Het protocol hier geschetste beschrijft de immunofluorescentie analyse, biocytin herstel en kwalitatief hoogwaardige reconstructies van hippocampal CA2 interneuronen na de intracellulaire elektrofysiologische opnames in vitro waardoor neuronale karakterisering en uiteindelijk prima neuronale anatomie worden bestudeerd.
Informatie is van belang voor een groot aantal fundamenteel en klinisch wetenschappelijke vragen hoe corticale netwerkactiviteit verwerkt. Het protocol hier beschreven identificeert de elementaire bouwstenen van deze circuits. De diepgaande studies van corticale gebieden zorgt uiteindelijk voor andere wetenschappers met de circuit componenten die nodig zijn voor een goed begrip van hoe de hersenen verwerft, verwerkt en opgeslagen informatie en wat misgaat in ziekte, terwijl het elektrofysiologische en morfologische gegevens worden veel gebruikt door computationele neurowetenschappers in de bouw van model-netwerken die onderzoeken van informatieverwerking. Het protocol hier geschetst wordt beschreven hoe biocytin gevulde cellen opgenomen in de CA2-regio van de hippocampus worden hersteld en vervolgens herbouwd in 3D. Bovendien is het protocol beschreven de demonstratie van calcium bindend-proteïne of peptide inhoud in opgenomen interneuronen.
De cortex en hippocampus zijn structuren voor dergelijke complexiteit dat de classificatie van neuronale subtypen1,2,3,4, kaarten van de verbindingen tussen hen5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 en hoe deze circuits ondersteunt cognitieve functies12,13,14,15 zijn nog steeds onder intense studie en het onderwerp van voortdurende debat. Bijvoorbeeld, om te begrijpen van de details en de complexiteit van de circuits en te coördineren van gegevens die zijn verkregen uit vele verschillende studies, het is zeer nuttig om te kunnen worden gedefinieerd en worden de onderdelen beschreven, maar het blijft een zaak van debat hoe veel verschillende klassen van neuronen bestaan, of zelfs of het is mogelijk om te bepalen van alle neuronen als behorend tot een specifieke klasse. Computerhulpmiddelen die kunnen bouwen en testen van schakelingen met verschillende gradaties van complexiteit worden ontwikkelde16,17,18, maar de kern van deze inspanningen is de behoefte aan gedetailleerde studies van de celtypes en de eigenschappen van de verbindingen tussen hen. Een grote hoeveelheid informatie over het lokale circuit van de neocortex van volwassen ratten heeft al zijn verzameld via het protocol beschreven hier10,19,20,21, 22. Hoewel het “bedradingsschema” verre van compleet is, duidelijke patronen of regels naar voren zijn gekomen. Bovendien, hoewel sommige details verschillen, deze regels gelden naar twee soorten zoogdieren (rat en katten) en over verschillende neocortical regio’s, waardoor de ontwikkeling van bouwstenen die dreigen te worden eveneens van toepassing op menselijke neocortex. De hier beschreven techniek wordt gebruikt om uit te breiden ons begrip van de functionele kaart van corticale circuits door het identificeren van de presynaptische en postsynaptisch neuronen die betrokken zijn bij verbindingen in de regio’s die niet in detail onderzocht hebben, met behulp van een protocol waarmee uitstekende weefsel instandhouding en opmerkelijk kleuring herstel in volwassen hersenweefsel. Met deze methode zijn gegevens over het lokale circuit in CA2 en neuronale eigenschappen in dit subveld verzameld door het combineren van intracellulaire elektrofysiologische opnamen (gepaarde opnames met scherpe microelectrodes) met biocytin vullen, immunofluorescentie, histologisch procedures en zeer gedetailleerd neuronale reconstructies, waardoor directe vergelijking met de naburige CA regio’s23,24,25.
De techniek die in dit artikel beschreven is ontwikkeld in de jaren voor gedetailleerde neuronale anatomie, waardoor de juiste indeling van de cellen en de hoge kwaliteit en nauwkeurige reconstructies van beide hun dendritische en axonale arbors, gegevens die kunnen worden gecorreleerd met elektrofysiologische gegevens verzameld uit gekoppelde opnamen met behulp van scherpe elektroden. Het histologische protocol is geoptimaliseerd om de ultrastructuur van de neuronen te behouden en verkrijgen van uitstekende herstel van dendritische (inclusief stekels) én axonale arbors. Bijvoorbeeld, geeft het beginsel van de dubbele fixatie techniek door in de eerste plaats onder te dompelen in een kleefpoeders oplossing en ten tweede na vaststelling in osmium tetroxide een goed contrast voor de lichte microscopie van26. Een kleine hoeveelheid Glutaaraldehyde en pikrinezuur oplossing worden toegevoegd aan de kleefpoeders oplossing ter verbetering van antilichaam penetratie en het behoud van de cellen ultrastructuur zoals in een eerdere studie27wordt voorgesteld. De permeabilization van de segmenten van de hersenen met behulp van de methode van de vries-dooi in combinatie met cryo-bescherming met sacharose, in plaats van een traditioneel wasmiddel, biedt ook een optimaal behoud van de weefsels voor gedetailleerde morfologische analyse van de opgenomen cellen. Bovendien, is de visualisatie met name van zeer fijne structuren verbeterd doordat achtergrondkleuring, met de incubations met waterstof peroxide (H2O2) en natriumboorhydride (NaBH4). Het toevoegen van nikkel chloride (NiCl2) aan de horseradish peroxidase (HRP) verhoogt reactie op het verkrijgen van een zwarte pigment reactieproduct ook u het contrast.
Het volgende protocol beschrijft de procedures gebruikt om na te gaan van uitstekende weefsel instandhouding en zeer gedetailleerde neuronale 3D-reconstructies na intracellulaire opnames in vitro. De beschrijving van de voorbereiding van het segment, intracellulaire gepaarde opnamen met behulp van scherpe elektroden en latere histologische procedures gebruikt in ons laboratorium geweest eerder gemelde28. Hoewel het protocol is van toepassing op de cellen intracellulair gevuld met biocytin in dikke sneden van 450 – 500 μm, kan hetzelfde protocol worden gebruikt na geheel-cel opnames. Echter, het gebruik van dunner segmenten zal resulteren in minder volledig reconstructies van de cellen.
Elektrofysiologische opnames in vitro (Figuur 1 Ac,d en v.Chr., d) gecombineerd met histochemische en immunohistochemische procedures stellen de gedetailleerde morfologie, bindende eiwit calciumgehalte en identiteit van volwassen corticale interneuronen geregistreerd te worden onthuld. In de CA2-regio, deze techniek toegestaan van de studie van het lokale circuit voor de eerste keer en subklassen van interneuronen die had niet eerder zijn beschreven in CA1 of CA3 geopenbaard: breed dendritische en axonale arbor mand cellen (figuur 1B), bistratified cellen en SP-SR interneuronen.
Het protocol hier beschreven is geoptimaliseerd om de ultrastructuur van de neuronen te behouden en verkrijgen van uitstekende herstel van dendritische (inclusief stekels) én axonale arbors. Kritische stappen omvat het gebruik van de dubbele fixatie techniek om het contrast voor de lichte microscopie van26 verbeteren en de toevoeging van de kleefpoeders oplossing voor verbeteren van antilichaam penetratie en het behoud van de neuronale Glutaaraldehyde en pikrinezuur oplossing ultrastructuur27. Zachte bevriezen-ontdooien permeabilization geeft beter behoud van de fijne structuur, terwijl osmication en hars inbedding z-plane krimp28 verminderen. Bovendien, is de visualisatie van zeer fijne structuren (fijne axonen met kleine los bijvoorbeeld) verbeterd door de secties met H2O2 en NaBH4 om achtergrondkleuring aan het broeden. Contrast kan ook worden verhoogd met de toevoeging van NiCl2 tot de HRP-reactie.
