Summary
Das Protokoll hier skizzierten beschreibt die Immunfluoreszenz-Analyse, Biocytin Erholung und qualitativ hochwertige Rekonstruktionen der hippocampalen CA2 Interneuronen nach der intrazellulären elektrophysiologische Aufnahmen in-vitro- so dass neuronale Charakterisierung und letztlich feine neuronalen Anatomie studiert werden.
Abstract
Wie kortikale Netzwerkaktivität verarbeitet ist Informationen für eine große Anzahl von Grundlagenforschung und klinische Fragestellungen von Bedeutung. Das hier beschriebene Protokoll identifiziert die grundlegenden Bausteine der diese Schaltung. Eingehenden Studien der kortikalen Regionen bieten letztlich andere Wissenschaftler mit der Schaltungskomponenten notwendig für das Verständnis, wie das Gehirn erhält, verarbeitet und speichert Informationen und was schief läuft in der Krankheit, während der elektrophysiologischen und morphologische Daten sind weit verbreitet durch rechnerische Neurowissenschaftler in den Bau von Modell-Netzwerke, die Informationsverarbeitung zu erkunden. Die hier beschriebene Protokoll beschreibt wie Biocytin gefüllten Zellen aufgezeichnet in der CA2-Region des Hippocampus sind wiederhergestellt und dann in 3D rekonstruiert. Das Protokoll beschreibt darüber hinaus die Demonstration der Calcium-bindendes Protein oder Peptid Inhalte in aufgezeichneten Interneuronen.
Introduction
Der Kortex und Hippocampus sind Strukturen von solcher Komplexität, dass die Klassifizierung der neuronalen1,2,3,4, Karten der Verbindungen zwischen ihnen5,6 Subtypen , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 und wie diese Schaltung unterstützt kognitive Funktionen12,13,14,15 sind noch unter intensivem Studium und Weiterbildung diskutiert. Zum Beispiel, Details und Komplexität der Schaltung zu verstehen und um Daten aus vielen verschiedenen Studien zu koordinieren, ist es äußerst hilfreich zu definieren und beschreiben Sie die Komponenten dürfen, aber es bleibt eine Frage zur Diskussion, wie viele verschiedene Klassen von Neuronen vorhanden sind, oder sogar ob es möglich ist, alle Neuronen als Zugehörigkeit zu einer bestimmten Klasse zu definieren ist. Computational Tools, die bauen und Testen von Schaltungen mit unterschiedlichem Grad der Komplexität, werden entwickelten16,17,18, aber diese Bemühungen im Mittelpunkt steht die Notwendigkeit einer detaillierten Untersuchungen der Zelltypen und von den Eigenschaften der Verbindungen zwischen ihnen. Eine große Menge an Informationen über die lokalen Schaltung des Neocortex der erwachsenen Ratten hat bereits erfasst wurden, mit das Protokoll beschrieben hier10,19,20,21, 22. Obwohl der "Schaltplan" bei weitem nicht vollständig ist, einige klare Muster oder Regeln entstanden. Obwohl einige Details unterscheiden, sind diese Regeln zwei Säugetierarten (Ratte und Katze) und über mehrere neokortikalen Regionen gemeinsam soll die Entwicklung von grundlegenden Bausteine, die auf menschlichen Neocortex gleichermaßen anwendbar sein dürften. Die hier beschriebene Technik wird verwendet, um unser Verständnis der funktionalen Karte der kortikalen Schaltung durch die Identifizierung der präsynaptischen und postsynaptischen Neuronen beteiligt Verbindungen in den Regionen, die nicht vor, detailliert untersucht worden sind, unter Verwendung eines Protokolls zu verlängern Das ermöglicht ausgezeichnete Gewebe Erhaltung und bemerkenswerte Färbung Erholung im Erwachsenen Gehirngewebe. Daten auf der lokalen Schaltkreis CA2 und neuronale Eigenschaften in diesem Unterfeld haben mit dieser Methode gesammelt wurden, durch die Kombination von intrazellulären elektrophysiologische Aufnahmen (gekoppelte Aufnahmen mit scharfen Mikroelektroden) mit Biocytin füllen, Immunfluoreszenz, histologische Verfahren und hochdetaillierten neuronaler Rekonstruktionen, direkter Vergleich mit den benachbarten CA Regionen23,24,25.
In diesem Artikel beschriebene Verfahren wurde entwickelt im Laufe der Jahre erhalten detaillierte neuronalen Anatomie erlaubt die korrekte Klassifizierung der Zellen und die hohe Qualität und genaue Rekonstruktionen der beiden ihre dendritischen und axonalen Dorne, Daten korreliert mit elektrophysiologische Daten aus gekoppelten Aufnahmen mit scharfen Elektroden. Die histologische Protokoll wurde optimiert, um die Ultrastruktur der Neuronen zu bewahren und erhalten ausgezeichnete Erholung der dendritischen (einschließlich Stacheln) und axonalen Dorne. Zum Beispiel gibt das Prinzip der doppelten Fixierung Technik durch zunächst in einer Fixativ Lösung eintauchen und zweitens nach dem fixieren in Osmium ausgefällt einen guten Kontrast für Lichtmikroskopie26. Eine kleine Menge von Glutaraldehyd und Pikrinsäure Lösung dazu das Fixativ Lösung, Antikörper eindringen zu verbessern und die Zellen Ultrastruktur wie in einer früheren Studie27zu bewahren. Die Permeabilisierung der Gehirnscheiben der Frost-Tausalz-Methode kombiniert mit Cryo-Schutz mit Saccharose, anstatt einer herkömmlichen Waschmittel bietet auch optimale Erhaltung der Gewebe für detaillierte morphologische Analyse der aufgezeichneten Zellen. Darüber hinaus ist die Visualisierung besonders der sehr feine Strukturen durch verringern Hintergrundfärbung mit der Inkubationen mit Wasserstoffperoxid (H2O2) und Natriumborohydrid (NaBH4) gesteigert. Hinzufügen von Nickelchlorid (NiCl2) zu den Meerrettich-Peroxidase (HRP) erhöht Reaktion auf ein schwarzes Pigment Reaktionsprodukt zu erhalten auch den Kontrast.
Das folgende Protokoll beschreibt die Verfahren zum ausgezeichneten Gewebe Bewahrung und hochdetaillierte neuronalen 3D-Rekonstruktionen nach intrazellulären Aufnahmen in Vitrozu ermitteln. Die Beschreibung der Slice-Vorbereitung, intrazelluläre gekoppelte Aufnahmen mit scharfen Elektroden und anschließende histologische Verfahren, die in unserem Labor wurden bisher gemeldeten28. Das Protokoll gilt für die Zellen intrazellulär mit Biocytin in 450 – 500 μm dicke Scheiben gefüllt, kann das gleiche Protokoll nach ganzen Zelle Aufnahmen verwendet werden. Jedoch wird die Verwendung von dünneren Scheiben weniger vollständige Rekonstruktionen der Zellen führen.
Protocol
Alle Verfahren, die in dieser Studie verwendet wurden nach den Vorschriften des britischen Home Office im Hinblick auf das Tier wissenschaftlichen Verfahren Act 1986 durchgeführt.
1. Bestimmung der Calcium-bindende Protein oder Proteingehalt von Interneuronen und Biocytin Visualisierung nach elektrophysiologische Aufnahmen und Biocytin Füllung
Hinweis: Am Ende der elektrophysiologischen Aufzeichnungen, Scheiben, die Biocytin gefüllten Zellen enthalten Übernachtung vor der histologischen Verfahren behoben werden. Die Fixativ Lösung wird mit einer einzigen Änderung von 0,1 M Phosphatpuffer am nächsten Morgen ersetzt werden, wenn der Rest des Verfahrens an einem anderen Tag durchgeführt wird, um Gewebeschäden zu vermeiden. Die Fixierung-Lösung (4 % Paraformaldehyd, 0,2 % gesättigt Pikrinsäure Lösung, 0,025 % Glutaraldehyd Lösung in 0,1 M Phosphatpuffer (PB)) muss am Tag der Aufnahmen für die besten Ergebnisse frisch zubereitet.
- Am Ende der elektrophysiologischen Aufnahme sorgfältig wählen Sie die Scheibe mit den aufgezeichneten Zellen mit einem Pinsel und legen Sie sie in einem Topf mit künstlichen Liquor (ACFS).
Hinweis: Details des Protokolls verwendet für Slice Vorbereitung und intrazellulären Aufnahmen mit scharfen Elektroden wurden28beschrieben. - Unter einem Abzug sorgfältig abholen der Gehirn-Scheibe mit einem Pinsel und Rollen Sie ihn auf ein kleines Stück Filterpapier feine Qualität. Legen Sie ein weiteres Stück feuchtes Filterpapier auf der Scheibe und legen Sie die zwei Stücke von nassem Filterpapier in einem kleinen Kunststoff-Topf mit 5-10 mL Fixativ Lösung und Speicher im Kühlschrank über Nacht bei 4 ° C.
- Bereiten Sie eine Lösung von Gelatine in destilliertem Wasser. Legen Sie 20 mL destilliertes Wasser in ein Becherglas auf einer heißen Platte und erhitzen Sie es auf 60 ° C. Das Wasser fügen Sie nach und nach 2,4 g Gelatine hinzu, warten Sie, bis aufgelöst und lassen Sie es auf 35 – 40 ° C abkühlen, bevor Sie verwenden, um Gewebeschäden zu vermeiden.
- Ersetzen Sie die Fixativ Lösung mit 2 mL 0,1 M PB. Legen Sie die Scheibe in einer Petrischale und schneiden Sie überschüssiges Gewebe mit einem Skalpellklinge. Legen Sie das getrimmte Gewebe in einer Petrischale (Durchmesser 9 cm, Höhe von 1,4 cm), um sicherzustellen, dass es liegt flach ohne Falten und Knicke und entfernen den überschüssigen Puffer mit einem trockenen Pinsel.
- Decken Sie des Gewebes mit der warmen Gelatine-Lösung ab und die Petrischale auf einen gefrorenen Block schnell die Lösung abkühlen lassen.
- Mit einem Winkel-Poise Lampe Kontrast bieten, schauen Sie durch die Seite der Schale und halten Sie die Scheibe flach mit leichtem Druck aus einem feinen Pinsel, bis die Gelatine beginnt zu setzen.
Hinweis: Die Gelatine kann wieder geschmolzen werden, wenn das Gewebe nicht flach liegt. Alle Unvollkommenheiten auf der Oberfläche der Gelatine, verursacht durch die Beseitigung der Pinsel wie es erstarrt können durch Schmelzen der Oberflächenschicht sanft durch Verschieben der Birne der Lampe in der Nähe der Oberfläche für ein paar Sekunden entfernt werden. - Verschieben Sie das Gericht der Einstellung Gelatine in den Kühlschrank stellen und bei 4 ° C für 30-60 min lassen.
- In einer Dampfhaube, schneiden Sie einen kleinen Block (~ 1 x 1 cm) mit der Gelatine eingebettete Gewebe der Schale mit einem Skalpellklinge, hebt die Sperre mit einem kleinen Spatel und legen Sie es vorsichtig in die gleiche, aber frisch Fixativ Lösung verwendet, um die Scheiben für mindestens 30 min bei 4 ° C zu beheben .
- Waschen Sie die Gelatine-Block in 5 mL 0,1 M PB dreimal, trocknen Sie ihn mit einem Stück Zellstoff und die Block Seite nach oben (d.h.mit dem Gewebe an der Spitze) auf ein Vibratome Futter mit Sekundenkleber kleben.
- Entfernen Sie überschüssigen Kleber mit einem Stück Filterpapier und mit einer Skalpellklinge die Ecken des Blocks abgeschnitten, verlassen eine Rautenform.
- Abschnitt der Scheibe bei 50 µm Dicke mit einem Vibratome und jeder Abschnitt sorgfältig in ein Glasfläschchen mit 10 % Saccharose.
- Sorgfältig wählen Sie einen Abschnitt aus dem Fläschchen, legen Sie sie flach in eine Petrischale Deckel. Entfernen Sie die Gelatine aus um den Abschnitt zu und ein Fläschchen mit 2 mL frische 10 % Saccharose Abschnitt wieder mit dem sezierenden Mikroskop und einer frischen Skalpellklinge,
Hinweis: Es ist entscheidend, wie viel Gelatine in diesem Stadium, Gewebe schrumpfen während der Austrocknung Schritt (Schritt 1,37) zu reduzieren wie möglich entfernen. - Cryo-schützen Sie die Abschnitte in 0,1 M PB-basierte Saccharose-Glycerin-Lösung bei Raumtemperatur durch Inkubation sie für 10 min in 10 % Saccharoselösung, 20 min. bei 20 % Saccharose - 6 % Glycerin Lösung zweimal und schließlich 30 min bei 30 % Saccharose - 12 % Glycerin Lösung zweimal unter ständiger Bewegung.
- Legen Sie die Teile flach auf ein kleines Rechteck der Alufolie mit einem Pinsel. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Abschnitten und Falten Sie sorgfältig die Alufolie in ein Päckchen.
- Halten Sie das Paket in der Nähe der Oberfläche des flüssigen Stickstoffes ohne Berührung der Oberfläche für 30 s und lassen Sie in den Abschnitten vollständig Auftauen der Frost-Tausalz-noch zwei Mal für ca. 30 S. wiederholen.
- Entfernen Sie alle Teile mit einem Pinsel und legen Sie sie in ein Glasfläschchen mit 2 mL 0,1 M PB unter ständiger Bewegung überschüssige Saccharose abwaschen.
- PB mit einer Pasteurpipette zu entfernen und die Abschnitte in 2 mL von 1 % wässrige H2O2 inkubieren Sie für 30 min. Waschen die Abschnitte in 2 mL der 0,1 M PB 3 x 5 Minuten.
- Entfernen Sie den 0,1 M PB mit einer Pasteurpipette und 1 % Natriumborohydrid (NaBH4) in 0,1 M PB.
Hinweis: Verschließen Sie das Fläschchen nicht als NaBH Wasserstoffgas4 Lösung abgibt. - Natriumborohydrid mit einer Pasteurpipette zu entfernen und waschen die Teile gründlich in 2 mL 0,1 M PB 5 x 5 min.
- Ersetzen Sie den 0,1 M PB mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) in 0,1 M PB für 30 Minuten.
- Entfernen Sie die Ziegenserum und inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht bei 4 ° C in einer Mischung aus monoklonalen Maus und Kaninchen polyclonal Antikörper in ABC Lösung gebildet.
Hinweis: In früheren Studien verwendeten primären Antikörper ist in Tabelle 1 in Stümper Et Al. angezeigt (2014) 29. - Inkubieren Sie die Abschnitte für 2 h im Dunkeln in einer Mischung aus Gewebekulturen radioaktiv markierten Sekundärantikörper (Table of Materials).
- Montieren Sie die Abschnitte auf den Objektträger in Eindeckmedium und mit einem Deckglas abdecken.
- Nehmen Sie Bilder von Fluoreszenz Kennzeichnung bei 40 X Vergrößerung (Abbildung 1 bb).
- Legen Sie nach der Fluoreszenz imaging die Folie in eine Glas-Petrischale mit PBS und entfernen Sie vorsichtig das Deckglas. Dann waschen Sie die Abschnitte aus der Folie mit sanften Impulsen von PBS aus einer Pasteurpipette. Legen Sie die Abschnitte in ein sauberes Glas-Fläschchen mit PBS.
- Durchführen der Avidin-HRP-Reaktion Erstens Bebrüten die Abschnitte in ABC für mindestens 2 h die HRP Reaktionsprodukt zu verstärken.
- Bereiten Sie die 3,5 Diaminobenzidine (DAB)-Lösung, indem Sie eine Tablette zu 5 mL destilliertem Wasser.
- Waschen Sie die Abschnitte mit PBS dreimal für 10 min und dann mit Tris-Puffer zweimal für 10 min. Entfernen des Tris-Puffers nach dem letzten waschen.
- Schnell ein Rückgang von 8 % NiCl2 Lösung der DAB-Projektmappe hinzufügen, pipette die Lösung ein-und mischen und 1 mL dieser Lösung schnell über die Abschnitte hinzufügen. Inkubieren Sie die Abschnitte in der DAB/NiCl2 Lösung für 15 min.
- Die Lösung DAB 10 µL 1 % H2O2 hinzufügen. Die Reaktion in der Dunkelheit unter ständiger Bewegung für ca. 1 bis 2 min und überwachen die Kennzeichnung von gefüllten Zellen mit einem sezierenden Mikroskop zu ermöglichen.
- Die Reaktion durch das Entfernen der DAB/NiCl2/h2O2 Lösung zu stoppen und die Abschnitte mit Tris-Puffer zweimal für 5 min waschen.
- Legen Sie in einer Dampfhaube einen kleinen Kreis von Filterpapier in eine Petrischale und befeuchten sie mit 0,1 M PB. Heben Sie die Abschnitte einzeln nacheinander aus dem Glas Fläschchen mit einem Pinsel, und legen Sie sie vorsichtig flach auf dem Papier.
- Sollte in den Kapiteln mit einem anderen feuchten Kreis Filterpapier und entfernen Sie überschüssigen Puffer durch Tissue-Papier an die Oberfläche berühren.
- 8 – 9 Tropfen 1 % Osmium ausgefällt in 0,1 M PB, das obere Papier, bedecken Sie die Schüssel und behalten in der Dunstabzugshaube für mindestens 30 min, aber nicht mehr als 1 h.
- Öffnen Sie die Petrischale und heben Sie das obere Filterpapier. Heben Sie vorsichtig die Abschnitten jeweils einzeln mit einem Pinsel, legen Sie sie in eine Glasflasche und zweimal in destilliertem Wasser abspülen.
- Osmium ausgefällt Abfälle ordnungsgemäß entsorgen. Spülen Sie alle Einweg-Geräte und legen Sie sie in die entsprechenden Behälter.
- Legen Sie jeden Abschnitt flach auf einem Objektträger und Deckglas in den Abschnitten. Übertragen Sie die Folie in einer Petrischale, legen Sie eine leere Glasflasche über das Deckglas, in Ort und mit 50 % Alkohol zu behalten. Entfernen Sie nach 15 min die Folie aus der Lösung und entfernen Sie die Abschnitte aus der Folie zu. Ort in den Abschnitten wieder auf der Folie und legen Sie die Folie in 70 % Alkohol für 15 min. Wiederholen Sie den gleichen Prozess mit 95 % und schließlich 100 % Alkohollösung.
- Übertragen Sie nach der Austrocknung Schritt die Abschnitte zu einem Glasfläschchen mit 100 % Alkohol auf einen Shaker in einer Dampfhaube. Ersetzen Sie die Alkohollösung mit Propylenoxid (C3H6O) und drei Mal für 5 min waschen. Halten Sie nach dem letzten Waschen ~ 2 mL von Propylenoxid in das Fläschchen und fügen Sie Harz (Verhältnis 1:1). Stellen Sie sicher, dass das Harz gelöst ist und halten Sie die Abschnitten unter ständiger Bewegung für 30 min.
- Legen Sie jeden Abschnitt in einer Aluminium-Planchette mit Epoxidharz mit einem Holzstab und inkubieren Sie über Nacht.
Hinweis: Lassen Sie die Abschnitte in den Harz, die länger als 24 h, das Risiko einer Beschädigung der Teile zu vermeiden. - Die Planchette auf einer heißen Platte für ca. 10 min. abholen jeder Abschnitt mit einem Holzstab und legen Sie sie auf eine saubere Folie. Halten Sie die Ausrichtung der einzelnen Abschnitte konsistent mit einem sezierenden Mikroskop. Platzieren Sie ein Deckglas über die Abschnitte. Legen Sie die Folie in den Ofen für 48 h bei 56 ° C für die Heilung.
2. neuronale 3D-Rekonstruktionen
Hinweis: Neurolucida Software wird verwendet. Nachstehenden Anweisungen gelten nur für eine bestimmte Neurone Wiederaufbau System (Table of Materials). Die Abschnitte erhalten vom Schneiden sind vor den Umbauten unter Verwendung eines Mikroskops abgestimmt.
- Legen Sie eine Folie auf der Bühne und mit Bühne Clip sichern Sie und öffnen Sie die Neuron-Wiederaufbau-Software. Klicken Sie auf Registerkarte " Acquire " und wählen Sie die Live-Bild.
- Messen Sie die Dicke der einzelnen Abschnitte mit 100 X Öl Objektivlinse. Notieren Sie den Wert auf dem Z-Meter am oberen und unteren Rand jeder Abschnitt und berechnen Sie die Schnittdicke als die Differenz der beiden Werte zu.
- Verwenden Sie ein Low-Vergrößerung-Ziel zu Hause Abschnitt enthält die Zellkörper konzentrieren. Verwenden Sie dann ein 100 X Objektiv, konzentrieren Sie sich auf die Zellkörper und klicken Sie in der Mitte um den Referenzpunkt zu markieren.
- Wählen Sie die Registerkarte " Trace " Serial Section Manager. Wählen Sie dann im Fenster Serial Section Manager Neuen Abschnitt erstellen (Pluszeichen). Geben Sie die Anzahl der Abschnitte. Benennen Sie jeden Abschnitt in der Z-Reihenfolge und geben Sie die geschnittenen Dicke in Schritt 2.2 gemessen.
- Um die Soma in 3D mit 100 X Objektiv zu verfolgen, wählen Sie Kontur aus der Registerkarte " Trace " und wählen Sie die Zelle Körper -Kontur. Verwenden Sie den Joystick zum Verschieben des Fokus an der Spitze der Zellkörper. Platzieren Sie die Punkte, indem Sie auf klicken, um den Umfang des Teils, die derzeit im Fokus. Mit der rechten Maustaste und wählen Sie Enge Kontur um dieses erste Kapitel zu beenden. Wiederholen Sie diesen Vorgang an verschiedenen Z-Positionen, bis die Unterseite der Zellkörper (Abbildung 2) erreicht ist.
Hinweis: Wählen Sie 3D Visualisierung im Trace -Registerkarte, um die Zellkörper in 3D visualisieren. - Um den Zellkörper in 2D mit 100 X Objektiv zu verfolgen, wählen Sie im Zellkörper Neuron Menü in die Registerkarte " Trace " Fokus auf die Mitte der Zellkörper. Platzieren Sie die Punkte durch Klicken im Umkreis der Zellkörper. Zur Vervollständigung der Zellkörper mit der rechten Maustaste und wählen Sie beenden Zellkörper.
- Zum Nachzeichnen der dendritischen Laube wählen Sie Dendrit oder Apikale Dendriten im Neuron Menü. Verfolgen Sie zuerst eine kurze, erste Segment für jede Dendrit mit dem Mausrad den Durchmesser des Cursors entsprechend den Durchmesser der Dendrit einstellen. Verfolgen Sie entlang jeder Dendriten mit dem Joystick über den Abschnitt und das Mausrad bewegen, den Durchmesser der Ablaufverfolgung anpassen.
- Prüfen Sie die Ausrichtung der Ablaufverfolgung mit dem live-Mikroskopbild und wenn nötig, vor allem nach dem Umzug mit dem Joystick. Richten Sie in der Registerkarte " Trace " die Ablaufverfolgungwählen Sie aus, klicken Sie auf die Ablaufverfolgung und klicken Sie dann auf den richtigen Speicherort.
- Wenn ein Knoten im Baum erreicht ist, mit der rechten Maustaste und wählen Sie Aufzuspalten oder Trifurcating Knoten aus der Drop-Down-Menü.
- Wenn am Ende eines Zweiges erreicht wurde, wählen Sie eine Endung aus dem Dropdown-Menü im Menü " Neuron ". Wählen Sie die korrekte Ende Art, dh., High End, normale Beendigung oder low enden auf Abstimmung über Abschnitte erleichtern.
- Verringern Sie die Vergrößerung auf dem Mikroskop, sobald alle Dendriten im aktuellen Abschnitt verfolgt worden, wählen Sie die Registerkarte Freude frei und zu einem Abschnitt, der unmittelbar oberhalb oder unterhalb des abgeschlossenen Bereichs entspricht.
- Um die passenden Punkte zwischen den Dendriten in einem Abschnitt zu identifizieren, die den ausgefüllten Abschnitt entspricht, klicken Sie auf die Registerkarte " bewegen " und wählen Sie Matchbälle. Wählen Sie die Anzahl der Punkte angepasst werden musste (drei oder mehr Punkten wird bevorzugt) und drücken Sie dann "OK". Klicken Sie auf das Ende einer abgeschlossenen Filiale und klicken Sie dann auf den Zweig. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Match-Punkt. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei 100 X Vergrößerung, genau passend zu gewährleisten.
- Fügen Sie passende Zweige im vorherigen Abschnitt direkt durch einen Rechtsklick auf das Ende. Wählen Sie Hinzufügen zu Ende , wenn die Niederlassung mit abgeschlossenen vektorisierte Zweig und Ablaufverfolgung wie zuvor beschrieben Linien.
- Sobald die Dendriten der einzelnen Abschnitte verfolgt haben, verfolgen Sie das Axon nach dem gleichen Verfahren von Axon aus dem Neuron -Menü auswählen.
- Gehen Sie zum Abschnitt " Home " neu ausrichten des Wiederaufbaus mit dem live-Mikroskopbild und wählen Sie Konturen aus die Registerkarte " Trace " wählen Sie einen vordefinierten Kontur/Schicht Grenzregion/Rand und klicken Sie auf Ablaufverfolgung entlang einer Kontur. Wählen Sie Ende offene Kontur. Verfolgen Sie alle gewünschten Layer und Region Konturen.
- Verwenden Sie 3D Visualisierung auf Registerkarte " Trace " Rekonstruktionen in 3D zu visualisieren.
- Videos von 3D-Rekonstruktionen (Video 1) aufzeichnen öffnen Sie die 3D-Rekonstruktion und Filme erstellen. Geben Sie eine Dateiziel und gewünschte Drehzahl. Es wird empfohlen, um die Drehung um 270 ° festzulegen. Wählen Sie die Aufnahme, Rekord für ein paar Sekunden, und klicken Sie dann automatisch drehen. Wählen Sie die Aufzeichnung beenden , wenn erforderlich. Bearbeiten Sie das Video mit einer Video-editing-Software (Table of Materials).
- Um die Dateien in Tiff oder JPEG-Dateien zu exportieren, wählen Sie Datei | Exportieren | Ablaufverfolgung der Export als Bild. Wählen Sie eine µm/Pixel-Verhältnis und passen. Wählen Sie eine Hintergrundfarbe und wählen Sie Datei. Benennen Sie die Datei, wählen Sie Tiff oder JPEG und Speichern. Um die Dateien in Vektor-Dateien zu exportieren, wählen Sie Datei | Exportieren | Export-Ablaufverfolgung als Vektor-Dateien.
- Verwenden Sie eine Neuron-Wiederaufbau-Analyse-Software um morphometrische Analysen durchzuführen.
- Zu dendritischen Bäume zu analysieren und ein Dendrogramm zu erhalten, öffnen Sie die Datei im Neurolucida Explorer. Wählen Sie analysieren | Struktur und wählen Sie Dendrogramm aus dem Dropdown-Menü (Abbildung 3).
- Um eine umfassende morphometrische Analyse der 3D-Rekonstruktionen (Zweig Komplexität, Zweige und Somas, Fläche) auszuführen, öffnen Sie die Datei in der Software. Klicken Sie in der Registerkarte " Ansicht " Wählen Sie alle. Wählen Sie die Registerkarte " Analyze ". Dann wählen Sie Struktur und Zweig-Struktur-Analyse.
(3) Fehlersuche
- Ändern Sie Kameraeinstellungen. Legen Sie um beste Ergebnisse zu erzielen die Belichtungszeit auf weniger als 100 ms und gewinnen Sie und so nah an 0 wie möglich auszugleichen.
- Wenn die Neuron-Wiederaufbau-Software nicht automatisch die nachgezeichneten Konturen als 3D Zelle Körper in 3D visualisieren auf Registerkarte " Trace " angezeigt wird, wählen Sie Objekte auswählen , Registerkarte " Trace ", halten Sie die Strg -Taste auf der Tastatur gedrückt und Klicken Sie auf die gezeichneten Konturen, Rechtsklick und wählen Sie dann Zellkörper Set auf die Drop-Down-Menü.
- Passen die Z-Parameter für einen einzelnen Zweig, wähle den Baum (Wählen Sie die Objekte in der Registerkarte " Trace ") und Dropdown die Z-Anpassung aller Punkte über das Rechtsklick-Menü-Liste. Wählen Sie Z-Position ändern, dann wählen Sie Shift-Z-Wert und geben Sie den gewünschten Wert.
- Neuausrichtung der Rekonstruktionen mit "Gehe zu" im Reiter " verschieben", wenn man einen großen Abstand über die Rückverfolgung bewegen muss.
- Fügen Sie zusätzliche Knoten zu jedem Zeitpunkt während des Wiederaufbaus. Wählen Sie den Zweig an der Knoten in (Objekt auswählen Registerkarte " Trace " und klicken Sie auf den Zweig), mit der rechten Maustaste platziert werden soll, und wählen Sie Einfügen-Knoten in ausgewählten Baum. Klicken Sie auf die richtige Stelle auf dem Ast.
- Wenn eine komplexe Neurone zu rekonstruieren, verfolgen Sie individuell passende Zweige zu und später verbinden sie zur leichteren Identifizierung der Zweige. Die Niederlassungen in den neuen Abschnitt einzeln zu verfolgen und dann legen diese Zweige auf den passenden Zweigen auf dem vorherigen Abschnitt, indem schwebt über das Ende des Zweiges gespleißt werden, mit der rechten Maustaste und wählen verbinden, dann schwebt über das Ende, die Zweigstelle ist gespleißt werden und klicken Sie auf.
- Wenn eine Filiale unter dem Holzweg Typ verfolgt wird, wähle den Baum mit der rechten Maustaste und wählen Sie Baum-Typ ändernund wählen Sie den richtigen Baum.
- Wenn ein Punkt nicht korrekt platziert ist, führen Sie Strg + Z, oder klicken Sie auf die Schaltfläche " Rückgängig " im Menü " Spur ", den letzten Punkt zu entfernen. Dieses Verfahren funktioniert jedoch nicht, wenn der Joystick verwendet wird, um über den Abschnitt verschieben, bevor Sie versuchen, einen Punkt zu entfernen. In diesem Fall kann der Punkt entfernt werden, wenn der Zweig beendet wird. Wählen Sie der Zweig (Presse Objekt auswählen und klicken Sie auf den Zweig), schweben über dem Punkt entfernt werden, mit der rechten Maustaste und wählen entfernen Punkt.
- Wenn Sie unsicher sind, ob zwei Branchen abgestimmt sind, entweder (1) 3D Visualisierung auf Registerkarte " Trace " verwenden, um zu überprüfen Abschnitte ob die Zweige entsprechen in der Z-Ebene, oder (2) Funktion Zeigen flankierende in Serial Section Manager zum Anzeigen sofort oberhalb und unterhalb des aktuellen Abschnitts in grau.
- Wenn ein Abschnitt gespiegelt wird, gehen Sie zu Tools in die Registerkarte " Trace " wählen Sie Anpassen Skalierung XY und X-Achse auf-1 zu ändern. Dann wählen Sie richtige Z-Schrumpfung und ändern Sie z-Achse-1 zu. Dann verfolgen Sie Filialen wie gewohnt. Denken Sie daran, diese Änderungen rückgängig zu machen, beim Umstieg auf einen Abschnitt die ursprüngliche Ausrichtung hatte. Verändert sich die x- und z - Achse wird nicht Zweig endet Etiketten zu ändern, also Vorsicht beim Spleißen, dass die richtigen Endungen verwendet werden.
- Richtige Z-Schrumpfung kann korrigiert werden, wenn es ein signifikanten Unterschied zwischen dem Bereich Dicke geschnitten und die montierten Dicke gemessen gibt. Wählen Sie in der Registerkarte " Trace " Extras, dann Z-Schrumpfung zu korrigieren, und geben Sie den Minderungsfaktor für die z-Achse als dezimale Darstellung der geschnittenen Dicke dividiert durch die montierten Dicke.
Representative Results
Neuronen im Hippocampus CA2 füllten sich mit Biocytin nach elektrophysiologische Aufnahmen (Zahlen 1Ac, Ad und 1Bc, Bd). Die Scheiben wurden über Nacht nach den Aufnahmen und der Neurochemie und morphologische Charakterisierung von Neuronen ergaben sich nach dem hier beschriebenen Protokoll.
Die Calcium-bindendes Protein oder Protein-Inhalt der gefüllten Interneuronen wurde durch Inkubation der Scheiben mit primären Antikörper und dann mit Fluoreszent markierten Sekundärantikörper bestimmt. Die Brand-Merkmale der Interneuronen während der Aufnahmen werden die Wahl der verwendeten primären Antikörper diktieren. Avidin-AMCA wurde verwendet, um die Biocytin gefüllt Interneuron visualisieren und Anti-Maus-Fluorescein erfolgt (FITC) und Ziege Anti-Kaninchen Texas Red (TR) wurden verwendet, um die interneuronale Neurochemie (Abbildung 1Bb) charakterisieren.
Im Anschluss an die Fluoreszenz-Visualisierung wurde eine HRP-Protokoll verwendet, um Biocytin (Abbildung 1Ab) offenbaren. Die feinere detaillierte Anatomie des CA2 Interneuronen wurde dann in 3D mit einem Neuron-Wiederaufbau-Software (Abbildung 2 und Abbildung 3a) gezeichnet. Eine Video von einem 3D-Rekonstruktion einer Korb-Zelle aufgenommen und in CA2 gefüllt wird im Videoangezeigt. Neuronale Rekonstruktionen galten als abgeschlossen, wenn die dendritischen und axonalen Dorne in die Tiefe des 450-500 μm Segments beschränkt waren. Armen axonalen Arbor Färbung wurde durch die Anwesenheit von abgeschnittenen Zweigen mit offenen Enden an der Ober- oder Unterseite der Scheibe oder durch eine Färbung bewertet, die auf das Axon ersten Segment und sehr proximale Äste beschränkte. Abbildung 4 stellt die Beispiele für eine gute und eine schlechte HRP Färbung folgende Biocytin Visualisierung.
Morphometrische Analyse von 3D-Rekonstruktionen (Abbildung 3) kann durchgeführt werden, Zweig Komplexität, Soma-Fläche und der Fläche und Volumen der dendritischen und axonalen Dorne zu demonstrieren.
Abbildung 1 : Neuronale Rekonstruktionen von zwei Arten von Korb Zellen aufgenommen und in der hippocampal CA2-Region gefüllt und korreliert elektrophysiologische Daten nach intrazellulären Aufnahmen erzielt in Vitro. Diese Zahl wurde von früheren Studien23,24geändert. SO Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (A) Aa: Rekonstruktion einer CA2 Korb Zelle mit eingeschränkten dendritischen und axonalen Laube mit einem Zugrohrs (1000 X). Die Dendriten sind in schwarz, und das Axon ist rot. Ab: Bild der Biocytin gefüllten Korb Zelle nach dem hier beschriebenen Avidin-HRP-Protokoll. AC: Repräsentative Spur von Spannung Responses to hyperpolarizing und depolarisierende Stromeinspeisung einer CA2 Korb Zelle mit eingeschränkten dendritischen und axonalen Arbor. Anzeige: Beispiel einer CA2 Pyramide Arbor Korb Zelle Verbindungen einschränken mit scharfen Elektroden aufgenommen. Zusammengesetzte exzitatorischen postsynaptischen Potential (EPSP) Durchschnittswerte zeigen kurze Zug Depression offensichtlich während Reaktionen auf Züge der drei Ähren. (B) Ba: 2D Rekonstruktion einer CA2 Korb Zelle mit breiten dendritischen und axonalen Dorne mit einem Zugrohrs (1000 X). Die dendritische Baum dieser Korb Zelle (in schwarz) radial durch alle Schichten der CA2-Region und horizontal in SO und SP der CA2 und CA3 Regionen erweitert. Eine horizontale Dendrit erreichte auch die CA1-Region. Das Axon (in rot) auf die CA3 und CA1 Regionen ausgeweitet. BB: Die Biocytin gefüllt (AMCA Färbung) Korb Zelle war PV-Immunopositive (FITC Färbung) und CB-Immunonegative (Texas-rote Färbung). BC: Repräsentative Spur von Spannung Responses to hyperpolarizing und depolarisierende Stromeinspeisung einer CA2 Korb Zelle mit breiten dendritischen und axonalen Arbor. BD: Composite EPSP Durchschnittswerte zeigen kurze Zug Moderation offensichtlich während Reaktionen auf Züge der drei Ähren. In früheren Studien25,30finden Sie Beispiele für andere Arten von Interneuronen in CA2 aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : 3D Zellkörper Wiederaufbau. (A) 3D Rückverfolgung der Zellkörper. Blick auf die verschiedenen Konturen an verschiedenen Z-Positionen zurückzuführen, während durch die Zellkörper mit Schwerpunkt. (B) 3D Ansicht der verschiedenen Konturen. (C) 3D Ansicht der Zellkörper in einem anderen Winkel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Morphometrie Analysen der neuronalen 3D-Rekonstruktionen. (A) 3D-Rekonstruktion einer CA2 schmale Laube Korb Zelle. Jede dendritische Verzweigung ist vertreten durch eine Farbe (grün, blau, rot und Pink) und Axon in hellblau. (B) Dendrogramm der Korb Zelle repräsentieren die Anzahl der dendritischen Zweige und Länge der einzelnen Segmente enthaltenen Kugeln konzentrisch mit dem Soma und Abständen von 100 μm aus der Soma. Die Farben auf das Dendrogramm entsprechen denen der Dendriten in A. (C) Beispiel für eine morphometrische Analyse auf CA2 Pyramidenzellen (adaptiert von einer früheren Studie23) durchgeführt. Die Zahl der dendritischen Filialen wurde gegen die Entfernung von der Soma CA2 Pyramidenzellen geplottet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Beispiele für gute (A) und Arm (B) HRP beflecken. (A) Biocytin Erholung zeigte eine sehr gut gefüllte Interneuron in CA2. Der Zellkörper (CB) ist dunkel gefärbt und hat klare Konturen. Die Dendriten sind Perlen und einige Stacheln (dargestellt durch rote Sterne) angezeigt. Die axonale Laube (A) ist dicht und kleine Boutons präsentiert. (B) Beispiel für eine schlechte dendritischen und axonalen Färbung 2 Pyramidenzellen in CA2. Die Färbung des CB ist schwach mit keine klare Gliederung. Schlechte Färbung ist oft verbunden mit kürzeren elektrophysiologische Aufnahmen, was in der Gegenwart sehr wenige Biocytin gefüllt Zweige. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Video 1: Neuronalen 3D-Rekonstruktion einer CA2 Korb Zelle mit eingeschränkten dendritischen Arbor (auch CA2 schmale Laube Korb Zelle genannt) mit seinen Soma in Stratum Pyramidale, quer durch alle Schichten und Axon CA2 Stratum Pyramidale und angrenzenden Stratum Oriens Dendriten und Radiatum. Sehr wenige Zweige erreicht der proximalen CA3 Stratum Oriens und CA3 Stratum Pyramidale. Diese Zelle wurde mit Biocytin nach elektrophysiologische Aufnahmen gefüllt und Abschnitte mit Avidin-HRP nach dem hier beschriebenen Protokoll verarbeitet wurden. Durch Schneiden, wurde nur das Axon in die Tiefe des Segments erholt, obwohl die Dendriten intakt sind. Dendriten sind dunkelrosa und Axon in weiß. Schicht und Region Grenzen wurden am Anfang des Videos hinzugefügt. 3D-Rekonstruktion von Georgia Economides-3D Video von Svenja Falk. Das Video wurde aufgenommen mit einem Neuron-Wiederaufbau-Software wie in Schritt 2.17 angegeben und mit einem Video-editing-Software bearbeitet. Link zum Video:30. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.
| Lösungen verwendet | Zusammensetzung/Anweisungen |
| Fixierung-Lösung | 4 % Paraformaldehyd, gesättigte 0,2 % Pikrinsäure, Lösung 0,025 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) |
| 0,1 M Phosphatpuffer pH 7.6 | Fügen Sie 100 mL von Lager 1 M Phosphat-Puffer zu 900 mL destilliertem Wasser hinzu |
| Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH-Wert 7,4/7,5 | Fügen Sie 10 mL 0,1 M Phosphatpuffer, 0,2 g KCl und 8,76 g NaCl bis 990 mL destilliertes Wasser |
| TRIS-Puffer pH 7,5 | 5,72 g Tris-Hydrochlorid und 1,66 g Tris-Base in 50 mL destilliertem Wasser auflösen. Dann machen Sie bis zu 1 L mit destilliertem Wasser. |
| Gepufferte Glutaraldehyd und Paraformaldehyd Fixativ Lösung | 4 % Paraformaldehyd, gesättigte 0,2 % Pikrinsäure, Lösung 0,025 % Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer. |
| ABC-Lösung | Lösung für mindestens 30 min vor Gebrauch aus dem ABC-Kit gemacht werden. Fügen Sie 1 Tropfen der Lösung A und 1 Tropfen der Lösung B bis 2,5 mL PBS. |
| Durcupan Epoxidharz: | Zu 20 Töpfe: 20 g der Komponente A, 20 g der Komponente B, 0,6 g der Komponente C und 0,4 g Komponente D - |
| Schützen Sie das Gleichgewicht von Leckagen durch die Abdeckplatte mit einem Kreis von Filterpapier. Sorgfältig abwägen der Reagenzien in einen Tripour Becher im oben genannten Verhältnis. Mischen Sie gründlich, indem mit zwei Holzstäbchen für mindestens 5 min kräftig rühren. Die Mischung sollte eine gleichmäßige Dichte dunkelbraune Farbe geworden. Stellen Sie den Becher in den Ofen bei ~ 50 ° C für maximal 10 min so viele Luftblasen wie möglich zu entfernen. Hinweis: Das Harz beginnt zu heilen, wenn Sie dem Becher in den Ofen länger als 10 min. Dekantieren des Harzes in Plastiktöpfen oder 5 mL Spritzen weglassen, sie datieren und in den-20 ° C-Gefrierschrank einsatzbereit speichert. |
Tabelle 1: Tabelle der Lösungen.
Discussion
Elektrophysiologische Aufnahmen in Vitro (Abbildung 1 Ac,d und v. Chr., d) kombiniert mit histochemische und immunhistochemische Verfahren ermöglichen die detaillierte Morphologie, verbindliches Proteingehalt an Calcium und Identität des Erwachsenen kortikale Interneurone aufgezeichnet offenbart werden. In der CA2-Region, diese Technik erlaubt die Studie der lokalen Schaltung zum ersten Mal und offenbart Unterklassen von Interneuronen, die zuvor nicht in CA1 oder CA3 beschrieben hatte: breit dendritischen und axonalen Arbor Korb Zellen (Abbildung 1 b), Bistratified Zellen und SP-SR Interneuronen.
Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um die Ultrastruktur der Neuronen zu bewahren und erhalten ausgezeichnete Erholung der dendritischen (einschließlich Stacheln) und axonalen Dorne. Kritischen Schritte umfasst die Verwendung der doppelten Fixierung Technik zur Verbesserung der Kontrast für Lichtmikroskopie26 und die Zugabe von Glutaraldehyd und Pikrinsäure Lösung zur Fixativ Lösung Antikörper eindringen Verbesserung und Erhaltung der neuronalen Ultrastruktur27. Frost-Tausalz-sanfte Permeabilisierung gibt bessere Erhaltung der Feinstruktur, während Osmication und Harz einbetten Z-Plane Schrumpfung28reduzieren. Darüber hinaus ist die Visualisierung von sehr feinen Strukturen (Axone mit kleinen Boutons z. B. feine) verbessert durch Inkubation in den Abschnitten mit H2O2 und NaBH4 Hintergrundfärbung reduzieren. Kontrast kann auch mit dem Zusatz von NiCl2 der HRP-Reaktion erhöht werden.
Die histologische Verfahren detailliert hier bietet hervorragende Ergebnisse hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit. Allerdings bestimmt die Dauer der elektrophysiologischen Aufnahmen die Qualität der Färbung, mit kürzeren Aufnahmen meist verbunden mit schlechten axonalen Färbung Biocytin/Fluoreszenz. Die Wahl der Aufnahme Protokolle (intrazelluläre Aufnahmen mit scharfen Elektroden vs. ganze Zelle Patch spannen) kann auch Biocytin Aufbewahrung und Erhaltung der feinen Anatomie beeinflussen.
Während die Schwierigkeiten in Feinstruktur in histologischen Verarbeitung hier beschrieben und die Zeit genommen, bei 100 X Vergrößerung (1-4weeks abhängig von der Komplexität des Axons) rekonstruieren die Erhaltung sind willkommen, diese Methode gibt eine genaue Darstellung der dendritischen und axonalen Durchmesser. Die Verwendung von weniger anspruchsvolle Protokolle, Biocytin Kennzeichnung zu offenbaren ist verständlich, aber diese häufig klare Visualisierung der feinen axonalen Verzweigungen entgegen. Reinigungsmittel, Eintrag von Avidin-HRP Biocytin und Antikörper, enthüllen zu fördern sind oft in dicke Schichten notwendig, aber Feinstruktur stören können. Neurowissenschaftler Suche ständig für halbautomatische Methoden der Rekonstruktion, sondern für bleibt jetzt sowie für Axone insbesondere Biocytin-HRP mit manuellen Rekonstruktion der Gold-Standard-31.
Hochdetaillierte neuronale Rekonstruktionen, besonders genaue Zeichnungen der axonalen Boutons und Knoten, das Vorhandensein oder Fehlen von Myelin und ganz allgemein die Zeichnung des kompletten axonalen Laube, mit der Darstellung der genauen Axon-Durchmesser ändert sich entlang seiner Länge, finden Sie weitere Informationen für die genaue Identifizierung eines unterschiedlichen Typs Interneurone. Obwohl viele Interneurone nicht genau in einer bestimmten Klasse passen, bietet die oben beschriebene Technik korrelierte Daten auf neuronale elektrophysiologischen Eigenschaften, die kurzfristige Plastizität im Zusammenhang mit einer bestimmten Art von Verbindung und detaillierte neuronaler Rekonstruktionen, so dass den Schaltplan in der CA2-Region, zum Beispiel im Detail untersucht werden.
Feine, detaillierte Struktur wird oft in Rechenmodelle vereinfacht. Zwar verständlich, führt dies zum Verlust von Informationen, die in Zukunft kritisch erweisen könnte. Analyse der detaillierte 3D Rekonstruktionen mit parallelen synaptischen Daten ermöglicht die Zugabe von weiteren Kriterien für die interneuronale Einstufung. Daten können in öffentlichen Repositories hinterlegt und werden durch Modellbauer, um das Ergebnis der sporadische Änderungen im Axon Durchmesser und Myelinisierung auf Aktionspotential Ausbreitung rechnerisch zu erkunden.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wird finanziell unterstützt von Novartis Pharma (Basel) und dem Medical Research Council ausgezeichnet zu Prof. Alex Thomson, der Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), der physiologischen Gesellschaft der Europäischen Union Horizon 2020 Rahmenprogramm für Forschung und Innovation im Rahmen der spezifischen Grant Agreement Nr. 720270 (menschliche Gehirn Projekt SGA1) und unter bestimmten Grant Agreement Nr. 785907 (menschliche Gehirn Projekt SGA2). Wir sind sehr dankbar, Prof. Alex Thomson, zum Aufbau des Protokolls in anderen kortikalen Regionen, die Sicherung der Finanzierung und für ihre kontinuierliche Unterstützung für dieses Projekt. Beiträge von Lab-Mitglieder, die geholfen, Optimierung der Erholung-Protokoll und rekonstruiert CA2 Neuronen sind dankbar anerkannt: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
| Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
| 3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
| Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
| Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
| Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
| Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
| Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
| Gelatin | Sigma | 48723 | |
| Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
| Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
| Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
| Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
| Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
| Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
| Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
| Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
| Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
| Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
| Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
| Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
| Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
| Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
| Equipment used | |||
| Vibratome | Agar Scientific | ||
| C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
| Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
| X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
| Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
| 0.18 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
| 0.25 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
| Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
| Glass vials 14 mL | Fisher scientific |
References
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Bezaire, M. J., Soltesz, I. Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus. 23, 751-785 (2013).
- Katona, L., et al. Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus. Hippocampus. 27, 359-377 (2017).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus. Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
- Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat. Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).
- Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus. European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).
- Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus. Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).
- Thomson, A. M., Lamy, C. Functional maps of neocortical local circuitry. Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Wilent, W. B., Nitz, D. A. Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons. Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).
- Hirsch, J. A., Martinez, L. M. Laminar processing in the visual cortical column. Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).
- Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep. Nature. 531, 185-190 (2016).
- Yu, J. Y., et al. Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility. eLife. 6, e27621 (2017).
- Markram, H., et al. Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry. Cell. 163, 456-492 (2015).
- Van Geit, W., et al. BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience. Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17 (2016).
- Gal, E., et al. Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry. Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).
- Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro. Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).
- Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex. Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).
- West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs. Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).
- Bannister, A. P., Thomson, A. M. Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex. Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).
- Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus. Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).
- Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).
- Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation. Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).
- Somogyi, P., Takagi, H. A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry. Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).
- Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).
- Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104 (2014).
- Mercer, A., Thomson, A. M. Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers? Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83 (2017).
- Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65 (2014).
