Il protocollo descritto qui descrive l’analisi di immunofluorescenza, biocitina recupero e ricostruzioni di alta qualità di hippocampal CA2 interneuroni seguendo le registrazioni elettrofisiologiche intracellulari in vitro, permettendo un neurone caratterizzazione e infine bene anatomia un neurone per essere studiato.
Come attività di rete corticale elabora informazioni sono di importanza per un gran numero di domande scientifiche di base e cliniche. Il protocollo descritto qui identifica i componenti di base di questo circuito. Studi approfonditi di regioni corticali in definitiva fornirà altri scienziati con i componenti del circuito necessaria per la comprensione di come il cervello acquisisce, elabora e memorizza le informazioni e ciò che va storto nella malattia, mentre l’elettrofisiologici e sui dati morfologici sono ampiamente utilizzati dai neuroscienziati computazionali nella costruzione di reti di modello che esplorano l’elaborazione delle informazioni. Il protocollo descritto qui descrive come cellule piene di biocitina registrate nella regione CA2 dell’ippocampo sono recuperate e poi ricostruite in 3D. Inoltre, il protocollo descrive la dimostrazione della proteina obbligatoria del calcio o peptide contenuto in interneuroni registrati.
La corteccia e nell’ippocampo sono strutture di tale complessità che la classificazione di un neurone sottotipi1,2,3,4, mappe delle connessioni tra loro5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 e come questo circuito supporta funzioni cognitive12,13,14,15 sono ancora in fase di intenso studio e oggetto di continuo dibattito. Ad esempio, per capire i dettagli e le complessità dei circuiti e di coordinare i dati ottenuti da diversi studi, è estremamente utile essere in grado di definire e descrivere i componenti, ma rimane una questione di dibattito come molti differenti classi di neuroni esiste, o anche se è possibile definire tutti i neuroni come appartenenti a una classe specifica. Strumenti di calcolo che possono costruire e collaudare i circuiti con diversi gradi di complessità sono essendo sviluppato16,17,18, ma centrale di questi sforzi è la necessità di studi dettagliati dei tipi cellulari e delle proprietà delle connessioni tra loro. Una grande quantità di informazioni sui circuiti locali della neocorteccia dei ratti adulti sono già stati raccolti utilizzando il protocollo descritto qui10,19,20,21, 22. anche se lo “schema elettrico” è lungi dall’essere completo, alcuni chiari schemi o regole sono emerse. Inoltre, anche se alcuni dettagli possono variare, queste regole sono comuni due specie di mammiferi (gatto e topo) e da altra parte parecchie regioni neocorticali, permettendo lo sviluppo di blocchi predefiniti di base che sono suscettibili di essere ugualmente applicabile a neocortex umano. La tecnica qui descritta è utilizzata per estendere la nostra comprensione della mappa funzionale dei circuiti corticali identificando i neuroni presinaptici e postsinaptici coinvolti nelle connessioni nelle regioni che non sono state studiate in dettaglio prima, utilizzando un protocollo che permette di tessuto eccellente conservazione e recupero notevole colorazione nel tessuto del cervello adulto. Dati sulle proprietà neuronali in questo sottocampo e il circuito di locale in CA2 sono stati raccolti con questo metodo combinando le registrazioni elettrofisiologiche intracellulari (registrazioni accoppiate con taglienti microelettrodi) con biocitina riempimento, immunofluorescenza, procedure istologiche e altamente dettagliate ricostruzioni neuronale, permettendo un confronto diretto con le vicine CA regioni23,24,25.
La tecnica descritta in questo articolo è stata sviluppata nel corso degli anni per ottenere dettagliata anatomia di un neurone permettendo la corretta classificazione delle cellule e di alta qualità e accurate ricostruzioni di entrambi loro dentritici ed axonal pergole, dati che possono essere correlato con dati elettrofisiologici raccolti da registrazioni accoppiate usando degli elettrodi affilati. Il protocollo istologico è stato ottimizzato per preservare l’ultrastruttura dei neuroni e ottenere eccellente recupero di entrambi (tra cui delle spine dendritiche) e pergole assonale. Ad esempio, il principio della tecnica doppia fissazione in primo luogo immergendo in una soluzione fissante e in secondo luogo post-fissazione in tetrossido di osmio dà un buon contrasto per microscopia chiara26. Una piccola quantità di soluzione di acido picrico e glutaraldeide vengono aggiunti alla soluzione fissante per migliorare la penetrazione dell’anticorpo e preservare l’ultrastruttura delle cellule come suggerito in un precedente studio27. La permeabilizzazione delle fette del cervello utilizzando il metodo di congelamento-scongelamento combinato con cryo-protezione con saccarosio, piuttosto che un detersivo tradizionale, fornisce anche una conservazione ottimale dei tessuti per dettagliate analisi morfologica delle cellule registrate. Inoltre, la visualizzazione in particolare di strutture molto belle è migliorata riducendo la colorazione di fondo, con le incubazioni con perossido di idrogeno (H2O2) e sodio boroidruro (NaBH4). L’aggiunta di cloruro di nichel (Burundi2) per la perossidasi di rafano (HRP) reazione per ottenere un prodotto di reazione di pigmento nero aumenta anche il contrasto.
Il seguente protocollo descrive le procedure per accertare la conservazione dei tessuti eccellenti e altamente dettagliate ricostruzioni 3D neuronale dopo registrazioni intracellulari in vitro. La descrizione della preparazione fetta, intracellulare accoppiate registrazioni utilizzando sharp elettrodi e successive procedure istologiche utilizzate nel nostro laboratorio sono stati precedentemente segnalati28. Sebbene il protocollo si applica alla celle riempite intracellulare con biocitina in fette spesse di 450 – 500 μm, può essere utilizzato lo stesso protocollo seguito cellule intere registrazioni. Tuttavia, l’uso delle fette più sottili si tradurrà in meno complete ricostruzioni delle cellule.
Le registrazioni elettrofisiologiche in vitro (Figura 1 Ac,d e Bc, d) combinato con istochimiche e immunohistochemical le procedure consentono la morfologia dettagliata, il contenuto proteico di calcio associazione e identità di adulti interneuroni corticali registrata per essere rivelato. Nella regione CA2, questa tecnica ha permesso lo studio dei circuiti locali per la prima volta e ha rivelato le sottoclassi di interneuroni che precedentemente non erano stato descritto in CA1 o CA3: cellule di arbor ampio dentritici ed axonal Cestino (Figura 1B), le cellule bistratified e interneuroni SP-SR.
Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per preservare l’ultrastruttura dei neuroni e ottenere eccellente recupero di entrambi (tra cui delle spine dendritiche) e pergole assonale. Fasi critiche include l’uso della tecnica doppia fissazione per aumentare il contrasto per microscopia chiara26 e l’aggiunta di glutaraldeide e acido picrico soluzione alla soluzione fissante per migliorare la penetrazione dell’anticorpo e preservare il neuronale ultrastruttura27. Dolce gelo-disgelo permeabilizzazione dà migliore conservazione della struttura fine, mentre osmicate e resina incorporamento ridurre il restringimento del piano z28. Inoltre, la visualizzazione di strutture molto belle (belle ad esempio gli assoni con piccolo boutons) è migliorata incubando le sezioni con H2O2 e NaBH4 per ridurre la colorazione di fondo. Contrasto può essere aumentato anche con l’aggiunta di Burundi,2 per la reazione di HRP.
La procedura istologica dettagliata qui offre ottimi risultati in termini di riproducibilità e affidabilità. Tuttavia, la durata delle registrazioni elettrofisiologiche determinerà la qualità della colorazione, con brevi registrazioni connesse solitamente con scarsa colorazione axonal biocitina/fluorescenza. La scelta di registrazione protocolli (registrazioni intracellulari usando degli elettrodi affilati vs cellule intere patch di bloccaggio) può anche influenzare biocitina conservazione e preservazione dell’anatomia bene.
Mentre le difficoltà incontrate nel preservare la struttura fine durante la lavorazione istologiche descritte qui e il tempo necessario per ricostruire a 100 ingrandimenti (1-4 settimane a seconda della complessità dell’assone) sono apprezzate, questo metodo dà un rappresentazione accurata dei diametri dentritici ed axonal. L’uso di meno esigenti protocolli per rivelare l’etichettatura biocitina è comprensibile, tuttavia, questi spesso preclude visualizzazione chiara dei rami axonal bene. Detergenti, per favorire l’ingresso di avidina-HRP a rivelare la biocitina e anticorpi, sono spesso necessari in sezioni spesse, ma possono interferire con struttura fine. Neuroscienziati cerca costantemente per semiautomatiche metodi di ricostruzione, ma, per ora e per gli assoni soprattutto, biocitina-HRP con ricostruzione manuale rimane il gold standard31.
Altamente dettagliate ricostruzioni neuronale, soprattutto i disegni precisi dei boutons axonal e nodi, la presenza o assenza di mielina e più in generale, il disegno di arbor axonal completa, con la rappresentazione di assone-diametro preciso cambia lungo il lunghezza, fornire ulteriori informazioni per l’identificazione precisa di un tipo distinto di interneurone. Anche se molti interneuroni non rientrano esattamente in una determinata classe, la tecnica sopra descritta fornisce dati correlati sulle proprietà elettrofisiologiche neuronale, la plasticità a breve termine associato a un tipo specifico di connessione e dettagliate ricostruzioni di un neurone, permettendo lo schema elettrico, nella regione CA2, ad esempio, di essere studiato in dettaglio.
Struttura bella, dettagliata è spesso semplificata in modelli computazionali. Mentre è comprensibile, questo comporta la perdita delle informazioni che potrebbero rivelarsi fondamentale in futuro. Analisi di dettagliate ricostruzioni 3D con paralleli sinaptici dati permetterà l’aggiunta di ulteriori criteri di classificazione interneuronale. Dati possono essere depositati in archivi pubblici e utilizzati dai modellisti per esplorare il risultato dei cambiamenti sporadici di diametro dell’assone e myelination sulla propagazione del potenziale d’azione informaticamente.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca ha ricevuto un finanziamento da Novartis Pharma (Basilea) e del Medical Research Council assegnato a Prof Alex Thomson, la biotecnologia e di Biological Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), la società fisiologica, l’Unione europea Orizzonte 2020 programma quadro per la ricerca e l’innovazione sotto l’accordo di sovvenzione specifiche n ° 720270 (Human Brain Project SGA1) e sotto l’accordo di sovvenzione specifiche n ° 785907 (Human Brain Project SGA2). Siamo estremamente grati al Prof Alex Thomson per la configurazione del protocollo in altre regioni corticali, garantire il finanziamento e per il suo continuo sostegno per questo progetto. Contributi dei membri di laboratorio che hanno contribuito a ottimizzare il protocollo di recupero e ricostruito CA2 neuroni sono ringraziano: J. Deuchars, D. I. Hughes e H. Pawelzik, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |