Le protocole décrit ici décrit immunofluorescence analyse, récupération de la biocytine et reconstitutions de haute qualité d’hippocampe CA2 interneurones suivant le permettant des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires in vitro, neuronale caractérisation et finalement fine anatomie neuronale à étudier.
Comment l’activité réseau cortical traite information est d’importance pour un grand nombre de questions scientifiques fondamentales et cliniques. Le protocole décrit ici identifie les éléments de base de ce circuit. Les études approfondies des régions corticales fournira finalement autres scientifiques avec les composants du circuit nécessaires pour comprendre comment le cerveau acquiert, traite et stocke les informations et ce qui ne va pas dans la maladie, tandis que l’électrophysiologiques et les données morphologiques sont largement utilisées par les chercheurs en neurosciences computationnelles dans la construction de réseaux de modèle qui explorent le traitement de l’information. Le protocole décrit ici décrit comment les cellules remplies de la biocytine recensés dans la région CA2 de l’hippocampe sont récupérés et reconstruits ensuite en 3D. En outre, le protocole décrit la démonstration de calcium liaison protéique ou peptidique contenu dans des interneurones enregistrés.
Le cortex et l’hippocampe sont des structures d’une telle complexité que la classification des neurones sous-types1,2,3,4, cartes des inter-connexions5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 et comment ce circuit prend en charge les fonctions cognitives12,13,14,,15 sont encore à l’étude intense et l’objet de poursuite du débat. Par exemple, pour comprendre les détails et la complexité des circuits et de coordonner les données obtenues à partir de nombreuses études différentes, il est extrêmement utile d’être capable de définir et de décrire les composants, mais il reste matière à débat comment beaucoup d’autres classes de neurones existent, ou même s’il est possible de définir tous les neurones comme appartenant à une classe spécifique. Outils informatiques qui peuvent construire et tester des circuits avec des degrés de complexité sont développés16,17,18, mais centrale de ces efforts est la nécessité pour des études détaillées des types de cellules et des propriétés des connexions entre eux. Une grande quantité d’informations sur les circuits locaux du néocortex de rats adultes ont déjà été collectée en utilisant le protocole décrit ici10,19,20,21, 22. bien que le « schéma de câblage » est loin d’être achevée, certains clairement motifs ou règles sont apparues. En outre, bien que certains détails varient, ces règles sont communes aux deux espèces de mammifères (rat et chat) et dans plusieurs régions néocorticales, permettant le développement de modules de base qui sont susceptibles de s’appliquer également au néocortex humain. La technique décrite ici permet d’étendre nos connaissances sur le plan fonctionnel des circuits corticaux en identifiant les neurones présynaptiques et postsynaptiques impliqués dans les connexions dans les régions qui n’ont pas été étudiées en détail avant, à l’aide d’un protocole qui permet la préservation des tissus excellent et remarquable reprise de coloration dans les tissus du cerveau adulte. Données sur les circuits locaux Ca2 et propriétés neuronales dans ce sous-domaine ont été recueillies grâce à cette méthode en combinant des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires (enregistrements appariés avec des microélectrodes pointus) avec la biocytine remplissage, immunofluorescence, procédures histologiques et reconstitutions neuronales très détaillées, ce qui permet une comparaison directe avec les voisins CA régions23,24,25.
La technique décrite dans cet article a été mis au point au cours des années pour obtenir l’anatomie détaillée neuronal permettant le classement correct des cellules et de haute qualité et des reconstructions précises des deux leurs arbres dendritiques et axonales, données qui peuvent être en corrélation avec données électrophysiologiques des enregistrements appariés à l’aide d’électrodes pointus. Le protocole histologique a été optimisé pour préserver l’ultrastructure des neurones et obtenir excellente récupération de dendritiques (y compris épines) et tonnelles axonales. Par exemple, le principe de la technique de double fixation par tout d’abord en plongeant dans une solution de fixation et deuxièmement après fixation au tétroxyde d’osmium donne un bon contraste pour la microscopie photonique,26. Une petite quantité de solution d’acide picrique et de glutaraldéhyde sont ajoutés à la solution de fixation pour améliorer la pénétration de l’anticorps et de préserver l’ultrastructure des cellules comme suggéré dans une précédente étude27. La perméabilisation des tranches de cerveau en utilisant la méthode de gel-dégel, combinée à la cryo-protection avec saccharose, plutôt qu’un détergent classique, fournit également une préservation optimale des tissus pour une analyse morphologique détaillée des cellules enregistrées. En outre, la visualisation en particulier de très beaux structures est améliorée en réduisant à la coloration de fond, avec les incubations avec peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le borohydrure de sodium (NaBH4). Ajout de chlorure de nickel (NiCl2) à la peroxydase de raifort (HRP) réaction pour obtenir un produit de réaction du pigment noir augmente également le contraste.
Le protocole suivant décrit les procédures utilisées pour s’assurer la préservation des tissus excellent et très détaillées reconstructions 3D neuronales après des enregistrements intracellulaires in vitro. La description de la préparation de la tranche, enregistrements intracellulaires de paires à l’aide de tranchant électrodes et les procédures suivantes histologiques utilisés dans notre laboratoire ont été rapportées antérieurement28. Bien que le protocole s’applique aux cellules remplis dans les cellules de la biocytine en tranches épaisses de 450 à 500 μm, le même protocole peut être utilisé après les enregistrements de cellules entières. Cependant, l’utilisation de plus minces tranches entraînera des reconstructions moins complètes des cellules.
Des enregistrements électrophysiologiques in vitro (Figure 1 Ac,d et Bc, d) combiné avec histochimiques et immunohistochemical procédures permettent la morphologie détaillée, la teneur en calcium binding protein et identité des interneurones corticaux adultes enregistrés pour être révélé. Dans la région CA2, cette technique a permis l’étude des circuits locaux pour la première fois et a révélé des sous-classes des interneurones qui n’avaient pas été précédemment décrits dans CA1 ou CA3 : cellules de panier large dendritiques et axonales arbor (Figure 1 b), les cellules bistratified et interneurones SP-SR.
Le protocole décrit ici a été optimisé pour préserver l’ultrastructure des neurones et obtenir excellente récupération de dendritiques (y compris épines) et tonnelles axonales. Étapes critiques comprend l’utilisation de la technique de fixation double pour renforcer le contraste pour la microscopie photonique26 et l’addition de solution de glutaraldéhyde et d’acide picrique à la solution de fixation pour améliorer la pénétration de l’anticorps et de préserver les neurones l’ultrastructure27. Doux gel-dégel perméabilisation donne meilleure préservation de la structure fine, tandis qu’osmication et résine enrobage réduisent rétrécissement plan z28. En outre, la visualisation des mêmes structures fines (fine des axones avec petits boutons par exemple) est améliorée en incubant les sections avec H2O2 et de NaBH4 afin de réduire la coloration de fond. Contraste peut également être augmentée avec l’ajout de NiCl2 à la réaction de HRP.
La procédure histologique détaillée ici donne d’excellents résultats en termes de fiabilité et de reproductibilité. Toutefois, la durée des enregistrements électrophysiologiques déterminera la qualité de la biocytine/fluorescence coloration, avec des enregistrements plus courts habituellement associés aux pauvres coloration axonale. Le choix de l’enregistrement des protocoles (enregistrements intracellulaires utilisant des électrodes pointus vs cellule entière patch serrage) peut-être influencer également la biocytine rétention et la préservation de l’anatomie fine.
Alors que les difficultés rencontrées en préservant la structure fine pendant traitement histologique décrits ici et le temps pris pour reconstruire au grossissement X 100 (1-4 semaines selon la complexité de l’axone) sont appréciés, cette méthode donne une représentation précise des diamètres dendritiques et axonales. L’utilisation de moins exigeants des protocoles pour révéler la biocytine-étiquetage est compréhensible, ceux-ci empêchent cependant souvent visualisation claire des fines branches axonales. Détergents, afin de faciliter l’accès de l’avidine-HRP pour révéler la biocytine et anticorps, sont souvent nécessaires en épaisseur importante, mais peuvent perturber la structure fine. Neuroscientifiques recherche constamment des méthodes semi-automatiques de reconstruction, mais, pour aujourd’hui et pour les axones en particulier, la biocytine-HRP avec reconstruction manuelle demeure l’ étalon-or31.
Très détaillées des reconstructions neuronales, notamment des dessins précis de boutons axonales et nœuds, la présence ou l’absence de myéline et plus généralement le dessin d’arbor axonale complet, avec la représentation d’axone-diamètre exact change le long de ses longueur, fournir des informations pour identifier avec précision d’un type distinct d’interneurone complémentaires. Bien que nombreux interneurones peuvent ne pas correspondre exactement à une classe spécifique, la technique décrite ci-dessus fournit des données corrélées sur propriétés électrophysiologiques neuronales, la plasticité à court terme associées à un type de connexion spécifique et détaillée reconstructions neuronales, permettant ainsi le schéma de câblage, dans la région CA2, par exemple, d’étudier en détail.
Structure fine et détaillée est souvent simplifiée dans des modèles de calcul. Bien que compréhensible, cela se traduit par la perte de l’information qui pourrait s’avérer cruciale dans l’avenir. Analyse des reconstructions 3D détaillées avec données synaptiques en parallèle permettra l’ajout d’autres critères de classification interneuronales. Données peuvent être déposées dans les dépôts publics et utilisées par les modélisateurs pour découvrir le résultat de changements sporadiques dans le diamètre de l’axone et la myélinisation sur la propagation des potentiels d’action par le calcul.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a reçu un financement de Novartis Pharma (Bâle) et le Medical Research Council, adjugé à Prof Alex Thomson, Biotechnology and de Biological Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), la société de physiologie, l’Union européenne Horizon 2020 Programme-cadre pour la recherche et l’Innovation au titre de la subvention spécifique contrat n° 720270 (Human Brain Project SGA1) et au titre de la subvention spécifique contrat n° 785907 (Human Brain Project SGA2). Nous sommes extrêmement reconnaissants à Prof Alex Thomson pour la mise en place du protocole dans d’autres régions corticales, d’obtenir des fonds et pour son soutien continu pour ce projet. Contributions de lab-membres, qui a contribué à l’optimisation du protocole de récupération et reconstruit CA2 neurones sont tient à reconnaître : J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |