פרוטוקול שמפורטות כאן מתאר את ניתוח immunofluorescence, biocytin השחזור של שחזורים באיכות גבוהה של interneurons CA2 בהיפוקמפוס בעקבות את הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תאיים במבחנה, ומאפשר עצביים אפיון, בסופו של דבר בסדר אנטומיה עצביים שילמדו.
איך פעילות רשת בקליפת המוח מעבד מידע יש חשיבות למספר רב של שאלות מדעי בסיסי וקליני. הפרוטוקול המתואר כאן מזהה אבני הבניין הבסיסיות של המעגלים הזאת. המחקרים מעמיק של אזורים קורטיקליים יספק בסופו של דבר לצורך הבנה של איך המוח רוכשת מדענים אחרים עם הרכיבים במעגל, מעבדת ושומרת מידע, מה משתבש במחלה, ואילו אלקטרופיזיולוגיות נתונים מורפולוגיים נמצאים בשימוש נרחב על ידי מדעני מוח חישובית בבנייה של רשתות דגם לחקור עיבוד מידע. פרוטוקול שמפורטות כאן מתאר כיצד תאים מלא biocytin הקליטה באזור CA2 ההיפוקמפוס הם לשחזר ולאחר מכן שיחזר ב- 3D. בנוסף, הפרוטוקול מתאר ההפגנה של סידן מחייב חלבון או פפטיד תוכן interneurons המוקלט.
קליפת ההיפוקמפוס הם מבנים של מורכבות כאלה כי הסיווג של עצביים תת1,2,3,4, מפות של הקשרים ביניהם5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 איך המעגלים הזה תומך תפקודים קוגניטיביים12,13,14,15 נמצאים עדיין בשלבי מחקר אינטנסיבי, הנושא של הדיון המתמשך. לדוגמה, כדי להבין את הפרטים ואת המורכבות של המעגלים וכדי לתאם והנתונים שהתקבלו ממחקרים שונים רבים, זה עוזר מאוד שתוכל להגדיר ולתאר את הרכיבים, אבל זה נשאר עניין לדיון כמה שונים סוגי נוירונים קיימים, או אפילו האם זה אפשרי להגדיר את כל הנוירונים כשייך מחלקה מסוימת. כלים חישוביים זה ניתן לבנות ולבדוק מעגלים עם דרגות שונות של מורכבות מתבצעת מפותחת16,17,18, אבל מרכזי במאמצים אלה הוא הצורך ללימודי מפורט הסוגים התא ואת המאפיינים של הקשרים ביניהם. כמות גדולה של מידע על המעגלים המקומיות של קליפת של עכברים בוגרים שכבר נאסף באמצעות הפרוטוקול המתוארים כאן10,19,20,21, 22. למרות “חיווט תרשים” רחוקה מלהיות מלאה, יש לנקות את דפוסי או כללים הופיעו. יתר על כן, למרות כמה פרטים משתנים, כללים אלה נפוצים שני מינים יונקים (חולדה וחתול) ועל -פני מכמה אזורים neocortical, המאפשר הפיתוח של אבני היסוד אשר צפויים להיות ישים באותה מידה וקליפת אנושי. בטכניקה המתוארת כאן משמש כדי להרחיב את ההבנה שלנו של המפה פונקציונלי של המעגלים בקליפת המוח על-ידי זיהוי הנוירונים presynaptic ו postsynaptic מעורב חיבורים באזורים אשר לא נחקרו בפירוט בעבר, באמצעות פרוטוקול המאפשר שימור רקמות מצוינת ושחזור מכתימים מדהים ברקמת המוח למבוגרים. נתונים על המעגלים המקומיות ב CA2 ומאפיינים עצביים ב הזה כתת-תחום שנאסף באמצעות שיטה זו על ידי שילוב הקלטות תאיים אלקטרופזיולוגים (מזווג הקלטות עם microelectrodes חדה) עם מילוי, biocytin immunofluorescence, נהלים היסטולוגית ושיחזור הפערים מפורט עצביים, המאפשר השוואה ישירה עם השכן CA אזורים23,24,25.
בטכניקה המתוארת במאמר זה פותחה במשך השנים כדי להשיג את האנטומיה עצביים מפורט המאפשר הסיווג הנכון של תאים באיכות גבוהה שחזורים מדויקים של שני שלהם דנדריטי ואת עצב ובשבילים, נתונים יכול להיות בקורלציה עם אלקטרופיזיולוגיות הנתונים שנאספו מן הקלטות לזווג באמצעות אלקטרודות חדה. פרוטוקול היסטולוגית מוטבה כדי לשמר את ultrastructure של הנוירונים ולקבל להתאוששות מצוין (כולל הדנדריטים) וגם ובשבילים עצב. לדוגמה, העיקרון של הטכניקה קיבוע כפול על-ידי ראשית אנו ממליצים פתרון מקבע ותיקון שנית פוסט באוסמיום ארבע-חמצני נותן קונטרסט טוב מיקרוסקופ אור26. כמות קטנה של חומצה picric פתרון גלוטראלדהיד יתווספו הפתרון לשבועיים כדי לשפר את הנוגדן חדירה ולשמור על ultrastructure התאים כפי שהוצע המחקר הקודם27. Permeabilization הפרוסות המוח באמצעות שיטת ההקפאה-הפשרה בשילוב עם הקפאה-הגנה עם סוכרוז, יותר מאשר חומר ניקוי מסורתית, מספק גם אופטימלית שימור הרקמות עבור ניתוח מורפולוגי מפורט של התאים המוקלט. בנוסף, החזיית במיוחד ומבנים מאוד משופרת על-ידי הפחתת צביעת הרקע, עם incubations עם מי חמצן (H2O2), נתרן borohydride (NaBH4). הוספת ניקל כלורי (NiCl2) חזרת peroxidase (HRP) התגובה לשם השגת מוצר התגובה פיגמנט שחור גם מגביר את החדות.
הפרוטוקול הבא מתאר את ההליכים נהגו לברר שימור רקמות מעולה, מאוד מפורט שחזורים תלת-ממד עצביים בעקבות הקלטות תאיים במבחנה. התיאור של הכנת פרוסה, הקלטות לזווג תאיים באמצעות חדים אלקטרודות, הבאים הליכים היסטולוגית המשמשים במעבדה שלנו היה שדווחה בעבר28. למרות הפרוטוקול חל על התאים מלאים intracellularly biocytin לפרוסות עבות μm 450-500, באותו הפרוטוקול עשוי לשמש בעקבות הקלטות תאים שלמים. עם זאת, השימוש של פרוסות דק יותר תגרום פחות מלאה שחזורים של התאים.
הקלטות אלקטרופיזיולוגיות במבחנה (איור 1 Ac,d ו- לפנה ס, d) בשילוב עם פתולוגיה ולהפעיל הליכים immunohistochemical את תאור מפורט, סידן מחייב חלבון תוכן, זהותו של interneurons קורטיקלית למבוגרים הקליט להתגלות. באזור CA2, טכניקה זו אפשרה את חקר המעגלים המקומיות בפעם הראשונה וגילה מחלקות של interneurons זה היה לא תוארה בעבר CA1 או CA3: תאים דנדריטים של עצב ארבור סל (איור 1B), bistratified התאים, SP-SR interneurons.
הפרוטוקול המתואר כאן מוטבה כדי לשמר את ultrastructure של הנוירונים ולקבל להתאוששות מצוין (כולל הדנדריטים) וגם ובשבילים עצב. שלבים קריטיים כוללת את השימוש בטכניקה קיבוע כפול כדי לשפר את הניגודיות של מיקרוסקופ אור26 ותוספת של פתרון גלוטראלדהיד וחומצה picric הפתרון מקבע נוגדן חדירה לשפר ולשמר את עצביים ultrastructure27. הקפאת עדין-הפשרה permeabilization נותן יותר לשימור המבנה הדק, בעוד osmication והטבעה שרף להפחית את מטוס ה-z הצטמקות28. בנוסף, החזיית מאוד ומבנים (בסדר אקסונים עם קטן עם העיתון ons לדוגמה) משופרת על ידי המקננת הסעיפים עם2O H2 ו- NaBH4 כדי להפחית את הרקע מכתים. ניתן להגדיל חדות גם עם התוספת של NiCl2 כדי התגובה HRP.
