Burada özetlenen protokolünü ayirt analizi, biocytin kurtarma ve hücre içi elektrofizyolojik kayıtlar in vitro nöron izin takip hipokampal CA2 interneurons yüksek kaliteli rekonstrüksiyonlar açıklar karakterizasyonu ve belirlenmesi için sonuçta iyi nöronal anatomisi.
Kortikal ağ etkinliğini işler nasıl bilgi çok sayıda temel ve klinik bilimsel sorular için önem taşımaktadır. Burada açıklanan protokol temel yapı taşları olan bu devreyi tanımlar. Kortikal bölgelerde ayrıntılı çalışmalar sonunda devre elemanları ile diğer bilim adamları beyin nasıl edinme bir anlayış için gerekli, işler ve bilgi ve ne hastalığında ise elektrofizyolojik terslik depolar sağlayacaktır ve morfolojik veri bilgi işleme keşfetmek modeli ağları inşaat Hesaplamalı nörologlar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada özetlenen protokolünü açıklar nasıl biocytin dolu hücreleri oluşur CA2 bölgede kaydedilen kurtarıldı ve 3D yeniden. Ayrıca, kalsiyum bağlayıcı protein veya peptid kaydedilen interneurons içerik gösteri protokolünü açıklar.
Korteks ve hipokampus nöronal sınıflandırılması1,2,3,4, onları arasındaki bağlantıları haritalar5,6 alt türlerinden ki böyle karmaşıklık yapılardır , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 ve nasıl bu devre bilişsel işlevler12,13,14,15 destekler hala yoğun çalışma ve sürekli tartışma konusu altında bulunmaktadır. Örneğin, Ayrıntılar ve devreyi karmaşıklığı anlamak ve birçok farklı çalışmalardan elde edilen veriler koordine etmek tanımlamak ve bileşenleri tanımlamak edebilmek son derece yararlı olur, ancak bir konu tartışma için nasıl kalır çok farklı nöronların sınıfları var, ya da düz olup bütün nöronlar belirli bir sınıfa ait olarak tanımlamak mümkündür. Yapı ve devreleri derecelerde karmaşıklığı ile test hesaplama araçları Gelişmiş16,17,18davranıyorsun, ama detaylı çalışmalar hücre tiplerinin ihtiyacını bu çabalar için merkezi bir noktada bulunuyor ve aralarındaki bağlantıları özellikleri. Yetişkin fareler yeni korteksimiz yerel devre hakkında bilgi büyük miktarda zaten kullanılarak toplanmış protokol burada10,19,20,21, anlatılan 22. her ne kadar “bağlantı şeması” uzak tamamlandıktan, bazı desenler açık veya kurallar ortaya çıkmıştır. Her ne kadar bazı ayrıntılar değişir, Ayrıca, bu kurallar için insan yeni korteksimiz eşit uygulanabilir olması muhtemeldir temel yapı taşları gelişimi sağlayan iki memeli türü (fare ve kedi) ve birçok neocortical yerinde, yaygındır. Burada açıklanan tekniği kortikal devresi fonksiyonel Haritası anlayışımızı presynaptic ve postsinaptik nöronların bağlantılarını daha önce ayrıntılı bir iletişim kuralı kullanılarak incelenmiştir değil bölgelerde yer tespit ederek genişletmek için kullanılan Bu yetişkin beyin dokusunda mükemmel doku koruma ve dikkat çekici boyama kurtarma sağlar. CA2 yerel devre ve nöronal bu alt alan özelliklerinde veri doldurma biocytin ile hücre içi elektrofizyolojik kayıtlar (keskin microelectrodes ile eşleştirilmiş kayıtları) birleştirerek bu yöntemle toplanmıştır, ayirt, histolojik yordamlar ve komşu CA bölgeleri23,24,25ile doğrudan karşılaştırma izin nöronal rekonstrüksiyonu, çok detaylı.