De histologische procedure hier biedt uitstekende resultaten op het gebied van de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid. Echter, de duur van de elektrofysiologische opnames zal bepalen de kwaliteit van de biocytin/fluorescentie kleuring, met kortere opnames meestal geassocieerd met de slechte axonale kleuring. De keuze voor het opnemen van protocollen (intracellulaire opnamen met behulp van scherpe elektroden vs. geheel-cel patch klemmen) kan ook van invloed biocytin bewaring en het behoud van de fijne anatomie.
Terwijl de problemen de fijne structuur behouden tijdens histologische verwerking die hier worden beschreven en de tijd die nodig is te reconstrueren op 100 X vergroting (1-4weeks afhankelijk van de complexiteit van de axon) worden gewaardeerd, deze methode geeft een accurate weergave van dendritische en axonale diameters. Het gebruik van minder veeleisende protocollen te onthullen biocytin-etikettering is begrijpelijk, evenwel dat deze vaak duidelijk visualisatie van fijne axonale takken. Wasmiddelen, ter bevordering van de toetreding van Avidin-HRP te onthullen van de biocytin en de antilichamen, vaak noodzakelijk zijn in het dik secties, maar fijne structuur kunnen verstoren. Neurowetenschappers zoeken voortdurend voor semi-automatische methoden van wederopbouw, maar voor blijft nu en voor met name biocytin-HRP axonen met handmatige wederopbouw de goudstandaard31.
Zeer gedetailleerd neuronale reconstructies, vooral nauwkeurige tekeningen van axonale los en knooppunten, de aanwezigheid of afwezigheid van myeline en meer in het algemeen de tekening van volledige axonale arbor, met de voorstelling van nauwkeurig axon-diameter langs verandert haar lengte, nadere informatie voor nauwkeurige identificatie van een verschillend type van interneurone. Hoewel veel interneuronen niet precies in een specifieke klasse passen kunnen, oplevert de techniek hierboven beschreven gecorreleerde gegevens over neuronale elektrofysiologische eigenschappen, de korte plasticiteit gekoppeld aan een specifiek type van verbinding en gedetailleerde neuronale reconstructies, waardoor het bedradingsschema, CA2 regio, bijvoorbeeld, tot in detail worden bestudeerd.
Mooie, gedetailleerde structuur is vaak vereenvoudigd in rekenmodellen. Terwijl begrijpelijk, resulteert dit in het verlies van de gegevens die in de toekomst kritiek zou kunnen blijken. Analyse van gedetailleerde 3D-reconstructies met parallelle synaptic gegevens kan de toevoeging van verdere criteria voor interneuronal indeling. Gegevens kunnen worden gestort in openbare bewaarplaatsen en gebruikt door modelbouwers te verkennen van het resultaat van sporadische veranderingen in de diameter van de axon en myelinisering over actiepotentiaal teeltmateriaal computationeel.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek heeft financiering ontvangen van Novartis Pharma (Bazel) en de medische Raad voor onderzoek toegekend aan Prof Alex Thomson, de biotechnologie en de biologische Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), de fysiologische samenleving, de Europese Unie de Horizon 2020 kaderprogramma voor onderzoek en innovatie onder de specifieke Grant overeenkomst No. 720270 (menselijk brein Project SGA1) en onder de specifieke Grant overeenkomst No. 785907 (menselijk brein Project SGA2). We zijn zeer dankbaar Prof Alex Thomson voor het opzetten van het protocol in andere corticale gebieden, het garanderen van de financiering voor haar voortdurende steun voor dit project. Bijdragen van lab-leden die hebben geholpen met het optimaliseren van het protocol van herstel en gereconstrueerd CA2 neuronen dankbaar zijn erkend: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |