Summary
Mesane kanseri istila yönetim süreçleri biyomarker ve terapötik geliştirme fırsatları temsil eder. Burada hangi 3-b kültür tümör pulcuklarının, hızlandırılmış görüntüleme ve confocal mikroskobu birleştirmek bir mesane kanseri istila modeli mevcut. Bu teknik invaziv işlem özelliklerini tanımlamak için ve terapötik ajanlar süzmek için yararlıdır.
Abstract
Mesane kanseri önemli sağlık sorunudur. Bu 16.000'den fazla insan mesane kanseri gelen Amerika Birleşik Devletleri'nde bu yıl ölecek tahmin edilmektedir. Mesane kanserleri % 75'i non-invaziv ve metastaz olası olsa da, yaklaşık % 25 için bir invazif büyüme desen ilerleme. İnvaziv kanser hastalarının yarısı kadar öldürücü metastatik nüks gelişecektir. Böylece, invaziv mesane kanseri ilerlemesinde mekanizmasını anlamak hasta sonuçları tahmin ve öldürücü Metastazlari önlemek çok önemlidir. Bu makalede, biz tümör hücreleri ve mesane tümörü microenvironment meydana gelen vivo içinde koşulları taklit stromal bileşenleri sağlayan bir üç boyutlu kanseri istila modeli mevcut. Bu model içinde gerçek zaman zaman hata Imaging'i kullanma invaziv işlem gözlemlemek, moleküler yollar blok işgali potansiyeline sahip confocal immünfloresan görüntüleme ve ekran bileşikleri kullanarak ilgili sorguya fırsatı sağlar. Bu iletişim kuralı mesane kanseri üzerinde duruluyor olsa da, benzer yöntemleri işgali ve motilite diğer tümör tipleri de incelemek için kullanılan olabilir muhtemeldir.
Introduction
İstila metastaz için gereklidir ve alt hayatta kalma ve hastalarda kötü prognoz ile ilişkili kanser ilerleme kritik bir adımdır. İnsan mesane kanseri, her yıl dünya çapında yaklaşık 165,000 ölümler neden olur idrar yolu en yaygın malignite kanser sahne, tedavi ve prognoz doğrudan Invasion1içinse ilişkilendirilir. Mesane kanseri vakalarının yaklaşık % 75'i olan ve olmayan-kas invaziv yerel rezeksiyon ile yönetilir. Buna ek olarak, kas invaziv mesane kanserleri (yaklaşık %25 tüm servis talepleri) yüksek metastatik oranları ile agresif tümör ve agresif mobil terapi2,3ile tedavi edilir. Bu nedenle, istila tetiklemek moleküler yolları anlamak daha iyi karakterize invaziv ilerleme riski ve invaziv ilerleme önleyebilirsiniz tedavi müdahaleler geliştirmek için önemlidir.
Tümör invaziv ilerleme bir karmaşık üç boyutlu (3-D) ortamında oluşur ve diğer tümör hücreleri, stroma, membran ve hücreleri bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, kas hücreleri de dahil olmak üzere diğer türleri ile tümör hücre etkileşimi içerir ve vasküler endotel hücreleri. Onlar gerçek zamanlı işgali sürecinde mikroskobik izleme izin vermemesi nedeniyle geçirgen destek (Örneğin, Transwell) tahlil sistemleri yaygın kanser hücre işgali4ama bu sistemleri quantitate için istihdam sınırlıdır ve daha fazla boyama ve moleküler analiz için numune alınmasını meydan okuyor. Tanımlanmış microenvironmental bileşenleri birleşme vitro sistemleri kolaylık sağlar çünkü işgal eğitim için 3-b mesane tümörü küresel sisteminin geliştirilmesi arzu edilir.
Bu protokol için biz müfettişler hücre hareketliliği izlemek izin vermek için kollajen tabanlı jel matrisler ve confocal mikroskobu birleştirilerek bir 3-b küresel işgal tahlil kullanarak insan mesane kanser hücrelerinin invaziv işlemler sorguya çekmek için bir sistem tarif ve gerçek zamanlı (Şekil 1A)'ı işgal. Bu sistem çok yönlü ve çeşitli stromal/tümör ayarları sorgulamak için değiştirilebilir. Fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri5,6,7kanser ilişkili gibi çoğu mesane kanseri hücre hatları veya birincil mesane tümörleri ve ek stromal hücreler ekleyebilirsiniz. Bu iletişim kuralı tip-1 kollajen oluşan bir matris açıklar, ancak diğer molekülleri fibronektin laminin veya diğer kollajen protein gibi dahil etmek için değiştirilebilir. İnvaziv işlemler için 72 saat veya daha uzun mikroskop ve kullanılan sistemi bağlı olarak izlenebilir. Fiksasyon ve 3-b matrix önce sırasında ve sonrasında işgal gömülü tümör ayirt boyama sağlar böylece çok önemli bilgiler genellikle yok veya toplamak zor sağlayan proteinler upregulated invaziv hücrelerdeki sorgulama diğer 3-b kültür modellerini kullanarak. Bu sistem ayrıca işgal engellemek ekran bileşikleri ve sinyal yollar böyle bileşikler tarafından etkilenen betimlemek için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. artan kanser pulcuklarının
-
Hücre satırlarından büyüyen
- Kültür insan mesane kanseri hücreleri geleneksel yapışık altında hücre kültür koşulları ve % 5 CO2ile sağlanan bir 37 ° C kuluçka korumak. Hücreleri korumak < % 90'ı confluency.
Not: kültür kullanılan ortam Dulbecco'nın 4,5 g/L D-glikoz, L-Glutamine, 110 mg/L sodyum pyruvate, içeren en az temel medya (DMEM) değiştiren ve % 10 fetal Sığır serum (FBS) boyunca bu iletişim kuralı ile birlikte değil. - Deneme, başlamadan önce bir gün trypsinize (% 0.25 kullanarak tripsin-EDTA) hücreleri, hücre konsantrasyonu ölçmek ve 1 x 106 hücreler her iyi 6-şey ultra düşük ek plaka 3 mL kültür ortamda dağıtabilir.
- ≥16 h için 37 ° C'de düşük ek koşullar hücrelerde kuluçkaya. Bu hücreler için yeterli zaman izin vermelidir pulcuklarının çoğu mesane kanseri hücre hatları için içine toplamak için.
Not: Pulcuklarının oluşumu ters parlak alan mikroskop tarafından görülebilir. Pulcuklarının sayısı ve en uygun boyutu üzerinde bireysel deney bağlı olabilir ama biz pulcuklarının 50 µm fan çapı 150 µm için genellikle 20 X objektif lens kullanarak zaman hata görüntüleme için uygun olduğunu öğrenin. - Fibroblastlar veya pulcuklarının içine bağışıklık hücreleri gibi ek hücre türleri dahil etmek istediğiniz hücreleri kanser hücrelerinin istenilen oranında ile karıştırın (1:1, 1:10, vb.) ultra düşük bir ekinde plaka ve 37 ° c ≥16 h oluşumu izin vermek için kuluçkaya karma hücre türü pulcuklarının.
- Kültür insan mesane kanseri hücreleri geleneksel yapışık altında hücre kültür koşulları ve % 5 CO2ile sağlanan bir 37 ° C kuluçka korumak. Hücreleri korumak < % 90'ı confluency.
-
Birincil tümörler büyüyor
Not: tümör pulcuklarının-da var elde birincil mesane tümörü kaynakları kanserojen kaynaklı mesane tümörü modelleri8geliştirilen tümör gibi. Örneğin, fare oluşturulan mesane tümörleri N ile beslenen-butil - N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN), hasat ve steril cerrahi aletler kullanarak küçük parçalar halinde (yaklaşık 0,5 mm3) kıyılmış. Birincil insan mesane kanserleri Ayrıca bu sistemde okudu olabilir örnekleri sindirilir.- Toplamak ve 0,5 mm3 tümör adet 5 mL buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) yıkayın. Santrifüjü 200 x g 4 ° C'de 5 min için de Bir kez bu çamaşır tekrarlayın.
- Santrifüjü 200 x g 4 ° C'de 10 dakika için de tarafından tümör parçaları toplamak Süpernatant kaldırın ve 5 mL % 10 içeren DMEM de ekleyin FBS. Tümör küresel/medya karışımı bir 6-şey ultra düşük ek tabağa aktarın. ≥16 kollajen matris gömme önce s için 37 ° C'de kuluçkaya (bkz. Adım 2.3).
2. 3-b kültür odası hazırlanması
-
Tip-1 kollajen (sıçan kuyruk türetilmiş) % 10 içeren DMEM seyreltik FBS üreticinin yönergelerine uygun 2 mg/mL karışım yapmak.
- Kısacası, 1 N NaOH çözüm uygun miktarda kolajen mix ve nazik pipetting tarafından DMEM fizyolojik pH elde etmek için üreticinin talimatlarına dayalı.
- (Çoğu uygulama, bir numara 1.5-cam ile odası slaytlar için en uygun) kolajen ve DMEM karıştırma sonra hızlı bir şekilde odası slayt kuyu kat katılaşma (200 µL/de) önce kollajen-DMEM karışımı ile. 15 dakika oda sıcaklığında sabit olmak kaplı odası slayt izin.
Not: Kollajen tabanlı matris bileşimi fibronektin veya laminin, gibi diğer hücre dışı matriks maddeler ekleyerek deney amaçlı göre değiştirilebilir.
- Yavaşça damlalıklı 500 µL pulcuklarının (veya tümör parçaları, birincil tümör örnek kullandıysanız) 6-şey ultra düşük ek tabaktan bir boş 1.5 mL microcentrifuge tüpüne içeren medya. Tüp altına yerleşmek pulcuklarının izin için 2 dakika bekleyin.
- Dikkatli bir şekilde süpernatant tüpünden çıkarın. Başka bir tüp tip-1 kollajen (2 mg/mL) % 10 içeren DMEM ile karışık hazırlamak FBS ve hızlı bir şekilde bu karışımdan 500 µL pulcuklarının için ekleyin. Pulcuklarının ve kollajen yavaş pipetting tarafından karışımı yavaşça.
- 250 µL pulcuklarının/kollajen karışımı kollajen-pre-kaplı odası slayt bir kuyu için ekleyin. Tamamen katılaşmaya pulcuklarının içeren kollajen matris (yaklaşık 30 dk 37 ° C'de) izin verir.
- Kollajen matris katılaşmış sonra % 10 içeren DMEM 1 mL ekleyin FBS her şey (Şekil 1B) için. Odası slayt görüntüleme için hazır kadar % 5 CO2 ile sağlanan bir 37 ° C kuluçka kuluçkaya.
3. canlı hücre zaman hata görüntüleme
- Üreticinin yönergelerini izleyerek confocal mikroskobunun açmak ve iklim odası 37 ° C ulaşır ve % 5 CO2ile sağlanan emin olun.
Not: Bizim mikroskobu ve odası genellikle sistem denge ulaşmak için 1 h gereklidir. - Dikkatle odası slayt için mikroskop ekli slayt adaptör aktarın.
- Bir düşük güç hedefi (Örneğin, 5 X) kullanarak ilgi pulcuklarının bulun ve görüntüleme daha yüksek güç amacı ile başlangıç (geçerli iletişim kuralında, 20 X amaç çoğu daha iyi görüntü kalitesi için canlı hücre görüntüleme için kullanılır).
Not: birincil mesane tümörü örnekleri için 5 X ve 10 X hedefleri daha büyük görüntüleme alanını karşılamak için gerekli olabilir. Bizim hızlandırılmış görüntüleme için görüntüleme aralığı 30 dk ayarlanır ve Z yığın tüm küresel görüntü için kullanılır. Hücre/doku floresan protein işaretleri liman genellikle Z-dilimler arasındaki uzaklığı 4 µm için 20 X objektif ve Z ekseni toplam uzunluğu yaklaşık 200 µm. resimler DIC kullanılarak elde edilebilir için ve floresan ile küme. - Hızlandırılmış görüntüleme 24-72 saat için gerçekleştirin.
Not: Süresi hücre türüne ve deneme ihtiyaçlarına göre belirlenir.
4. örnek blok dondurulmuş doku kesit için kanser pulcuklarının içeren hazırlanması
- Dikkatle kollajen jel ve pulcuklarının odası slaytlardan bloğunu küçük forseps kullanarak kaldırın. Kollajen jel blok bir plastik Histoloji kalıp içine yerleştirin.
- Kısaca kollajen jel 1 x PBS ile durulayın ve sonra %4 paraformaldehyde (PFA) ile PBS içinde oda sıcaklığında 30 dk için düzeltebilirim.
Dikkat: PFA olası kanserojen olduğu ve dikkatle ele alınmalıdır. - PBS kollajen jel 1,5 mL 1 x PBS üzerinde 15 dk. eski yerine koymak için bir shaker ile yıkama ve önceki yıkama 3 x arasındaki adımları yineleyin.
- İnce bir tabaka (yaklaşık 3 mm) en uygun kesme sıcaklığı (OCT) yeni bir plastik Histoloji kalıp alt kapak bileşik uygulayın. Sabit yerleştirin ve kollajen jel OKT üstüne bileşik yıkanmış, sonra dikkatlice bütün jel OCT herhangi bir hava kabarcıklarının oluşumunu OCT'de kaçınırken bileşik ile kalıp doldurarak embed.
- 1s için 4 ° C'de kalıp bırakın.
- Örnek ve OCT bileşik üzerinde 100 mm Petri kabına sıvı azot üzerinde yüzen içeren kalıp yerleştirin. Tamamen flaş dondurma örnek sağlar.
- Donmuş örnek blok ileride kullanmak üzere-80 ° C'de depolayın.
5. ayirt görüntüleme için dondurulmuş kesitli kanser pulcuklarının
- Donmuş örnek blok-80 ° C dondurucudan bir cryostat-20 ° C odasına aktar.
-
Geleneksel donmuş 7 µm için bölüm aralığını ayarlayarak kesit gerçekleştirin. Kesitli örnekleri kırışıklık olmadan cam slayt eklemek izin veya hava tuzağa.
- Slaytları-80 ° C'de daha fazla boyama yapmadan önce depolama.
Not: Deneysel ihtiyaçlarına uygun farklı aralıkları kullanılabilir.
- Slaytları-80 ° C'de daha fazla boyama yapmadan önce depolama.
- Hava kuru oda sıcaklığında 1 h için slaytlar.
- Örnekleri % 0.5 içeren PBS ile permeabilize Triton X-100 15 dakika.
- Yıkama yıkama başına 10 min için PBS ile 3 x örnekler.
- Örnekleri ile hidrofobik engelleri slaytta bir hidrofobik bariyer kalemi çevreler.
- Örnekleri engelleme solüsyonu (%5 Sığır serum albumin (BSA) içeren 1 x PBS), muamele etmek, oda sıcaklığında 1 h için.
- Birincil antikor içeren çözüm (%5 BSA ile 1: 100 seyreltme, birincil antikor içeren 1 x PBS) 40 µL slaytta yer alan her örnek için geçerli.
- Birincil antikor için 1 h 37 ° C'de veya oda sıcaklığında (kuluçka zaman ve koşullar birincil antikor bağlı olarak değişir) bir gecede slaytları kuluçkaya.
- Yıkama PBS ile 3 x 15 dk (başına yıkama) için örnekler.
- İkincil antikor içeren çözüm (1 x PBS BSA % 5 ile 1:300 ikincil antikor seyreltme içeren) 40 µL slaytta yer alan her örnek için geçerli.
- Yıkama PBS ile 3 x 15 dk (başına yıkama) için örnekler.
- Höchst 33342 çözüm (1 µg/PBS içinde seyreltilmiş mL,) ile örnekleri, oda sıcaklığında 10 dakika için leke. Sonra PBS ile 5 min için örnekleri yıkayın.
- Örnekleri ile montaj orta dağ ve bunları uygun şekilde boy kapak torbalarla kapatın. Slaytları, oda sıcaklığında 24 h için karanlıkta bırakın ve sonra confocal mikroskobu gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnvaziv mesane kanseri tümörü küresel başarılı oluşturulmasını uygun boy tümör pulcuklarının hücre hatlarından veya birincil tümör oluşumu gerektirir. Resim 2 A uygun ölçekli pulcuklarının dört insan mesane kanseri hücre satırlarından (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J ve UM-UC18) geliştirilen gösterir. Resim 2 B bir tümör küresel kollajen matris içinde gömülü bir BBN tarafından oluşturulan fare mesane tümörü üzerinden gösterir. Bu pulcuklarının yukarıda açıklandığı gibi gömülü ve temsilcisi görüntüleri canlı hücre görüntüleme için donatılmış bir mikroskop kullanarak ele geçirildi. Fare mesane tümörü pulcuklarının 5 X ve 10 X objektif lens kullanan incelenmiş ise 20 X objektif lens UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14 ve UM-UC18 pulcuklarının, görüntüleme için kullanıldı.
İnsan mesane hücre satırı pulcuklarının 24-72 h (Şekil 2A) sonra temsilcisi görüntüleri ve fare BBN birincil mesane tümörü pulcuklarının (Şekil 2B) mesane kanseri geçiş kollajen matris içine göstermektedir. 253J, non-invaziv hücre kültürünü, az veya hiç geçiş (Şekil 2A) ile büyük oranda sağlam kalır. Videolar 1, 2ve 3 hızlandırılmış işgal işlem UM-UC9, UM-UC13 ve UM-UC14 pulcuklarının, sırasıyla göstermektedir. Video 4 UM-UC18 küresel işgal özelliklerini gösterir. Video 5 66 h fare mesane tümörü 87 h sonrası kolajen katıştırma için iki alanı gösterir.
Bizim invaziv tümör pulcuklarının protein işaretlerinin ayirt boyama kullanarak fizibilite göstermek için onlar sabit ve ataksi telanjiektazi grubu için temsil edici örneklerini lekeli 24 veya 72 h. Şekil 3 gösterir lekeli D-Associated Protein (ATDC, TRIM29 olarak da bilinir), insan kesesi ve pankreas kanserlerinin9,10, mikrotübüller oluşturan tubulins (α ve β), tumorigenesis ve kanser ilerlemesinde önemli bir rol oynayan bir protein ve hücre ve hücresel hareketi11,12, keratin 14 (KRT14), bazal epitelyal işareti işgal13ve'yı vimentin (VIM), bir mezenkimal marker14,15şekillenmesinde önemli rol oynar, 16. Bu görüntüleri görselleştirme hücresel ve hücre altı yapıları Bu metodoloji kullanarak gerkçekleştirilen göstermektedir. UM-UC14 daha yüksek büyütme görünümünü ATDC (Şekil 3A) boyama ipliksi gösterir. UM-UC18 pulcuklarının işgalinin 24 h hızlı sonra VIM, bir işaretleyici (EMT, Şekil 3B) epitel-için-mezenkimal geçişin yüksek düzeyde Dissemine son derece invaziv hücreleri.
Farklı hücre tipleri (kanser ilişkili fibroblastlar) birleşme tümör pulcuklarının içine mümkün olduğunu ve kapaklı hücre-hücre etkileşimleri (Şekil 4 ve Video 6) incelemek için bir yol sağlar. Bu örnekte kullandığımız kırmızı floresans protein (RFP)-etiketli insan fibroblast ve 253J mesane kanseri hücre satırı bir vektör yeşil flüoresan protein (GFP) ifade ile transduced. Bu hücreler formu tümör pulcuklarının için karışık ve kollajen gömülü. Confocal mikroskobu tarafından izlenen işgal işlem. Şekil 4 fibroblastlar ile etkileşim 253J'ın invaziv davranış modüle gösterir.
Şekil 5 inhibitörleri işgalinin sınamak için tahlil sistem yarar gösterir. Cytochalasin D bilinen inhibitörü olan hücre göç ve aktin polimerizasyon17,18 engelleyerek geçecek olan ve, bir örnek olarak kullanılan işgal olduğunu. Cytochalasin D tedavi UM-UC9 pulcuklarının (Şekil 5A) işgali inhibe. Cytochalasin D aynı konsantrasyonu (0.2 µM) kısmen UM-UC18 pulcuklarının (Şekil 5B) işgali inhibe edebilir. Sistem birden çok kuyu ve tümör organoids paralel görüntü için kullanılabilir olduğundan, sınırlı bir panel işgali üzerinde etkisi için farmakolojik ajanların eleme için mükellef.
Resim 1 : Kurulum için 3-b işgal tahlil canlı hücre görüntüleme ile. (A)için 3-b canlı hücre görüntüleme ve ayirt Şematik Özeti. (B) Coverslip odası kollajen ve bu deneyde kullanılan medya ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Mesane kanseri küresel istilası. (A)örnek insan mesane kanseri hücre satırı pulcuklarının kollajen jel dizey içinde gömülü olarak. Pulcuklarının (0 h, üst satır) katıştırma veya 72 h (UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, 253J) sonra veya 24 h (UM-UC18) anda gösterilir. Ölçek çubuğu 50 µm. (B) örnekler BBN kaynaklı fare mesane tümörü işgali kollajen matris içine =. Oklar tümör küresel invaziv kenarına gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : İnvaziv mesane kanseri pulcuklarının ayirt analizi. (A)UM-UC14 tümör küresel kollajen içine işgalinin 72 saat sonra. Örnekleri tarafından geleneksel ayirt tahlil ATDC (yeşil), tübülin (menekşe) ve çekirdek (Höchst leke mavi) için lekeli. Beyaz kare alt satır şu iki panel gösterilen yüksek büyütme manzaralı bölgeyi gösterir. Ölçek çubuğu KRT14 (yeşil), kollajen içine işgalinin 24 saat sonra VIM (kırmızı), ATDC (mor) ve çekirdek (Höchst leke mavi) lekeli 50 µm. (B) UM-UC18 tümör pulcuklarının =. Ölçek çubuğu = 50 µm. beyaz kare gösterir alanının alt sağdaki bölmede gösterilen yüksek büyütme manzaralı. Kesikli çizgi kabaca orijinal tümör küresel sınırını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Fibroblast birleşmeyle fluorescently etiketli tümör küresel. GFP etiketli 253J mesane kanseri hücreleri tek başına (alt paneller) işgali veya 24 h ölçek için izlenen RFP etiketli fibroblastlar (üst panelleri) ile birlikte kültürlü çubuk 50 = Gelişmiş fibroblastlar (üst panel) kültür sisteme eklenmesi ile µm. işgal. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Aktin polimerizasyon Invasion hedefleme küçük moleküler ilacın etkisi. (A)UM-UC9 tümör küresel cytochalasin D ile tedavi (0.2 µM) veya DMSO (araç kontrol) ve 72 h. (B) UM-UC18 tümör küresel cytochalasin ile D veya DMSO 24 h ölçek için tedavi için izlenen bar = 50 µm. kesikli çizgi gösterir orijinal sınır küresel. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Olası bir sorun | Önerilen çözüm |
| Uygun pulcuklarının az sayıda | • Artış süspansiyon kültürlü hücre sayısı • Emin olun > % 90 hücreleri typsinization sonra uygun • Onay hücreleri kirlenme için • Typsinizing önce Logaritmik büyüme hücreleri korumak • Hücre kültür medya en iyi duruma getirme • Kültür zaman süspansiyon durumda değiştirmek • Alternatif hücre hatları deneyin |
| Çok büyük veya çok küçük pulcuklarının | • Düşük ek plakasına eklendi hücre sayısını ayarlamak • Kullanım büyük hücre toplamları kırmak için pipetting nazik |
| Odak sırasında hayal etmek zor | • Kolajen jel kalınlığını ayarlayın. Kısa çalışma mesafesi ile hedefleri için daha ince jel kollajen yapmayı deneyin. • Odası slayt veya coverslip #1.5 olduğundan emin olun • Pulcuklarının (çapı 50-150 µm) boyutunu optimize |
| Hücreleri istila tahlil sırasında görüntüleme bölgeden göç | • Pulcuklarının boyutunu küçültün • Yeniden gerekirse görüntüleme bölge her 24 saat Merkezi • Çekici döşeme görüntüleme teknolojisi (varsa) daha büyük alanı kapsayacak şekilde • Alternatif hücre hatları kullanmayı düşünün |
| Odası slayt kurur | • Emin olun iklim odası kurulumunda hiçbir sızıntı olduğunu • Emin olun nem kontrol mekanizması çalışır durumda |
Tablo 1: 3-b işgal modeli sorun giderme.
Video 1: 72 h. için 0 kollajen kültürlü Time-lapse video gösteren UM-UC9 küresel Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 2: 72 h. için 0 kollajen kültürlü UM-UC13 küresel toplu göç gösterilen hızlandırılmış video Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 3: UM-UC14 küresel 72 h. için 0 kollajen kültürlü hızlandırılmış video Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 4: 24 h için 0 kollajen kültürlü UM-UC18 küresel hızlandırılmış video Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 5: fare BBN kaynaklı mesane tümörlerinin 66 hızlandırılmış video-sonrası kolajen 84 h katıştırma. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 6: hızlandırılmış video GFP etiketli 253J hücrelerden oluşan kanser pulcuklarının gösterilen karışık RFP etiketli insan fibroblast ile (solda) veya GFP etiketli 253J hücreleri tek başına (sağ). Pulcuklarının kolajen gömülü ve 24 h için lütfen buraya tıklayın Bu videoyu izlemek için izlenir. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada kanser ilerlemesi ve metastaz için kritik olan mesane kanseri işgalinin gerçek zamanlı gözlem izin veren bir 3-b tümör küresel modeli açıklar. Bu sistem daha iyi özetlemek için Müfettişler nerede mesane kanseri istila gerçekleşir doku microenvironment izin vermek için çeşitli stromal ve hücresel bileşenleri birleşme için mükellef. Mesane kanseri pulcuklarının hücre hatları (genetiği değiştirilmiş hücre hatları işgali süreçleri etkiler yolları sinyal sınav için yararlı da dahil olmak üzere) gibi çeşitli kaynaklardan oluşturulan ve birincil fare (burada açıklanan) tümörler. Zararlı olabilir Ayrıca insan birincil tümör analiz için adapte. Kullanılan görüntüleme sistemine bağlı olarak, floresans gerçek zamanlı veya fiksasyon ve çeşitli zaman noktalarda boyama ayirt tarafından izlenebilir. Sistem işgalinin potansiyel inhibitörleri sınamak için de kullanılabilir. Bu sistem mesane kanseri biyoloji değerlendirmek için çok yönlü ve güçlü bir araç yapar.
Ekipman bu protokol için açıklanan model oluşturmak için anahtar bir parçası ile sıcaklık kontrolü, nem kontrol ve CO2 kaynağı sağlayan bir iklim odası confocal mikroskobu sistemidir.
3-b kültürleri daha iyi taklit yerel doku hücre biyolojisi ve kanser araştırmaları19,20özel microenvironments sağlamak yaygın olarak bildirilmiştir. Birçok çalışma koşulları hangi işgal altında vivo içindeoluşur yansıtan değil geçirgen membran Ekle deneyleri üzerinde güveniyor. Ayrıca, geleneksel bu çalışmalar ne kolay bir gerçek zamanlı moda işgali sürecinde izlenmesi, ne de ayrıntılı bir analiz örnekleri sırasında veya aşağıdaki istila sağlar. Gerçek zamanlı her ikisi için yararlı olan bir sistem burada açıkladığımız ve bitiş noktası sorgulama invaziv kanser biyoloji.
Kollajen ekstra hücresel Matrix (ECM) önemli bir bileşenidir ve çeşitli biçimlerde bulunmaktadır. Tip-4 kollajen kadar membran21yapım bir nonfibrillar kollajen ise tip-1 kollajen fibriler kollajen baskın şeklidir. Kanser hücrelerinin membran nüfuz ve tip-1 kollajen ilerleme sırasında--dan non-invaziv invaziv tümörlerin22' ye taşımak gerekir. Her yerde varlığını ECM içinde göz önüne alındığında, tip-1 kollajen matris ECM iki boyutlu kültür çanak5,6,23daha iyi taklit 3-b kültürler oluşturmak için kullanılmıştır. Burada özetlenen sistem durumdayken bir tip-1 kollajen matris dayalı bu deneysel soru üzerine dayalı diğer stromal bileşenlerinin içerecek şekilde değiştirilmiş ve gerekir.
Mesane kanseri pulcuklarının hücre satırlarını oluşturmak için kullandığımız metodoloji hücre kültürü düşük-ek koşullar ve hücre toplama içerir. Tüm hücreleri bu kültür koşullar tolere edebilir ve bazı apoptosis veya katıştırma işlemi kollajen sırasında ayırmak gevşek toplamları oluşumu meydana gelebilir. Kültür zaman değiştirme, Aradığınız numara veya diğer hücre tipleri süspansiyon içeren sonuç artırabilir. Bu tahlil için seçilen hücre satırları denemenin amacı bağlıdır. 7/7 benzersiz insan mesane kanseri hücre hatları ile bu tekniği başarıyla kullanmıştır. Ancak, bazı hücre hatları deneysel bu kurulum için uygun olmayabilir mümkündür. Ayrıca, bazı hücre hatları pulcuklarının ve kanser hücrelerinin gözlem alanı dışında hızlandırılmış deneme sırasında hareket erken disassociation yol açar bir çok invaziv fenotip var. Hücre hatları genel davranışını anlamak için pilot deney çalışmaları için en iyi zaman dilimlerini belirlemek için kesinlikle önerilir. Küresel oluşturma ve görüntüleme ile ilgili ortak sorunları için sorun giderme Tablo 1' de listelenmiştir.
Bu sistem blok kanser hücre işgal potansiyeli olan farmakolojik bileşiklerin sınırlı tarama için uygundur. Burada Cytochalasin D, aktin polimerizasyonu, hücre geçirgen bir önleyici bu potansiyel uygulama18göstermek için kullanılan. Yukarıda gösterildiği gibi cytochalasin D 0.2 µM UM-UC9 ve UM-UC18 pulcuklarının işgali etkili bir şekilde engeller. Çoklu chambers slaytlar ve otomatik mikroskobik sahne denetimi kullanarak, birden çok bileşikleri etkisi tümör küresel işgal mümkün olabilir.
Bu deneyleri niteliksel invaziv davranışı açıklamak için en uygun olmakla birlikte, göç ve işgal ölçüde miktar da mümkün olabilir. Pulcuklarının başında deney ve çeşitli zaman noktalarında ve sonraki görüntülerini edinimi görüntü analiz x işgalinin en uzak doğrusal mesafe ölçmek için Y veya Z yönde miktar invaziv göçmen davranışının sağlayabilir. Daha gelişmiş görüntü analizi ile fluorescently etiketli hücreleri tek hücre veya hücre türü davranışını deneysel ihtiyaç veya soru bağlı olarak quantitate ve tanımlamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar Dr Howard Crawford (Michigan Üniversitesi) laboratuvar teknik destek ve sağlayan malzemeler ve bu çalışma için donatım ve teknik destek için Alan Kelleher için teşekkür etmek istiyorum.
Bu eser Üniversitesi Michigan Rogel Kanser Merkezi çekirdek Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PIP), bBu YIA (PIP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS)'nden hibe tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| DMEM cell culture medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Ultral-low attachment 6-well cluster | Corning | 3471 | |
| Conventional inverted microscope | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | General use for cell culture and checking spheroids |
| Collagen type 1 from rat tail, high concentration | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM800 | A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function |
| Cryostat micromtome | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Image processing software | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T compound | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anti-ATDC (Trim29) antibody | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anti-Cytokeratin 14 antibody | Abcam | ab7800 | |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | Mounting medium |
References
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. American Family Physician. American Family Physician. 96 (8), 507-514 (2017).
- Repesh, L. A. A new in vitro. assay for quantitating tumor cell invasion. Invasion Metastasis. 9 (3), 192-208 (1989).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional culture system as a model for studying cancer cell invasion capacity and anticancer drug sensitivity. Anticancer Research. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q., Messadi, D. V. A novel 3-dimensional culture system as an in vitro. model for studying oral cancer cell invasion. International Journal of Expermintal Pathology. 86 (6), 365-374 (2005).
- Rebelo, S. P., et al. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. , 185-197 (2018).
- Vasconcelos-Nobrega, C., Colaco, A., Lopes, C., Oliveira, P. A. Review: BBN as an urothelial carcinogen. In Vivo. 26 (4), 727-739 (2012).
- Palmbos, P. L., et al. ATDC/TRIM29 Drives Invasive Bladder Cancer Formation through miRNA-Mediated and Epigenetic Mechanisms. Cancer Research. 75 (23), 5155-5166 (2015).
- Wang, L., et al. ATDC induces an invasive switch in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis. Genes & Development. 29 (2), 171-183 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (12), 711-726 (2015).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Kidd, M. E., Shumaker, D. K., Ridge, K. M. The role of vimentin intermediate filaments in the progression of lung cancer. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2014).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Papafotiou, G., et al. KRT14 marks a subpopulation of bladder basal cells with pivotal role in regeneration and tumorigenesis. Nature Communications. 7, 11914 (2016).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. Journal of the Royal Society Interface. 11 (99), (2014).
- Goddette, D. W., Frieden, C. Actin polymerization. The mechanism of action of cytochalasin D. Journal of Biological Chemistry. 261 (34), 15974-15980 (1986).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Lee, J. H., et al. Collagen gel three-dimensional matrices combined with adhesive proteins stimulate neuronal differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of the Royal Society Interface. 8 (60), 998-1010 (2011).
- LeBleu, V. S., Macdonald, B., Kalluri, R. Structure and function of basement membranes. Experimental Biology and Medicine. 232 (9), 1121-1129 (2007).
- Rakha, E. A., et al. Invasion in breast lesions: the role of the epithelial-stroma barrier. Histopathology. , (2017).
- Erler, J. T., Weaver, V. M. Three-dimensional context regulation of metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (1), 35-49 (2009).