Bu makalede açıklanan tekniği detaylı nöronal anatomi hücreleri ve yüksek kaliteli doğru sınıflandırılması ve her iki onların dendritik ve aksonal arbors, olabilecek veriler doğru rekonstrüksiyonlar izin vererek elde etmek için yıllar boyunca geliştirilen keskin elektrotları kullanarak eşleştirilmiş kayıtları toplanan elektrofizyolojik verilerle ilişkili. Histolojik protokolü, nöronlar ultrastructure korumak ve dendritik (dahil dikenleri) ve aksonal arbors mükemmel kurtarma elde etmek için en iyi duruma getirilmiş. Örneğin, ilk olarak bir sabitleştirici çözümde çeker ve ikincisi osmiyum tetroxide sonrası sabitleme tarafından Çift Kişilik fiksasyon tekniği prensibi ışık mikroskobu26için iyi bir kontrast sağlar. Oxazolidin ve bir çözüm pikrik asit az miktarda antikor penetrasyonu artırmak için ve önerilen bir önceki çalışma27‘ deki hücre ultrastructure korumak için sabitleştirici çözüm için eklenir. Cryo-koruma geleneksel bir deterjan yerine sukroz ile birlikte donma-çözülme yöntemini kullanarak beyin dilimler permeabilization de kaydedilen hücre detaylı morfolojik analiz için dokuların en iyi koruma sağlar. Buna ek olarak, özellikle çok güzel yapıların görselleştirme incubations hidrojen peroksit (H2O2) ve sodyum borhidrür (NaBH4) ile arka plan boyama azaltarak artırıldı. Nikel klorür (NiCl2) horseradish peroksidaz (HRP) ekleyerek bir siyah pigment reaksiyon ürünü elde etmek için tepki de karşıtlığı artırır.
Aşağıdaki iletişim kuralı mükemmel doku koruma ve son derece detaylı nöronal 3D rekonstrüksiyonlar hücre içi kayıtları vitrotakip tespit etmek için kullanılan yordamları açıklar. Dilim hazırlık açıklaması, hücre içi eşleştirilmiş kayıtları kullanarak elektrotlar keskin ve bizim Laboratuvarda kullanılan sonraki histolojik yordamlar daha önce raporlanmış28olmuştur. Her ne kadar intracellularly biocytin 450-500 mikron kalınlığında dilimler içinde dolu hücre iletişim kuralının uygulandığı, aynı iletişim kuralını bütün hücreli kayıtları aşağıdaki kullanılabilir. Ancak, daha ince dilimleri kullanımı hücreleri daha az komple rekonstrüksiyonu içinde sonuçlanır.
Elektrofizyolojik kayıtlar vitro (Şekil 1 Ac,d ve M.ö., d) ile histochemical birlikte ve immunohistokimyasal yordamları etkinleştirmek detaylı morfoloji, kalsiyum bağlayıcı protein içeriği ve Yetişkin kortikal interneurons kimliğini ortaya olarak kaydedildi. CA2 bölgesinde bu tekniği ilk kez yerel devre çalışma izin ve daha önce CA1 veya CA3 tarif edilmiştir değil interneurons alt sınıflarını ortaya: geniş dendritik ve aksonal arbor sepet hücreleri (Şekil 1B), bistratified hücreleri ve SP-SR interneurons.
Burada açıklanan protokol nöronlar ultrastructure korumak ve dendritik (dahil dikenleri) ve aksonal arbors mükemmel kurtarma edinmek için optimize edilmiştir. Kritik adımları içerir kontrast ışık mikroskobu26 geliştirmek için çift fiksasyon tekniği kullanımı ve antikor penetrasyon geliştirmek ve nöronal korumak için sabitleştirici çözüm oxazolidin ve pikrik asit çözüm eklenmesi ultrastructure27. Osmication ve reçine katıştırma z-uçak büzülme28azaltmak iken nazik donma-çözülme permeabilization ince yapısının daha iyi koruma sağlar. Buna ek olarak, (örneğin aksonlar küçük boutons ile para cezası) çok güzel yapıların görselleştirme H2O2 ve arka plan boyama azaltmak için NaBH4 bölümlerle kuluçka tarafından geliştirildi. Kontrast Ayrıca NiCl2 ‘ ye HRP tepki ilavesi ile artırılabilir.
Burada verilen histolojik yordam tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik açısından mükemmel sonuçlar sunar. Ancak, elektrofizyolojik kayıt süresi daha kısa kayıtları genellikle yoksul aksonal boyama ile ilişkili ile boyama biocytin/floresan kalitesini belirleyecektir. Protokoller (bütün hücreli yama sıkma vs keskin elektrotları kullanarak hücre içi kayıtları) kayıt seçimi de biocytin saklama ve koruma iyi anatomi etkileyebilir.
Güçlükler içinde iken burada açıklanan histolojik işleme ve 100 X büyütme (axon karmaşıklığına bağlı olarak 1-4weeks), yeniden oluşturmak için geçen süre sırasında güzel yapısını koruyarak takdir edilmektedir, bu yöntem verir bir dendritik ve aksonal çapları doğru bir şekilde temsil. Daha az biocytin etiketleme ortaya çıkarmak için yüksek güç gerektiren protokolleri kullanımı anlaşılabilir bir durumdur, ancak, bunlar genellikle iyi aksonal şube açık görselleştirme engel. Deterjanlar biocytin ve antikorlar, ortaya çıkarmak için Avidin-HRP girişini teşvik etmek, genellikle kalın bölümlerde gerekli, ama güzel yapısını bozabilir. Nörologlar arama sürekli için yeniden yapılanma yarı otomatik yöntemleri ama için şimdi ve akson özellikle, biocytin-HRP el ile yeniden yapılanma ile için altın standart31kalır.
Son derece ayrıntılı nöronal rekonstrüksiyonu, aksonlar boutons ve düğümlerin olup tam aksonal arbor, çizim doğru akson çapı temsili ile değiştirir boyunca miyelin ve daha genel olarak özellikle doğru çizimlerinin onun uzunluğu, daha fazla bilgi doğru teşhis edilmesi için kullanılan farklı türde bir interneurone sağlamak. Birçok interneurons belirli bir sınıf tam olarak uygun olmayabilir rağmen yukarıda açıklanan tekniği nöronal elektrofizyolojik özellikleri, belirli bir bağlantı türü ile ilişkili ve ayrıntılı kısa vadeli plastisite ilişkili veri sağlar nöronal rekonstrüksiyonu, ayrıntılı olarak incelenecektir için bağlantı şeması CA2 bölgesinde izin.
İyi, ayrıntılı yapısı kez Hesaplamalı modellerinde basitleştirilmiştir. Anlaşılabilir olsa da, bu gelecekte kritik olabilecek bilgi kaybına neden olur. Ayrıntılı 3D rekonstrüksiyonu ile paralel sinaptik veri analizini interneuronal sınıflandırma için daha fazla ölçüt eklenmesi sağlayacaktır. Veri içinde kamu depoları yatırılır ve akson çapı ve myelination Aksiyon potansiyeli yaymayı sporadik değişiklikler sonucu hesaplama açısından keşfetmek için tüccarları tarafından kullanılan.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma Novartis Pharma (Basel) ve tıbbi araştırma Konseyi Prof Alex Thomson, biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC-BB/G008639/1), fizyolojik Derneği, Avrupa Birliği için fon aldı Ufuk 2020 çerçeve programı araştırma ve yenilik (insan beyni proje SGA1) belirli Hibe Sözleşmesi No 720270 altında ve belirli Hibe Sözleşmesi No 785907 altında (insan beyni proje SGA2). Fon güvenliğini sağlama diğer kortikal bölgelerde Protokolü ayarlamak için ve onun sürekli destek için bu proje için Prof Alex Thomson için çok müteşekkiriz. Laboratuvar-kurtarma protokolüne optimize yardımcı oldu ve CA2 neurones yeniden üye tarafından yapılan katkıları minnettarlıkla kabul vardır: J. Deuchars, H. Pawelzik, ö. I. Hughes, A. s. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |