié des patients atteints de cancers invasifs développera la rechute métastatique létale. Comprendre le mécanisme de progression invasive dans le cancer de la vessie est donc cruciale pour prédire des résultats pour les patients et de prévenir les métastases mortelles. Dans cet article, nous présentons un modèle d’invasion du cancer en trois dimensions qui permet l’incorporation des cellules tumorales et stromales composants pour reproduire in vivo les conditions rencontrées dans le microenvironnement de tumeur de la vessie. Ce modèle offre la possibilité d’observer le processus invasif en temps réel en utilisant l’imagerie Time-lapse, interroger les voies moléculaires impliquées utilisant des composés confocale par immunofluorescence, imagerie et écran risquent de bloc invasion. Ce protocole met l’accent sur le cancer de la vessie, mais il est probable que des méthodes similaires pourraient servir à examiner l’invasion et la motilité dans d’autres types de tumeur.

Introduction

Invasion est une étape essentielle dans la progression du cancer, qui est nécessaire pour les métastases et est associé à une survie plus faible et de mauvais pronostic chez les patients. Dans le cancer de la vessie humaine, la malignité plus courante du tractus urinaire, ce qui provoque environ 165 000 décès par an dans le monde entier, pronostic, traitement et stade de cancer sont directement liés à la présence ou l’absence d’invasion1. Environ 75 % des cas de cancer de la vessie sont envahissantes non musculaires et sont gérés avec résection locale. En revanche, les cancers de la vessie envahissement musculaire (environ 25 % des cas) sont des tumeurs agressives avec des taux élevés de métastatiques et sont traités avec la multimodalité agressif thérapie2,3. Comprendre les voies moléculaires déclenchant une invasion est donc essentiel de mieux caractériser le risque de progression invasive et de développer des interventions thérapeutiques qui peuvent empêcher la progression invasive.

La progression des tumeurs invasive se produit dans un environnement tridimensionnel complexe de (3-d) et implique l’interaction des cellules tumorales avec les autres cellules de la tumeur, stroma, membrane basale et d’autres types de cellules dont les cellules immunitaires, les fibroblastes, les cellules musculaires et vasculaires cellules endothéliales. Support perméable (p. ex., Transwell), systèmes de dosage sont couramment employées pour doser le cancer cell invasion4, mais ces systèmes sont limités car ils ne permettent pas suivi microscopique du processus invasion en temps réel et la Il est difficile de la récupération des échantillons pour une coloration plus loin et l’analyse moléculaire. Développement d’un système de sphéroïde de tumeur vessie 3D pour étudier l’invasion est souhaitable car elle permet l’incorporation de composants micro-environnementales définis avec la commodité des systèmes d’in vitro .

Dans ce protocole, nous décrivons un système pour interroger les processus invasifs des cellules cancéreuses de la vessie humaine à un dosage d’invasion de sphéroïde 3D intégrant des matrices de gel à base de collagène et de la microscopie confocale à permettre aux enquêteurs de surveiller la motilité cellulaire et invasion en temps réel (Figure 1A). Ce système est polyvalent et peut être modifié pour interroger les différents réglages/tumeur stromale. Il peut intégrer la plupart lignées de cellules cancéreuses de la vessie ou les tumeurs de vessie primaire et des cellules stromales supplémentaires telles que le cancer lié les fibroblastes et les cellules immunitaires5,6,7. Ce protocole décrit une matrice composée de collagène de type 1, mais peut être modifié pour incorporer d’autres molécules telles que la fibronectine, la laminine ou d’autres protéines de collagène. Processus invasifs peuvent être suivis pendant 72 heures ou plus en fonction de la capacité du microscope et le système. Fixation et immunofluorescence souillant de la tumeur, enfoui dans la matrice 3D avant, pendant et après l’invasion permet l’interrogation des protéines surexprimées dans les cellules envahissantes, fournissant ainsi des informations cruciales qu’habituellement absents ou difficiles à recueillir à l’aide d’autres modèles 3D de la culture. Ce système peut également être utilisé pour préliminaire des composés qui bloquent l’invasion et pour délimiter les voies de signalisation touchés par ces composés.

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Protocol

1. croissance du Cancer sphéroïdes

  1. De plus en plus de lignées cellulaires
    1. Cellules de cancer vessie humaine culture sous adherent classique des conditions de culture de cellules et de maintiennent dans un incubateur à 37 ° C livré avec 5 % de CO2. Maintenir les cellules à < confluency 90 %.
      Remarque : les milieux de Culture utilisés est de Dulbecco modifié minimal médias essentiels (DMEM) contenant 4,5 g/L de D-glucose, L-Glutamine, pyruvate de sodium 110 mg/L et fourni avec 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) tout au long de ce protocole.
    2. Un jour avant le début de l’expérience, trypsinize (à l’aide de 0,25 % trypsine-EDTA) cellules, quantifier la concentration cellulaire et distribuer 1 x 106 cellules dans 3 mL de milieu de culture dans chaque puits d’une plaque de fixation 6 puits ultra faible.
    3. Incuber les cellules dans des conditions de faible attachement à 37 ° C pendant ≥ 16 h. Cela devrait permettre un délai suffisant pour les cellules à s’agréger en sphéroïdes pour la plupart lignées de cellules cancéreuses de la vessie.
      Remarque : La formation des sphéroïdes peut être observée par microscope inversé champ lumineux. La taille optimale et le nombre des sphéroïdes peuvent dépendre d’expériences individuelles, mais nous constatons que les sphéroïdes avec des diamètres de 50 µm à 150 µm sont généralement adaptés pour l’imagerie Time-lapse avec un objectif de 20 X.
    4. Pour tenir compte des types de cellules supplémentaires, tels que les fibroblastes ou des cellules immunitaires dans les sphéroïdes, mélanger les cellules souhaitées avec les cellules cancéreuses au ratio désiré (1:1, 01:10, etc..) dans une pièce jointe ultra-basse plaque et incuber à 37 ° C pendant ≥ 16 h afin de permettre la formation de cellule mixte type sphéroïdes.
  2. De plus en plus de tumeurs primaires
    Remarque : Tumeur sphéroïdes peuvent également provenir de tumeur de vessie primaire sources telles que les tumeurs développés à partir de tumeur de vessie induite par la substance cancérigène modèles8. Par exemple, les tumeurs de vessie générés des souris nourris avec N-butyl - N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN), peuvent être récoltées et hachées en petits morceaux (environ 0,5 mm3) à l’aide d’instruments chirurgicaux stériles. La digestion des échantillons primaires de vessie humaine cancers peuvent également être étudiés dans ce système.
    1. Recueillir et lavez 0,5 mm3 pièces de la tumeur à glacee tampon phosphate salin (PBS) 5 mL. Centrifugation à 200 x g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter une fois cette étape de lavage.
    2. Rassembler les morceaux de la tumeur par centrifugation à 200 x g pendant 10 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et ajouter 5 mL de DMEM contenant 10 % FBS. Transférer le mélange de sphéroïde/médias tumeur à une plaque de fixation 6 puits ultra faible. Incuber à 37 ° C pendant ≥ 16 h avant l’intégration dans la matrice de collagène (voir étape 2.3).

2. préparation de la chambre de culture 3-d

  1. Diluer le collagène de type 1 (dérivé de queue de rat) en DMEM contenant 10 % FBS pour faire un mélange de 2 mg/mL selon les instructions du fabricant.
    1. En bref, la composition collagène avec une quantité appropriée de la solution de NaOH N 1et DMEM de pipetage doux basé sur les instructions du fabricant pour atteindre pH physiologique.
    2. Après le mélange collagène et DMEM, rapidement recouvrir les puits de la diapositive de la chambre (pour la plupart des applications, diapositives chambre sous un numéro 1.5-verre est optimal) avec le mélange de collagène-DMEM avant solidification (200 µL/puits). Laisser la lame de chambre couché à être stationnaire à température ambiante pendant 15 min.
      Remarque : La composition de la matrice à base de collagène peut être modifiée en ajoutant d’autres ingrédients de la matrice extracellulaire, telles que la fibronectine ou laminine, selon l’application de l’expérience.
  2. Doucement ajouter 500 µL de milieux contenant des sphéroïdes (ou morceaux de tumeur, si l’échantillon de la tumeur primitive est utilisé) de la plaque de fixation 6 puits ultra faible dans un tube de microcentrifuge vide de 1,5 mL. Attendre 2 mn laisser les sphéroïdes se déposent au fond du tube.
  3. Retirer délicatement le surnageant du tube. Préparer un autre tube du collagène de type 1 (2 mg/mL) mélangé avec DMEM contenant 10 % FBS et rapidement ajouter 500 µL de ce mélange pour les sphéroïdes. Mélanger délicatement les sphéroïdes et collagène par pipetage lente.
  4. Ajouter 250 µL du mélange de sphéroïdes/collagène dans un puits de diapositive de collagène-pre-enduit chambre. Permettre à la matrice de collagène contenant des sphéroïdes à solidifier complètement (environ 30 min à 37 ° C).
  5. Après la matrice de collagène est solidifiée, ajouter 1 mL de DMEM contenant 10 % FBS dans chaque puits (Figure 1B). Incuber la lame de chambre dans un incubateur à 37 ° C livré avec 5 % de CO2 , jusqu’au moment de l’imagerie.

3. vivre la cellule imagerie Time-lapse

  1. Allumez la microscopie confocale en suivant les instructions du fabricant et s’assurer que la chambre climatique atteint 37 ° C et est fournie avec 5 % de CO2.
    NOTE : Notre microscope et chambre exigent habituellement 1 h pour atteindre l’équilibre du système.
  2. Transvaser avec soin la diapositive de la chambre à l’adaptateur de diapositives au microscope.
  3. Localiser les sphéroïdes d’intérêt à l’aide d’un objectif de faible puissance (par exemple, 5 X) et amorcer l’imagerie avec l’objectif de puissance plus élevée (en protocole actuel, objectif 20 X est utilisé pour la majeure partie de l’imagerie de cellules vivantes pour sa meilleure qualité d’image).
    Remarque : Pour des échantillons de tumeur de vessie primaire, 5 X et 10 X objectifs peuvent être nécessaire afin de couvrir la plus grande zone d’imagerie. Pour notre imagerie Time-lapse, l’intervalle d’imagerie est défini comme 30 min et une pile de Z est utilisée pour l’ellipsoïde toute l’image. La distance entre Z-tranches est généralement définie à 4 µm pour la 20 X objectif et la distance totale de l’axe Z est autour de 200 µm. les Images peuvent être obtenus à l’aide de DIC et avec fluorescence si les cellules/tissus harbor marqueurs protéine fluorescente.
  4. Effectuer l’imagerie Time-lapse pendant 24 à 72 h.
    Remarque : La durée est déterminée par le type de cellule et les besoins de l’expérience.

4. préparation du bloc d’échantillons contenant des sphéroïdes de Cancer pour les coupes de tissus congelés

  1. Soulevez le bloc de gel de collagène et sphéroïdes de la glisse de la chambre à l’aide de petites pinces. Placez le bloc de gel de collagène dans un moule en plastique de l’histologie.
  2. Rincer le gel de collagène avec 1 x PBS rapidement et puis le fixer avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS pendant 30 min à température ambiante.
    ATTENTION : PFA est carcinogène potentiel et doit être manipulé avec soin.
  3. Laver le gel de collagène avec 1,5 mL de PBS 1 x sur un agitateur pendant 15 min. remplacer le PBS et répétez l’étape précédente de lavage 3 x.
  4. Appliquer une fine couche (environ 3 mm) de la température de coupe optimale (OCT) composée pour recouvrir le fond d’un moule en plastique histologie nouvelle. Placez le fixe et gel de collagène sur le dessus de l’outil OPO lavé composé, puis incorporez soigneusement le gel tout en remplissant le moule d’OCT composé tout en évitant la formation de bulles d’air dans l’OPO.
  5. Laisser le moule à 4 ° C pendant 1 h.
  6. Placer le moule contenant l’échantillon et l’OCT composé sur un plat de Pétri 100 mm flottant sur l’azote liquide. Laisser l’échantillon flash-geler complètement.
  7. Stocker le bloc congelé à-80 ° C pour une utilisation future.

5. immunofluorescence Imaging for Cancer coupes congelées sphéroïdes

  1. Transfert du bloc d’échantillons congelés du congélateur à-80 ° C à la chambre de-20 ° C d’un cryostat.
  2. Effectuer des coupes congelés classiques en définissant l’intervalle de section à 7 µm. Laissez les échantillons sectionnés à attacher à la lame de verre sans rides ou air emprisonné.
    1. Stocker les lames à-80 ° C avant d’effectuer une coloration plus loin.
      Remarque : Différents intervalles peuvent servir aux besoins expérimentaux.
  3. Sécher à l’air les diapositives pendant 1 h à température ambiante.
  4. Permeabilize les échantillons avec du PBS contenant 0,5 % Triton X-100 pendant 15 min.
  5. Lavage des échantillons 3 x avec PBS pendant 10 min par lavage.
  6. Encercler les échantillons sur la diapositive avec barrières hydrophobes en utilisant un stylo barrière hydrophobe.
  7. Traiter les échantillons avec la solution de saturation (1 x PBS contenant 5 % d’albumine sérique bovine (BSA)), pendant 1 h à température ambiante.
  8. Appliquer 40 µL de solution primaire contenant des anticorps (1 x PBS contenant 5 % de BSA avec dilution au 1/100 de l’anticorps primaire) pour chaque échantillon sur la lame.
  9. Incuber les lames dans l’anticorps primaire à 37 ° C pendant 1 h ou à température ambiante pendant la nuit (le temps d’incubation et les conditions varient selon l’anticorps primaire).
  10. Les échantillons de lavage 3 x avec PBS pendant 15 min (par lavage).
  11. Appliquer 40 µL de solution de contenant des anticorps secondaire (1 x PBS contenant 5 % de la surface corporelle avec une dilution de 1 : 300 anticorps secondaire) pour chaque échantillon sur la lame.
  12. Les échantillons de lavage 3 x avec PBS pendant 15 min (par lavage).
  13. Tacher les échantillons avec Hoechst 33342 solution (1 µg/mL, dilué dans du PBS) à température ambiante pendant 10 min. Laver ensuite les échantillons avec du PBS pendant 5 min.
  14. Monter les échantillons avec support de montage et recouvrez-les de tailles appropriée des lamelles. Laissez les diapositives dans l’obscurité à température ambiante pendant 24 h et puis effectuez la microscopie confocale.

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Representative Results

Création de sphéroïde de tumeur invasive de la vessie cancer exige la formation des sphéroïdes Fluxsol tumeur de lignées cellulaires ou de tumeurs primaires. Figure 2 A montre des sphéroïdes Fluxsol développés à partir de quatre lignées cellulaires du cancer de la vessie humaine (UC9-UM, UM-UC13, UM-UC14, 253J et UM-UC18). Figure 2 B montre un sphéroïde de tumeur d’une tumeur de la vessie généré par BBN souris incorporée dans la matrice de collagène. Ces sphéroïdes sont intégrées comme décrit ci-dessus et images représentatives ont été capturées à l’aide d’un microscope équipé pour l’imagerie de cellules vivantes. Lentille de l’objectif 20 X était employé pour l’imagerie UC9-UM, UM-UC13, UM-UC14 et UM-UC18 sphéroïdes, tandis que les sphéroïdes de tumeur de vessie souris ont été examinés à l’aide de 5 X et 10 X lentilles de l’objectif.

Des images représentatives de vessie humaine cellule ligne sphéroïdes après 24 à 72 h (Figure 2A) et souris BBN vessie primaire tumeur sphéroïdes (Figure 2B) démontrent migration de cancer de la vessie dans la matrice de collagène. 253J, une lignée de cellules non invasif, restent en grande partie intacts avec peu ou pas de migration (Figure 2A). Vidéos 1, 2et 3 montrent le processus d’invasion Time-lapse pour UC9-UM, UM-UC13 et UM-UC14 sphéroïdes, respectivement. Vidéo 4 montre les propriétés d’invasion d’un sphéroïde de UM-UC18. 5 vidéo montre les deux zones de tumeur de vessie de souris de h 66 à 87 h collagène après incorporation.

Afin de démontrer la faisabilité d’utiliser immunofluorescence souillant des marqueurs protéiques dans notre sphéroïdes de tumeur invasive, ils étaient fixés et colorés à 24 ou 72 h. Figure 3 montre des échantillons représentatifs colorées pour groupe Ataxia-Telangiectasia D-Associated Protein (après le PMH, également connu sous le nom de TRIM29), une protéine qui joue un rôle important dans la progression de tumorigenèse et le cancer de vessie humaine et les cancers du pancréas9,10, tubulines (α et β), qui forment des microtubules et jouent un rôle clé dans l’élaboration de la cellule et le mouvement cellulaire11,12, la kératine 14 (KRT14), un marqueur épithélial basal impliqués dans l’invasion13et vimentine (VIM), un marqueur mésenchymateuses14,,15, 16. Ces images montrent que la visualisation des structures cellulaires et sous-cellulaires peut être effectuée à l’aide de cette méthodologie. L’avis de grossissement plus élevé de UM-UC14 montre filamenteux coloration pour après le PMH (Figure 3A). Les cellules très envahissantes diffusés de UM-UC18 sphéroïdes après 24 h d’invasion exprimer un niveau élevé de VIM, un marqueur de transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT, Figure 3B).

Incorporation de différents types de cellules (fibroblastes associés à cancer) dans les sphéroïdes de tumeur est faisable et fournit un moyen d’examiner les interactions cellule-cellule hétérologue (Figure 4 et 6 de la vidéo). Dans cet exemple nous avons utilisé des protéines (DP) de la fluorescence rouge-étiquetées de fibroblastes humains et le cancer de la vessie 253J cellule ligne transduite avec un vecteur d’expression de la protéine fluorescente verte (GFP). Ces cellules ont été mélangées à sphéroïdes de tumeur de forme et incorporés dans le collagène. Le processus d’invasion contrôlé par microscopie confocale. La figure 4 montre que l’interaction avec les fibroblastes peut moduler comportement envahissant de 253J.

La figure 5 illustre l’utilité de le système d’essai pour tester les inhibiteurs de l’invasion. Cytochalasine D est un inhibiteur connu de la migration cellulaire et l’invasion qui agit en inhibant la polymérisation de l’actine17,18 et a été utilisée à titre d’exemple. Cytochalasine D traitement inhibe l’invasion des sphéroïdes UM-UC9 (Figure 5A). La même concentration de cytochalasine D (0,2 µM) est capable d’inhiber partiellement invasion des mu-UC18 sphéroïdes (Figure 5B). Étant donné que le système peut être utilisé pour l’image de plusieurs puits et organoïdes tumeur en parallèle, il se prête à un groupe limité d’agents pharmacologiques pour effet sur l’invasion de dépistage.

Figure 1
Figure 1 : Configuration pour l’analyse 3D invasion avec l’imagerie de cellules vivantes. Aperçu schématique de (A) pour l’imagerie de cellules vivantes 3D et immunofluorescence. Lamelle couvre-objet (B) de la chambre avec le collagène et les supports utilisés dans cette expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Invasion de la vessie cancer sphéroïde. (A) exemples de vessie humaine du cancer cell line sphéroïdes noyées dans une matrice de gel de collagène. Sphéroïdes sont indiqués au moment de l’incorporation (0 h, rangée du haut) ou après 72 h (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14 253J) ou 24h (UM-UC18). Echelle = 50 µm. (B) souris induite sur les exemples de BBN vessie invasion tumorale dans la matrice de collagène. Les flèches indiquent le bord envahissant du sphéroïde de la tumeur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Analyse d’immunofluorescence des sphéroïdes de cancer de vessie. (A) UM-UC14 sphéroïde de tumeur après 72 h d’invasion du collagène. Des échantillons ont été colorées par dosage conventionnelles immunofluorescence pour après le PMH (vert), tubuline (violette) et noyaux (Hoechst tache bleu). Carré blanc indique la zone avec vue de grossissement plus élevé sur la droite deux panneaux de bas rang. Echelle = 50 µm. (B) UM-UC18 tumeur sphéroïdes colorées pour KRT14 (vert), VIM (rouge), après le PMH (violet) et noyaux (Hoechst tache bleu) après 24 h d’invasion du collagène. Echelle = 50 µm. carré blanc indique la zone supérieure vue grossissement indiqué dans le panneau de droite bas. Ligne pointillée indique approximativement la limite de l’ellipsoïde de tumeur originale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Sphéroïde de tumeur fluorescent marqué incorporant des fibroblastes. Invasion de GFP-étiqueté 253J cellules du cancer vésical seuls (panneaux inférieurs) ou de culture conjointement avec DP-étiqueté fibroblastes (panneaux supérieure) suivies pendant 24 h. échelle bar = 50 µm. Invasion est amélioré avec l’ajout des fibroblastes pour le système de culture (panneau supérieur). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Effet d’un petit médicament moléculaire ciblant la polymérisation de l’actine dans invasion. (A) UM-UC9 sphéroïde de tumeur traitée avec la cytochalasine D (0,2 µM) ou le DMSO (contrôle du véhicule) et surveillé pour sphéroïde de 72 h. (B) UM-UC18 tumeur traités par cytochalasine D ou le DMSO pendant 24 h. échelle bar = 50 µm. pointillé indique la limite de l’original sphéroïde. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Problème possible Solution recommandée
Faible nombre des sphéroïdes viables • Augmentation du nombre des cellules cultivées en suspension
• S’assurer > 90 % des cellules sont viables après typsinization
• Vérifier les cellules de contamination
• Maintenir les cellules en croissance logarithmique avant typsinizing
• Optimiser les milieux de culture cellulaire
• Modifier l’heure de la culture en condition de suspension
• Essayez de lignées cellulaires alternatifs
Sphéroïdes sont trop grand ou trop petit • Ajuster le nombre de cellules a ajouté à la plaque de fixation basse
• Utilisation douce de pipetage pour briser les agrégats de cellules plus gros
Difficile de se concentrer au cours de l’imaginer • Ajuster l’épaisseur de gel de collagène. Objectifs à courte distance de travail, essayez de faire le collagène plus mince de gel.
• Veiller à ce que la chambre diapositive ou la lamelle couvre-objet est #1.5
• Optimiser la taille des sphéroïdes (50 – 150 µm de diamètre)
Les cellules migrent hors de la zone d’imagerie au cours de l’essai de l’invasion • Réduire la taille des sphéroïdes
• Re-centrer la zone d’imagerie toutes les 24 h si nécessaire
• S’engager carrelage technologie d’imagerie (le cas échéant) afin de couvrir la plus grande surface
• Envisager l’utilisation de lignées cellulaires alternatifs
La diapositive de chambre se dessèche • S’assurer il n’y a pas de fuite dans le programme d’installation de la chambre climatique
• S’assurer que le mécanisme de contrôle de l’humidité est fonctionnel

Tableau 1 : Diagnostic du modèle 3D invasion.

Movie 1
Vidéo 1 : projection vidéo Time-lapse UM-UC9 sphéroïde cultivée en collagène de 0 à 72 h. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 2
Vidéo 2 : vidéo Time-lapse montre migration collective d’UM-UC13 sphéroïde cultivée en collagène de 0 à 72 h. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 3
Video 3 : vidéo Time-lapse de sphéroïde de UM-UC14 cultivée en collagène de 0 à 72 h. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 4
Video 4 : vidéo Time-lapse de UM-UC18 sphéroïde cultivée en collagène de 0 à 24 h. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 5
Video 5 : vidéo Time-lapse de tumeurs de vessie de souris induite par le BBN 66–h 84 collagène après incorporation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 6
6 vidéo : vidéo Time-lapse montrant sphéroïdes cancer formés à partir de cellules de GFP-étiqueté 253J mélangé avec DP-étiqueté les fibroblastes humains (à gauche) ou GFP-étiqueté 253J cellules seul (à droite). Sphéroïdes ont été incorporés dans le collagène et surveillés pendant 24 h. s’il vous plaît cliquez ici pour regarder cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

Nous décrivons ici un modèle de sphéroïde de tumeur 3D qui permet l’observation en temps réel de l’invasion de cancer de la vessie qui est essentielle pour la progression du cancer et des métastases. Ce système se prête à l’intégration des diverses composantes stromales et cellulaires pour permettre aux enquêteurs de rappel mieux le microenvironnement de tissu où s’effectue l’invasion du cancer de la vessie. Les sphéroïdes de cancer de la vessie peut provenir de diverses sources telles que les lignées cellulaires (y compris les lignées de cellules génétiquement modifiés utiles pour l’examen des voies qui affectent le processus d’invasion de signalisation) et de souris primaires tumeurs (décrits ici). Il peut éventuellement être également adaptés pour l’analyse de la tumeur primaire humain. Selon le système d’imagerie utilisé, la fluorescence peut être surveillé en temps réel ou par fixation et immunofluorescence souillant à divers moments. Le système peut également servir à tester des inhibiteurs potentiels d’invasion. Cela rend le système un outil puissant et polyvalent pour évaluer la biologie du cancer de la vessie.

Le système de microscopie confocale avec une chambre climatique qui prévoit le contrôle de la température, contrôle de l’humidité et l’approvisionnement de CO2 est une pièce maîtresse du matériel pour construire le modèle décrit dans le présent protocole.

Il a été largement rapporté que 3D cultures fournissent des micro-environnements spécialisées qui mieux imitent les tissus natifs pour cell biology et le cancer études19,20. De nombreuses études s’appuient sur les dosages d’insert membrane perméable qui ne reflètent pas les conditions qui invasion lieu in vivo. En outre, ces études classiques permettent suivi facile du processus invasion dans un mode en temps réel, ni une analyse détaillée des échantillons durant ou suivante invasion. Nous avons décrit un système qui est utile à la fois en temps réel et à l’interrogatoire de point de terminaison de la biologie du cancer invasif.

Collagène est un composant important de la matrice extracellulaire (ECM) et existe sous de nombreuses formes. Collagène de type 1 est la forme prédominante de collagène fibrillaire, tandis que le collagène de Type 4 est un collagène nonfibrillar qui composent la membrane basale21. Cellules cancéreuses doivent pénétrer la membrane basale et parcourir de collagène de type 1 au cours de la progression du non invasif et tumeurs invasives22. Compte tenu de son omniprésence dans l’ECM, collagène de type 1 a été utilisé comme matrice pour la construction de cultures 3D qui imitent le ECM mieux que les deux dimensions de la culture plat5,6,23. Alors que le système décrit ici est basée sur une matrice de collagène de type 1, il peut être modifié afin d’inclure d’autres constituants stromales repose sur une question expérimentale et besoin.

La méthodologie utilisée pour générer des sphéroïdes de cancer de la vessie de lignées cellulaires implique la culture de cellules dans des conditions de faible-attachement et agrégation cellulaire. Pas toutes les cellules peuvent tolérer ces conditions de culture, et certains peuvent subir l’apoptose ou la formation d’agrégats lâches qui dissocient durant le collagène intégrant des processus. Modifier le temps de la culture, numéro de cellulaire ou d’incorporer les autres types de cellules en suspension peut améliorer l’issue. Les lignées de cellules sélectionnées pour ce dosage dépendant de l’objectif de l’expérience. Nous avons utilisé avec succès cette technique avec des lignées de cellules cancéreuses vessie humaine unique 7j/7. Toutefois, il est possible que certaines lignées cellulaires peuvent ne pas convenir pour ce montage expérimental. En outre, certaines lignées cellulaires ont un phénotype très invasif, ce qui conduit à la dissociation précoce de sphéroïdes et les cellules cancéreuses se déplaçant hors de la zone d’observation au cours de l’expérience en Time-lapse. Des expériences pilotes pour comprendre le comportement général des lignées cellulaires sont fortement recommandés pour déterminer les meilleurs délais pour les études. Dépannage des problèmes courants avec génération de sphéroïde et l’imagerie est répertorié dans le tableau 1.

Ce système est adapté pour le dépistage limité des composés pharmacologiques avec potentiel d’invasion des cellules du cancer du bloc. Dans les présentes, nous avons utilisé la cytochalasine D, un inhibiteur perméable à la cellule de la polymérisation de l’actine, pour illustrer ce potentiel demande18. Comme indiqué ci-dessus, 0,2 µM de cytochalasine D inhibe efficacement l’invasion des mu-UC9 et UM-UC18 sphéroïdes. En utilisant des diapositives de chambres multiples et contrôle automatisé stade microscopique, l’effet de plusieurs composés sur l’invasion de tumeur sphéroïde est faisable.

Bien que ces tests sont les mieux adaptés pour décrire qualitativement le comportement envahissant, quantification de l’ampleur de la migration et l’invasion est également réalisable. Acquisition d’images des sphéroïdes au début de l’expérience et à divers moments et ultérieures image analyse pour mesurer la distance linéaire le plus éloignée de l’invasion en X, Y ou Z directions peuvent fournir de quantification du comportement migrateur envahissante. Analyse image plus avancés utilisant fluorescent étiquetés cellules pourrait servir à définir et à quantifier les cellules individuelles ou comportement de type cellule selon le besoin expérimental ou de la question.

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Disclosures

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire du Dr Howard Crawford (Université du Michigan) pour le support technique et mode de matériaux et équipements pour cette étude et Alan Kelleher pour le support technique.

Ce travail a été financé par des subventions de l’Université du Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01 a 1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
DMEM cell culture medium Thermo Fisher Scientific 11995065
Fetal bovine serum  Thermo Fisher Scientific 26140079
Antibiotic-Antimycotic (100x) Thermo Fisher Scientific 15240062
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3803
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4  Thermo Fisher Scientific 10010023
Costar Ultral-low attachment 6-well cluster  Corning 3471
Conventional inverted microscope  Carl Zeiss 491206-0001-000 General use for cell culture and checking spheroids
Collagen type 1 from rat tail, high concentration  Corning 354249
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155382
Confocal microscope  Carl Zeiss LSM800 A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function 
Cryostat micromtome Leica Biosystems CM3050 S
Zen 2 Image processing software  Carl Zeiss
Paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15710
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen Vector Laboratories  H4000
O.C.T compound  Thermo Fisher Scientific 23730571
Hoechst 33342 solution  Thermo Fisher Scientific 62249
Anti-ATDC (Trim29) antibody Sigma-Aldrich HPA020053
Anti-Cytokeratin 14 antibody Abcam ab7800
Anti-Vimentin antibody Abcam ab24525
ProLong Diamond  Mounting medium

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References

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Système de Culture cellulaire 3D pour étudier l’Invasion et l’évaluation thérapeutique dans le Cancer de la vessie
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Wang, Y., Day, M. L., Simeone, D. M., Palmbos, P. L. 3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer. J. Vis. Exp. (139), e58345, doi:10.3791/58345 (2018).

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