ההליך היסטולוגית מפורט כאן מציע תוצאות מצוינות מבחינת הפארמצבטית ואמינות. עם זאת, משך הזמן של ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות יקבע את האיכות של כתמים, עם הקלטות קצר בדרך כלל מקושר עם צביעת עצב המסכן biocytin/קרינה פלואורסצנטית. הבחירה של הקלטה פרוטוקולים (הקלטות תאיים באמצעות אלקטרודות חדה לעומת תאים כל תיקון מחבר חובק למעקה) עשויים להשפיע גם biocytin השמירה ושימור אנטומיה משובחים.
למרות הקשיים נתקל שימור המבנה הדק במהלך עיבוד היסטולוגית המתוארים כאן, לוקחים את הזמן כדי לשחזר בהגדלה X 100 (1-4weeks בהתאם למורכבות האקסון) יתקבלו בברכה, ששיטה זו מאפשרת ייצוג מדויק של קטרים דנדריטים, עצב. השימוש פחות פרוטוקולים בדרישה לחשוף biocytin labelling הוא מובן, עם זאת, אלה לעיתים קרובות למנוע חזותי ברור של ענפי עצב בסדר. דטרגנטים, כדי לקדם את כניסת אבידין-HRP כדי לחשוף את biocytin ואת נוגדנים, נדרשים לעיתים קרובות בסעיפים עבה, אך יכול לשבש את המבנה הדק. מדעני מוח חיפוש ללא הרף לשיטות שחזור אוטומטי, אבל, עכשיו ולעולם אקסונים במיוחד, biocytin-HRP עם שחזור ידני נשאר תקן הזהב31.
מאוד מפורט שחזורים עצביים, במיוחד מדויק ציורים של עצב עם העיתון ons, צמתים, נוכחות או היעדרות של מיאלין, באופן כללי יותר הציור של ארבור עצב מלאה, עם ייצוג מדויק קוטר האקסון משתנה לאורך שלה אורך, לספק מידע לצורך זיהוי מדויק של סוג ייחודי של interneurone נוסף. למרות interneurons רבים עשויים לא להתאים בדיוק לתוך מחלקה מסוימת, בטכניקה המתוארת לעיל מספקת נתונים מתואם על מאפייני אלקטרופיזיולוגיות עצביים, פלסטיות לטווח קצר המשויך סוג ספציפי של חיבור ומפורט שחזורים עצביים, המאפשר את דיאגרמת החיווט, באזור CA2, לדוגמה, שילמדו בפירוט.
בסדר, מפורט מבנה היא פשוטה יותר לעיתים קרובות במודלים חישובית. בעוד מובן, התוצאה האובדן של מידע שיכול להוכיח הקריטי בעתיד. ניתוח של נתונים היסטוריים שחזורים תלת-ממד עם נתונים מקבילים סינפטית תאפשר התוספת של עוד קריטריונים לסיווג interneuronal. נתונים יכול להיות שהופקדו מאגרים ציבוריים ואת בשימוש על ידי בוני הדגמים לחקור את התוצאה של שינויים סדיר קוטר האקסון myelination על פוטנציאל הפעולה הפצת שהמפתחות.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה קיבל מימון לבין המועצה למחקר רפואי מוענק פרופ אלכס תומסון, ביוטכנולוגיה, מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC-BB/G008639-1), החברה פיזיולוגיים, האיחוד האירופי של נוברטיס פארמה (באזל) אופק 2020 תכנית המסגרת עבור מחקר וחדשנות מתחת לנתיב הסכם ספציפי גרנט 720270 (המוח האנושי פרוייקט SGA1) ותחת לנתיב הסכם ספציפי גרנט 785907 (SGA2 פרוייקט מהמוח האנושי). אנו מודים מאוד על פרופסור אלכס תומסון עבור הגדרת פרוטוקול אזורים קורטיקליים אחרים, הבטחת המימון, תמיכה שוטפת שלה עבור פרוייקט זה. התרומות שנעשו על ידי המעבדה-חברים אשר עזר אופטימיזציה פרוטוקול השחזור, שיחזר CA2 neurones הם בתודה הודה: ג’יי Deuchars, ה Pawelzik, ד א יוז, בניסטר עמ’ א, ק Eastlake, Trigg ה, ש א Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |