这里概述的协议描述了免疫荧光分析, 生物细胞素恢复和高质量的重建海马 ca2 神经元后, 细胞内电生理记录在体外, 允许神经元特征, 并最终精细的神经元解剖进行研究。
皮质网络活动如何处理信息, 对大量的基础和临床科学问题具有重要意义。此处描述的协议标识了此电路的基本构建块。对皮质区域的深入研究最终将为其他科学家提供所需的电路组件, 以了解大脑如何获取、处理和存储信息, 以及在电生理方面出现的疾病而形态数据被计算神经科学家广泛用于构建探索信息处理的模型网络。这里概述的协议描述了如何在海马 ca2 区域记录的生物素填充细胞被恢复, 然后在3d 中重建。此外, 该协议描述了钙结合蛋白或肽含量的演示记录的间神经元。
皮层和海马体是如此复杂的结构, 神经元亚型 1,2, 3,4, 它们之间的连接图 5,6,7.,8,9,10,11以及这种电路如何支持认知功能的 12、13、14、15仍在紧张研究中, 并一直在争论中。例如, 要了解电路的细节和复杂性, 并协调从许多不同研究中获得的数据, 能够定义和描述组件是非常有帮助的, 但争论有多少不同的问题仍然是一个值得商榷的问题神经元的类存在, 甚至是否有可能将所有神经元定义为属于特定类。目前正在开发能够构建和测试具有不同复杂程度的电路的计算工具, 但这些努力的核心是需要对细胞类型进行详细研究以及它们之间连接的属性。已经收集了大量关于成年大鼠大鼠大皮层局部电路的信息, 这里描述的协议是10、19、20、21,22. 虽然 “接线图” 远未完成, 但出现了一些明确的模式或规则。此外, 虽然有些细节不同, 但这些规则是两个哺乳动物物种 (老鼠和猫) 所共有的, 跨越了几个新皮层区域, 可以开发出可能同样适用于人类新皮层的基本组成部分。这里描述的技术是用来扩大我们对皮质电路功能图的理解, 通过识别突触前和突触后神经元参与连接的区域, 以前没有详细研究过, 使用的协议可以在成人脑组织中进行良好的组织保存和显著的染色恢复。利用这种方法, 将细胞内电生理记录 (与尖锐微电极配对) 与生物细胞素填充相结合, 收集了 ca2 局部电路和该子领域神经元特性的数据,免疫荧光, 组织学程序和高度详细的神经元重建, 允许直接比较与邻近的 ca 地区23,24,25。
多年来, 本文所述的技术得到了详细的神经元解剖, 使细胞的正确分类和高质量和准确的重建, 他们的树突状和轴突乔木, 数据可以是与使用尖锐电极配对录音中收集的电生理数据相关。组织学方案已进行优化, 以保持神经元的超微结构, 并获得良好的恢复树突 (包括刺) 和轴突乔木。例如, 双固定技术的原理是首先浸入固定溶液中, 其次是在四氧化铬的固定后, 从而为光学显微镜26提供了很好的对比度。按照先前研究27的建议,在固定液中加入少量戊二醛和吡咯酸溶液, 以增强抗体的渗透, 并保持细胞的超微结构。采用冻融法与蔗糖 (蔗糖) (而不是传统洗涤剂) 相结合的冷冻保护方法, 使大脑切片具有渗透性, 也为记录细胞的详细形态分析提供了最佳的组织保存。此外, 通过使用过氧化氢 (h2o2) 和硼氢化钠 (nbh4) 进行孵育, 减少背景染色, 提高了非常精细结构的可视化效果.在辣根过氧化物酶 (hrp)反应中加入氯化镍 (ncl 2) 以获得黑色色素反应产物也能增加对比度。
下面的协议描述了用于确定优秀的组织保存和高度详细的神经元3d 重建后, 细胞内记录在体外的程序。以前曾报道过我们实验室使用的切片制剂、使用尖锐电极的细胞内配对记录和随后的组织学程序的描述.尽管该协议适用于在450-500μm 厚的切片中充满生物环素的细胞, 但在整个细胞记录后, 也可以使用相同的协议。但是, 使用较薄的切片将导致细胞的重建不那么完整。
体外电生理记录 (图 1 ac,d和bc, d), 结合组织化学和免疫组织化学程序, 使详细的形态, 钙结合蛋白的含量和被记录的成人皮质间质的身份。在 ca2 区域, 这项技术首次允许研究局部电路, 并揭示了以前在 ca1 或 ca3 中没有描述过的神经元间亚类: 宽树突状细胞和轴向乔木篮细胞 (图 1 b),细胞化和 sp-sr 间神经元间。
这里描述的协议已经优化, 以保持神经元的超微结构, 并获得良好的恢复树突 (包括刺) 和轴突乔木。关键的步骤包括使用双固定技术来增强光显微镜26的对比度, 并在固定溶液中添加戊二醛和丙酸溶液, 以增强抗体渗透和保护神经元超微结构27。温和的冻融渗透能更好地保存精细结构, 而渗透和树脂嵌入减少 z 平面收缩 28.此外, 通过孵育 h2o2 和 nbh4 的切片, 减少背景染色, 可以改善非常精细结构 (例如带有小球团的精细轴突)的可视化.在 hrp 反应中加入 ncl 2 也可以增加对比度。
这里详细介绍的组织学过程在重现性和可靠性方面提供了出色的结果。然而, 电生理记录的持续时间将决定生物环/荧光染色的质量, 较短的记录通常与不良的轴突染色有关。记录协议的选择 (使用尖锐电极与全细胞贴片夹紧的细胞内录音) 也可能影响生物环素的保留和精细解剖的保存。
虽然在这里描述的组织学处理过程中在保持精细结构方面遇到的困难以及在100x 放大倍率 (1到4周取决于轴突的复杂性) 下重建所需的时间得到了赞赏, 但这种方法给出了树突状和轴突直径的精确表示。使用要求较低的协议来揭示生物素标签是可以理解的, 然而, 这些往往排除了精细轴突分支的清晰可视化。洗涤剂, 促进阿维丁-hrp 进入, 以揭示生物素和抗体, 往往是必要的厚截面, 但可以破坏精细的结构。神经学家不断寻找半自动重建方法, 但目前, 特别是轴突, 人工重建的生物细胞蛋白-hrp 仍然是金本位31。
高度详细的神经元重建, 特别是轴突和节的精确绘图, 髓鞘的存在或不存在, 更普遍的是完整的轴突乔木的绘制, 其沿轴径的精确变化的表示长度, 为准确识别不同类型的神经元间神经提供进一步的信息。虽然许多神经元间可能不完全适合于特定的类, 但上面描述的技术提供了有关神经元电生理特性的相关数据, 以及与特定类型的连接相关的短期可塑性和详细的神经元重建, 允许接线图, 在 ca2 区域, 例如, 详细研究。
在计算模型中, 精细、详细的结构通常是简化的。这虽然可以理解, 但却导致信息丢失, 而这些信息可能在未来证明是至关重要的。通过对具有并行突触数据的详细三维重建进行分析, 可以增加进一步的神经元间分类标准。数据可以存储在公共存储库中, 并由建模器用于探索轴突直径的零星变化和肌权对动作电位传播的计算结果。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了诺华制药 (巴塞尔) 和医学研究委员会的资助, 该委员会授予欧洲联盟生理学会生物技术和生物科学研究理事会 (bbsrc-bbp/16639/1) 的亚历克斯·汤姆森教授。根据720270具体赠款协定 (人脑项目 sga1) 和根据785907号具体赠款协议 (人脑项目 sga2) 制定的地平线2020研究和创新框架方案。我们非常感谢亚历克斯·汤姆森教授在其他皮质地区建立了协议, 获得了资金, 并为这一项目提供了持续的支持。帮助优化恢复协议和重建 ca2 神经元的实验室成员所作的贡献得到了感谢: j. deuchars, h. Pawelzik, d. i. hughes, a. p. bannister, k. eastlake, h. trigg, n. a. botcher。
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |