Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

3-D celle kultur-systemet for å studere invasjonen og evaluere legemiddelselskap i blærekreft

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/58345
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Departments of Internal Medicine, Hematology/Oncology Division, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 2Department of Urology, Division of GU Oncology, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 3Departments of Surgery and Pathology, Perlmutter Cancer Center, NYU Langone Health

Summary

Prosesser for blære kreft invasjonen representerer muligheter for biomarkør og terapeutiske utvikling. Her presenterer vi en blære kreft invasjonen modell som inkorporerer 3D kultur svulst spheroids, tidsinnstilt bildebehandling og AC confocal mikroskopi. Denne teknikken er nyttig for å definere funksjonene av invasiv og screening terapeutiske agenter.

Abstract

Blærekreft er en betydelig helseproblem. Det er anslått at mer enn 16.000 mennesker vil dø i år i USA fra blærekreft. Mens 75% av blære kreft er ikke-invasiv og neppe å metastase, videre ca 25% til en invasiv vekstmønster. Opp til halvparten av pasienter med invasiv kreft vil utvikle dødelige metastatisk tilbakefall. Forstå mekanismen av invasiv progresjon i blærekreft er derfor avgjørende å forutsi pasientens utfall og hindre dødelige metastaser. I denne artikkelen presenterer vi en tredimensjonal kreft invasjonen modell som lar innlemmelse av kreftceller og stromal komponenter å etterligne i vivo betingelser forekommer i blæren svulst microenvironment. Denne modellen gir mulighet til å observere invasiv prosessen i sanntid ved hjelp av tidsinnstilt bildebehandling, avhøre molekylær veier involvert med AC confocal immunofluorescent bildebehandling og skjermen forbindelser med potensial til å blokkere invasjonen. Mens denne protokollen fokuserer på blærekreft, er det sannsynlig at lignende metoder kan brukes til å undersøke invasjon og motilitet i andre svulst typer også.

Introduction

Invasjonen er et viktig skritt i kreft progresjon, som kreves for metastasering, og er forbundet med lavere overlevelse og dårlig prognose hos pasienter. I menneskelige blærekreft, vanligste malignancy av urinveiene som forårsaker ca 165,000 dødsfall per år over hele verden, er kreft stadium, behandling og prognose direkte relatert til tilstedeværelse eller fravær av invasjonen1. Rundt 75% av tilfellene av blærekreft administrert ikke-muskel invasiv og er av lokale resection. I kontrast, muskel-invasiv blære kreft (ca 25% av alle tilfeller) er aggressiv svulster med høye metastatisk og behandlet med aggressiv Multimodalitet terapi2,3. Derfor er forstå molekylær veier som utløser invasjonen avgjørende å bedre karakterisere risikoen for invasiv progresjon og utvikle terapeutiske tiltak som kan hindre invasiv progresjon.

Svulst invasiv progresjon skjer i komplekse tredimensjonale (3D) omgivelser og innebærer svulst celle interaksjon med andre kreftceller, stroma, kjelleren membran og andre typer cellene immunceller, fibroblaster, muskelceller og vaskulære endotelceller. Permeable støtte (f.eksTranswell) analysen systemer er ofte ansatt å quantitate kreft cellen invasjonen4, men disse systemene er begrenset fordi de ikke tillater mikroskopiske overvåking av invasjonen i sanntid og henting av prøver for ytterligere flekker og molekylære analyse er utfordrende. Utvikling av et 3D blæren svulst spheroid system å studere invasjonen er ønskelig fordi det tillater inkorporasjon av definerte microenvironmental komponenter av in vitro -systemer.

I denne protokollen, beskriver vi et system for å avhøre invasiv prosessene av menneskelig blære kreftceller ved hjelp av en 3D-formet invasjonen analysen omfatter kollagen-baserte gel matriser og AC confocal mikroskopi spesialopplæring for etterforskere overvåke celle motilitet og invasjonen i sanntid (figur 1A). Dette systemet er allsidig og kan endres for å avhøre ulike stromal/svulst innstillinger. Det kan ta de fleste blæren kreftcelle linjer eller primære blæren svulster og flere stromal celler som kreft tilhørende fibroblaster og immunceller5,6,7. Denne protokollen beskriver en matrise som består av type-1 kollagen, men kan endres for å innlemme andre molekyler som fibronectin, laminin eller andre kollagen proteiner. Invasiv prosesser kan følges for 72 h eller mer avhengig av evnen av mikroskopet og brukes. Fiksering og immunofluorescence flekker av svulsten innebygd i 3D-matrise før, under og etter invasjonen lar avhør av proteiner upregulated i invasiv celler, noe som gir viktig informasjon som vanligvis fraværende eller vanskelig å samle bruke andre 3D kultur modeller. Dette systemet kan også benyttes til skjermen forbindelser som blokkere invasjonen, samt avgrense signalveier påvirket av slike forbindelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voksende kreft Spheroids

  1. Vokser fra linjer
    1. Kultur menneskelige blære kreftceller under konvensjonelle tilhenger celle oppdrettsforholdene og opprettholde i et 37 ° C inkubator leveres med 5% CO2. Opprettholde cellene på < 90% confluency.
      Merk: kultur medier brukt er Dulbeccos endret minimum viktige medier (DMEM) som inneholder 4.5 g/L D-glukose, L-Glutamine, 110 mg/L natrium pyruvate, og leveres med 10% fosterets bovin serum (FBS) gjennom denne protokollen.
    2. En dag før starten av eksperimentet, trypsinize (ved hjelp av 0,25% Trypsin-EDTA) celler, kvantifisere celle konsentrasjon og distribuere 1 x 106 celler i 3 mL kultur medier i hver brønn av en 6-vel svært lav vedlegg plate.
    3. Inkuber celler i lav vedlegg forholdene på 37 ° C ≥16 h. Dette bør gi tilstrekkelig tid for cellene til samlet i spheroids for de fleste blæren kreftcelle linjer.
      Merk: Dannelsen av spheroids kan observeres av invertert lyse feltet mikroskop. Optimal størrelse og antall spheroids kan avhenge av personlige eksperimenter, men vi finner at spheroids med diameter fra 50 µm til 150 µm er generelt egnet for tidsinnstilt bildebehandling ved hjelp av en 20 X linsen.
    4. For å innlemme flere celletyper, for eksempel fibroblaster eller immunceller i spheroids, bland ønsket cellene kreftceller på ønsket forhold (1:1, 1:10, osv.) i en svært lav vedlegg plate og Inkuber på 37 ° C ≥16 h for at mikset-celle type spheroids.
  2. Vokser fra primære svulster
    Merk: Svulst spheroids kan også være avledet fra primære blæren svulsten kilder som svulster utviklet kreftfremkallende stoff-indusert blæren svulst modeller8. For eksempel blæren svulster genereres fra mus fed med N-butyl - N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN), kan høstes og hakket i små biter (ca 0,5 mm3) sterilt Kirurgiske instrumenter. Fordøyd primære eksempler på menneskelig blære kreft kan også bli studert i dette systemet.
    1. Samle og vaske 0,5 mm3 svulst stykker i 5 mL iskald fosfat-bufret saltvann (PBS). Sentrifugering 200 x g i 5 min på 4 ° C. Repeter dette vask en gang.
    2. Samle svulst med sentrifugering 200 x g i 10 min på 4 ° C. Fjern nedbryting og legge 5 mL av DMEM som inneholder 10% FBS. Overføre svulst spheroid/media blandingen til en 6-vel svært lav vedlegg plate. Inkuber ved 37 ° C i ≥16 h før innebygging i kollagen matrise (se trinn 2.3).

2. forberedelser 3D kultur kammeret

  1. Fortynne type-1 kollagen (avledet fra rotte hale) i DMEM som inneholder 10% FBS å gjøre en 2 mg/mL blanding i henhold til produsentens instruksjoner.
    1. Kort sagt, bland kollagen med riktig mengde 1 N NaOH løsning og DMEM ved mild pipettering basert på produsentens instruksjoner å oppnå Fysiologiske pH.
    2. Etter miksing kollagen og DMEM, raskt strøk brønnene kammer lysbildet (for de fleste programmer, kammer lysbilder med et antall 1.5 cover-glass er optimale) med kollagen-DMEM blandingen før størkning (200 µL/vel). Tillate belagt kammer lysbildet skal stasjonære ved romtemperatur i 15 min.
      Merk: Sammensetningen av kollagen-baserte matrise kan endres ved å legge til andre ekstracellulær matrix ingredienser, som fibronectin eller laminin, ifølge for eksperimentet.
  2. Forsiktig Pipetter 500 µL av mediet som inneholder spheroids (eller svulst stykker, hvis primære svulst prøven brukes) fra 6-vel svært lav vedlegg platen inn i en tom 1,5 mL microcentrifuge rør. Vent i 2 minutter å la spheroids bosette til bunnen av røret.
  3. Fjern forsiktig nedbryting fra røret. Forberede en tube type-1 kollagen (2 mg/mL) blandet med DMEM som inneholder 10% FBS og raskt legge til 500 µL av denne blandingen av spheroids. Forsiktig bland spheroids og kollagen av langsom pipettering.
  4. Legge til 250 µL av spheroids/kollagen blanding til et godt kollagen-pre-belagt kammer lysbilde. Tillate kollagen matrisen som inneholder spheroids å størkne helt (ca 30 min ved 37 ° C).
  5. Når kollagen matrix er styrket, legge 1 mL av DMEM som inneholder 10% FBS hver brønn (figur 1B). Inkuber kammer lysbildet i en 37 ° C inkubator leveres med 5% CO2 til du er klar for bildebehandling.

3. levende celle tidsinnstilt bildebehandling

  1. Slå på AC confocal mikroskopet følger produsentens instruksjoner og kontroller at klima kammeret når 37 ° C og leveres med 5% CO2.
    Merk: Vår mikroskop og kammer krever vanligvis 1 time å nå systemet likevekt.
  2. Nøye overføre kammer lysbildet til lysbildet adapter koblet til mikroskopet.
  3. Finn spheroids rundt med en lav makt-målsetting (f.eks5 X) og starte bildebehandling med høyere makt målet (i gjeldende protokollen, 20 X mål brukes for det meste av levende celle avbilding for sin bedre bildekvalitet).
    Merk: For primære blæren svulst prøver, 5 X og 10 X mål kan være nødvendig for å dekke større bildeområdet. For våre tidsinnstilt bildebehandling, tenkelig intervallet angis som 30 min og en Z-stakken brukes å image hele-formet. Vanligvis er avstanden mellom Z-skiver satt til 4 µm 20 X mål, og den totale avstanden av Z-aksen er rundt 200 µm. bilder kan fås med dic II og med fluorescens Hvis celler/vev havn fluorescerende protein markører.
  4. Utføre tidsinnstilt bildebehandling for 24-72 h.
    Merk: Varigheten avhenger av hvilken celle og behov for eksperimentet.

4. forberedelse av prøven blokk med kreft Spheroids frossent snitting

  1. Nøye løft blokken av kollagen gel og spheroids fra chamber lysbilder ved hjelp av små tang. Plass kollagen gel blokken i en plast histology mold.
  2. Skyll kollagen gel med 1 x PBS kort, og deretter fastsette den med 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS i 30 min ved romtemperatur.
    FORSIKTIG: PFA er potensielt karsinogen og bør behandles med forsiktighet.
  3. Vask kollagen gel med 1,5 mL 1 x PBS på en shaker i 15 min. Erstatt PBS og gjenta vask 3 x.
  4. Påfør et tynt lag (ca 3 mm) av optimal kutte temperatur (OCT) sammensatte å dekke bunnen av en ny plast histology mold. Plasser den faste og vasket kollagen gel på Tilpasningsverktøy sammensatte, deretter forsiktig legge hele gel ved å fylle formen med OCT sammensatte samtidig unngå dannelsen av eventuelle luftbobler i Tilpasningsverktøy for Office.
  5. La mold på 4 ° C i 1 time.
  6. Plassere mold som inneholder utvalg og OCT sammensatte på en 100 mm Petriskål flyter på flytende nitrogen. Kan prøve å flash-fryse helt.
  7. Lagre frosne eksempel blokken-80 ° c for fremtidig bruk.

5. immunofluorescence Imaging for frosne inndelte kreft Spheroids

  1. Overføre frosne eksempel blokken fra-80 ° C fryseren til 20 ° C Mysteriekammeret en kryostaten.
  2. Utføre vanlig frosne snittemetode ved å angi delen intervallet 7 µm. La inndelte prøver knytte til objektglass uten rynker eller fanget luft.
    1. Lagre lysbilder ved-80 ° C før du utfører ytterligere flekker.
      Merk: Ulike mellomrom kan brukes etter eksperimentelle behov.
  3. Luften tørr lysbildene 1t ved romtemperatur.
  4. Permeabilize prøvene med PBS med 0,5% Triton X-100 i 15 min.
  5. Vask eksempler 3 x med PBS i 10 min per vask.
  6. Omslutter prøvene på lysbildet med hydrofobe barrierer ved hjelp av en hydrofobe barriere penn.
  7. Behandle prøvene med blokkering løsning (1 x PBS inneholder 5% bovin serum albumin (BSA)), 1t ved romtemperatur.
  8. 40 µL av primære antistoff inneholder løsning (1 x PBS inneholder 5% BSA med 1: 100 fortynning av primære antistoff) gjelde hvert utvalg på lysbildet.
  9. Inkuber lysbildene i primære antistoff ved 37 ° C i 1 time eller ved romtemperatur over natten (inkubasjonstiden og vilkår varierer avhengig primære antistoff).
  10. Vask eksempler 3 x med PBS i 15 min (per vask).
  11. 40 µL av sekundær antistoff inneholder løsning (1 x PBS inneholder 5% av BSA med 1:300 sekundære antistoff fortynning) gjelde hvert utvalg på lysbildet.
  12. Vask eksempler 3 x med PBS i 15 min (per vask).
  13. Stain prøvene Hoechst 33342 løsning (1 µg/mL, fortynnet i PBS) ved romtemperatur for 10 min. Deretter vaskes prøver med PBS for 5 min.
  14. Montere prøvene med montering medium og dekke dem med riktig størrelse cover slips. La lysbildene i mørket ved romtemperatur for 24 timer og utfør deretter AC confocal mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket etablering av invasiv blære kreft svulst spheroid krever dannelsen av passende størrelse svulst spheroids linjer eller primære svulster. Figur 2 En viser riktig størrelse spheroids fra fire menneskelige blære kreft cellelinjer (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J og UM-UC18). Figur 2 B viser en svulst-formet av en BBN generert musen blæren svulst i kollagen matrise. Disse spheroids ble bygd inn som beskrevet ovenfor og representant bilder ble tatt ved hjelp av et mikroskop utstyrt for levende celle bildebehandling. Den 20 X linsen ble brukt for imaging UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14 og UM-UC18 spheroids, mens musen blæren svulst spheroids ble undersøkt bruker 5 X og 10 X målet linser.

Representant bilder av menneskelige blæren cellen linje spheroids etter 24-72 h (figur 2A) og mus BBN primære blæren svulst spheroids (figur 2B) vise blære kreft overføringen i kollagen matrix. 253J, en ikke-invasiv cellen linje, forblir stort sett intakt med liten eller ingen overføring (figur 2A). Videoer 1, 2og 3 viser time-lapse invasjonen prosessen for UM-UC9, UM-UC13 og UM-UC14 spheroids, henholdsvis. Video 4 viser invasjonen egenskapene for en UM-UC18-formet. Video 5 viser lavlandsområde med musen blæren svulst 66 h til 87 h etter kollagen innebygging.

For å demonstrere muligheten for å bruke immunofluorescence farging av protein markører i våre invasjonen svulst spheroids, var de faste og farget på 24 eller 72 h. Figur 3 viser representative utvalg farget for ataksi-Telangiectasia gruppe D-assosiert Protein (ATDC, også kjent som TRIM29), et protein som spiller en betydelig rolle i tumorigenesis og kreft progresjon av menneskelig blære og pancreatic kreft9,10, tubulins (α og β), som danner piskehale som henger og Spill en viktig rolle i utformingen av celler og mobilnettet bevegelse11,12, keratin 14 (KRT14), en basal epithelial markør involvert i invasjonen13og vimentin (VIM), en mesenchymal markør14,15, 16. Bildene viser at visualisering av mobilnettet og subcellular kan utføres med denne metoden. Høyere viser forstørrelse av UM-UC14 trådformede flekker for ATDC (Figur 3A). Svært invasiv cellene spres fra UM-UC18 spheroids etter 24 h invasjon express høy VIM, en markør av epitelial til mesenchymal overgang (EMT, Figur 3B).

Inkorporering av forskjellige celletyper (kreft-assosiert fibroblaster) svulst spheroids er mulig og gir en måte å undersøke heterologous celle-celle samhandlinger (Figur 4 og Video 6). I dette eksempelet vi brukte røde fluorescens protein (RFP)-merket menneskelig fibroblaster og 253J blærekreft celle linje transduced med en vektor for uttrykk for grønne fluorescerende protein (GFP). Disse cellene ble blandet til skjemaet svulst spheroids og innebygd i kollagen. Invasjonen prosessen overvåket av AC confocal mikroskopi. Figur 4 viser at interaksjon med fibroblaster kan modulere 253J's invasiv atferd.

Figur 5 viser verktøyet av analysen systemet teste hemmere av invasjonen. Cytochalasin D er en kjent hemmer av celle migrasjon og invasjonen som fungerer ved å blokkere begrepsordbok polymerisasjon17,18 og ble brukt som et eksempel. Cytochalasin D behandling inhibited invasjonen av UM-UC9 spheroids (figur 5et). Samme konsentrasjonen av cytochalasin D (0,2 µM) er kjøpedyktig delvis hemme invasjonen av UM-UC18 spheroids (figur 5B). Siden systemet kan brukes til flere brønner og svulst organoids parallelt, er det mottakelig for screening et begrenset panel av farmakologisk agenter for effekt på invasjonen.

Figure 1
Figur 1 : Oppsett for 3D invasjonen analysen med levende celle bildebehandling. (A) skjematisk oversikt for 3D levende celle bildebehandling og immunofluorescence. (B) dekkglassvæske kammer med kollagen og medier som brukes i dette eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Blære kreft spheroid invasjonen. (A) eksempler på menneskelig blære kreft cellen linje spheroids innebygd i en kollagen gel matrise. Spheroids vises på innebygging (0 h, øverste rad) eller etter 72 h (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J) eller 24 h (UM-UC18). Skala bar = 50 µm. (B) eksempler av BBN-indusert musen blæren svulst invasjonen i kollagen matrix. Pilene angir invasiv kanten av svulst-formet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Immunofluorescence analyse av invasiv blære kreft spheroids. (A) UM-UC14 svulst formet etter 72 h invasjon i kollagen. Prøvene var farget av konvensjonelle immunofluorescence analysen for ATDC (grønn), tubulin (fiolett) og kjerner (Hoechst flekken blå). Hvite firkanten angir området med høyere forstørrelse visningen vises i nederste rad rett to paneler. Skala bar = 50 µm. (B) UM-UC18 svulst spheroids farget for KRT14 (grønn), VIM (rød), ATDC (fiolett) og kjerner (Hoechst flekken blå) etter 24 h invasjon i kollagen. Skala bar = 50 µm. hvitt firkantet angir området med høyere forstørrelse visningen vises i nederste høyre panel. Stiplet linje angir omtrent grense for den opprinnelige svulsten-formet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Fluorescently-merket svulst spheroid omfatter fibroblaster. Invasjonen av GFP-merket 253J blære kreftceller alene (bunnen panel) eller co kulturperler med RFP-merket fibroblaster (topp panel) overvåkes for 24 h. skala bar = 50 µm. invasjonen er forbedret med tillegg av fibroblaster kultur systemet (topp panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Effekten av en liten molekylær narkotika målretting begrepsordbok polymerisasjon i invasjon. (A) UM-UC9 svulst spheroid behandlet med cytochalasin D (0,2 µM) eller DMSO (kjøretøy kontroll) og overvåkes for 72 h. (B) UM-UC18 svulst spheroid behandlet med cytochalasin D eller DMSO for 24 h. skala bar = 50 µm. stiplet linje angir grense for opprinnelige formet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mulig problem Anbefalt løsning
Lavt antall levedyktig spheroids • Øke antall celler kultivert i suspensjon
• Sikre > 90% celler er levedyktig etter typsinization
• Sjekk celler for forurensning
• Opprettholde celler i logaritmisk vekst før typsinizing
• Optimalisere celle kultur medier
• Endre kultur tiden i suspensjon tilstand
• Prøv alternative cellelinjer
Spheroids er for stor eller for liten • Juster antall celler lagt til lav vedlegg plate
• Bruk mild pipettering for å bryte ned større celle aggregater
Vanskelig å fokusere under forestille • Justere tykkelsen på kollagen gel. For mål med kort arbeidsavstand, prøv å gjøre kollagen gel tynnere.
• Kontroller at kammeret lysbildet eller dekkglassvæske er #1.5
• Optimalisere størrelsen på spheroids (50-150 µm i diameter)
Cellene migrerer av sonen tenkelig under invasjonen analysen • Redusere størrelsen på spheroids
• Nytt senter sonen tenkelig hver 24 h hvis nødvendig
• Engasjerende fliser bildeteknologi (hvis aktuelt) for å dekke større område
• Vurdere bruk av alternativ cellelinjer
Kammeret lysbildet tørker ut • Kontroller det er ingen lekkasje i klima kammer oppsettet
• Sikre fuktighet kontroll mekanisme fungerer

Tabell 1: Feilsøking 3D invasjonen modellen.

Movie 1
Video 1: Time-lapse video viser UM-UC9-formet kultivert i kollagen fra 0 til 72 h. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 2
Video 2: Time-lapse video som viser kollektive overføring av UM-UC13-formet kultivert i kollagen fra 0 til 72 h. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 3
Video 3: Time-lapse video av UM-UC14-formet kultivert i kollagen fra 0 til 72 h. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 4
Video 4: Time-lapse video av UM-UC18-formet kultivert i kollagen fra 0 til 24 h. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 5
Video 5: Time-lapse video av BBN-indusert musen blæren svulster 66-84 h etter kollagen innebygging. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 6
Video 6: Time-lapse video som viser kreft spheroids dannet fra GFP-merket 253J celler blandet med RFP-merket menneskelig fibroblaster (venstre) eller GFP-merket 253J celler alene (høyre). Spheroids var innebygd i kollagen og overvåkes for 24 h. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en 3D svulst spheroid modell som gjør at sanntid observasjon av blære kreft invasjonen som er kritisk for kreft progresjon og metastasering. Dette systemet er mottakelig for inkorporering av ulike stromal og cellulær komponenter slik at etterforskerne å bedre recapitulate vev microenvironment hvor blære kreft invasjonen finner sted. Blære kreft spheroids kan genereres fra ulike kilder som linjer (inkludert genmodifiserte cellelinjer nyttig for undersøkelse av signalnettverk trasé som påvirker invasjonen prosesser), og mus primære svulster (beskrevet her). Det kan potensielt også tilpasses for menneskelig primære svulst analyse. Avhengig av tenkelig systemet brukes, kan fluorescens overvåkes i sanntid eller fiksering og immunofluorescence flekker på ulike tidspunkt. Systemet kan også brukes til å teste potensielle hemmere av invasjonen. Dette gjør systemet et allsidig og kraftig verktøy for å vurdere blære kreft biologi.

AC confocal mikroskopi systemet med et klima kammer som gir temperatur, fuktighet kontroll og CO2 tilbudet er en viktig del av utstyret for å konstruere modellen beskrevet i denne protokollen.

Det har blitt mye rapportert at 3D kulturer gir spesialisert microenvironments som bedre etterligne innfødt vev for cellen biologi og kreft studier19,20. Mange studier er avhengige av gjennomtrengelig membran sett inn analyser som ikke reflekterer betingelsene under invasjonen som oppstår i vivo. Videre kan disse konvensjonelle studier verken enkel overvåking av invasjonen prosessen på sanntid måte, eller detaljert analyse av prøvene under eller følgende invasjon. Her vi beskrev et system som er nyttig for både sanntid og sluttpunktet avhør av invasiv kreft biologi.

Kollagen er en viktig komponent av ekstra mobil matrix (EFM), og finnes i mange former. Type-1 kollagen er den dominerende formen av fibrillar kollagen mens Type-4 kollagen er en nonfibrillar kollagen utgjør kjelleren membran21. Kreftceller må trenge kjelleren membranen og flytter gjennom type-1 kollagen under progresjon fra ikke-invasiv invasjonen svulst22. Gitt sin allestedsnærværende tilstedeværelse i ECM, har type-1 kollagen blitt brukt som matrise for å konstruere 3D kulturer som etterligner ECM bedre enn todimensjonal kultur parabol5,6,23. Mens systemet skissert her er basert på en type-1 kollagen matrise, det kan endres for å inkludere andre stromal bestanddeler basert på eksperimentelle spørsmål og trenger.

Metodene vi bruker til å generere blære kreft spheroids fra cellelinjer innebærer cellekultur i lav-vedlegg forhold og celle aggregering. Noen celler kan tåle disse oppdrettsforholdene og noen kan gjennomgår apoptose eller dannelse av løs aggregater som distansere under kollagen innebygging prosessen. Endre kultur tid, kan cellular antallet eller inkludere andre celletyper i suspensjon forbedre resultatet. Celle-linjene som er valgt for denne analysen er avhengig av målet for eksperimentet. Vi har brukt denne teknikken med 7/7 unike menneskelige blæren kreftcelle linjer. Det er imidlertid mulig at noen linjer ikke kan være egnet for eksperimentell installasjonen. Videre har noen linjer en svært invasiv fenotype, som fører til tidlig tilknytningene til spheroids og kreftceller flytte ut av observasjonen området under time-lapse eksperimentet. Piloten eksperimenter for å forstå hvordan cellelinjer anbefales sterkt å bestemme de beste tidsrammene for studier. Feilsøking for vanlige problemer med spheroid generasjon og bildebehandling er oppført i tabell 1.

Dette systemet er egnet for begrenset screening av farmakologisk forbindelser med potensial til å blokkere kreft cellen invasjon. Her brukte vi Cytochalasin D, en celle-permeable inhibitor av utgangen polymerisasjon, for å illustrere denne potensielle program18. Som vist ovenfor, hemmer 0,2 µM av cytochalasin D effektivt invasjonen av UM-UC9 og UM-UC18 spheroids. Ved å benytte flere kamre lysbilder og automatisert mikroskopiske scenen kontroll, er effekten av flere forbindelser på svulst spheroid invasjonen mulig.

Selv om disse analyser er best egnet til å beskrive kvalitativt invasiv virkemåten, er kvantifisering av omfanget av migrasjon og invasjonen også mulig. Oppkjøpet av bilder av spheroids i begynnelsen av eksperimentet og på ulike tidspunkt, og påfølgende bildeanalyse å måle lengst lineære avstanden invasjon i X, Y eller Z retninger kan gi kvantifisering av invasiv vandrende atferd. Mer avansert analyse bruke fluorescently merket cellene kan brukes til å definere og quantitate enkeltcelle eller celle type atferd avhengig av eksperimentelle behov eller spørsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke laboratorium av Dr. Howard Crawford (University of Michigan) for kundestøtte og formidling materialer og utstyr for denne studien, og Alan Kelleher for kundestøtte.

Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BKAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J
DMEM cell culture medium Thermo Fisher Scientific 11995065
Fetal bovine serum  Thermo Fisher Scientific 26140079
Antibiotic-Antimycotic (100x) Thermo Fisher Scientific 15240062
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3803
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4  Thermo Fisher Scientific 10010023
Costar Ultral-low attachment 6-well cluster  Corning 3471
Conventional inverted microscope  Carl Zeiss 491206-0001-000 General use for cell culture and checking spheroids
Collagen type 1 from rat tail, high concentration  Corning 354249
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass Thermo Fisher Scientific 155382
Confocal microscope  Carl Zeiss LSM800 A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function 
Cryostat micromtome Leica Biosystems CM3050 S
Zen 2 Image processing software  Carl Zeiss
Paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15710
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen Vector Laboratories  H4000
O.C.T compound  Thermo Fisher Scientific 23730571
Hoechst 33342 solution  Thermo Fisher Scientific 62249
Anti-ATDC (Trim29) antibody Sigma-Aldrich HPA020053
Anti-Cytokeratin 14 antibody Abcam ab7800
Anti-Vimentin antibody Abcam ab24525
ProLong Diamond  Mounting medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
  2. Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
  3. DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
  4. Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
  5. Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
  6. Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
  7. Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
  8. Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
  9. Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
  10. Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
  11. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  12. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
  13. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  14. Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
  15. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  16. Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
  17. Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
  18. Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
  19. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  20. Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
  21. LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
  22. Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
  23. Erler, J. T., Weaver, V. M. Three-dimensional context regulation of metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).

Tags

Kreftforskning problemet 139 blærekreft 3D kultur kollagen invasjon ekstracellulær matrix motilitet
3-D celle kultur-systemet for å studere invasjonen og evaluere legemiddelselskap i blærekreft
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Day, M. L., Simeone, D.… More

Wang, Y., Day, M. L., Simeone, D. M., Palmbos, P. L. 3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer. J. Vis. Exp. (139), e58345, doi:10.3791/58345 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter