وصف بروتوكول المبينة هنا تحليل الفلورة واستعادة بيوسيتين وإعادة البناء عالية الجودة من إينتيرنيورونس CA2 هيبوكامبال بعد التسجيلات الكهربية داخل الخلايا في المختبر، السماح للخلايا العصبية توصيف وتشريح الخلايا العصبية الدقيقة في نهاية المطاف دراستها.
كيف يعالج نشاط الشبكة القشرية المعلومات من أهمية بالنسبة لعدد كبير من الأسئلة العلمية الأساسية والسريرية. ويحدد البروتوكول الموصوفة هنا اللبنات الأساسية لهذه الدوائر. في نهاية المطاف سوف توفر دراسات متعمقة للمناطق القشرية علماء آخرين مع عناصر الدائرة بحاجة لفهم كيفية تستحوذ على الدماغ والعمليات ويخزن المعلومات وما يذهب على نحو خاطئ في المرض، في حين الكهربية والمورفولوجية بيانات تستخدم على نطاق واسع من علماء الأعصاب الحسابية في بناء الشبكات النموذجية التي تستكشف تجهيز المعلومات. البروتوكول المبينة هنا ويصف كيفية الخلايا مملوءة بيوسيتين المسجلة في منطقة CA2 الحصين استردادها وثم أعيد بناؤها في 3D. بالإضافة إلى ذلك، يصف البروتوكول المظاهرة من البروتين الكالسيوم أو الببتيد المحتوى في إينتيرنيورونس مسجل.
قشرة والحصين هياكل هذا التعقيد أن تصنيف الخلايا العصبية فرعية1،2،،من34، خرائط الاتصالات بينهما5،6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 وكيف تدعم هذه الدوائر الوظائف المعرفية12،13،،من1415 لا تزال قيد الدراسة المكثفة وموضوعا للمناقشة المستمرة. على سبيل المثال، لفهم تفاصيل وتعقيدات الدوائر وتنسيق البيانات التي تم الحصول عليها من دراسات مختلفة كثيرة، أنها مفيدة للغاية لتكون قادرة على تحديد ووصف العناصر، ولكن يظل موضوعا للمناقشة كيف كثيرة مختلفة توجد فئات من الخلايا العصبية، أو حتى ما إذا كان من الممكن لتحديد كافة الخلايا العصبية أنها تنتمي إلى فئة معينة. الأدوات الحاسوبية التي يمكن بناء واختبار الدوائر بدرجات متفاوتة من التعقيد حاليا نمواً16،،من1718، ولكن المركزية لهذه المساعي الحاجة إلى دراسات تفصيلية لأنواع الخلايا ومن خصائص الاتصالات بينهما. وتم جمع كمية كبيرة من المعلومات عن الدوائر المحلية من اللحاء الجديد الفئران الكبار فعلا باستخدام البروتوكول الموصوفة هنا10،19،،من2021، 22-على الرغم من أن “الرسم التخطيطي الأسلاك” بعيدة عن الاكتمال، وامسح بعض أنماط أو ظهرت قواعد. وعلاوة على ذلك، على الرغم من اختلاف بعض التفاصيل، هذه القواعد المشتركة بين نوعين من أنواع الثدييات (الفأر والقط) وعبر عدة مناطق نيوكورتيكال، مما يتيح وضع اللبنات الأساسية التي من المحتمل أن تكون تنطبق بالتساوي على البشرية اللحاء الجديد. يتم استخدام الأسلوب الموصوفة هنا لتوسيع فهمنا للخريطة الوظيفية للدوائر القشرية بتحديد الخلايا العصبية presynaptic وبوستسينابتيك المشاركة في الاتصالات في المناطق التي لم تدرس بالتفصيل من قبل، باستخدام بروتوكول تتيح الحفاظ على الأنسجة ممتازة والانتعاش المصبوغة ملحوظا في أنسجة المخ الكبار. تم جمع البيانات عن خصائص الخلايا العصبية في هذا حقلاً فرعياً والدوائر المحلية في CA2 مع هذا الأسلوب عن طريق الجمع بين التسجيلات الكهربية داخل الخلايا (التسجيلات إرفاقها مع ميكروليكتروديس حادة) مع بيوسيتين ملء، الفلورة وإجراءات غذائها ومفصلة للغاية–الخلايا العصبية عمليات إعادة البناء، مما يتيح إجراء مقارنة مباشرة مع المجاورة كاليفورنيا مناطق23،،من2425.
الأسلوب الموصوفة في هذه المقالة قد وضعت على مر السنين للحصول على تشريح الخلايا العصبية مفصل يتيح التصنيف الصحيح للخلايا وذات جودة عالية ودقة عمليات إعادة البناء لكلا بهم الجذعية ومحواري العرش، البيانات التي يمكن أن تكون يرتبط الكهربية البيانات التي تم جمعها من تسجيلات المقترنة باستخدام أقطاب كهربائية حادة. البروتوكول غذائها وقد الأمثل للحفاظ على أولتراستروكتوري من الخلايا العصبية والحصول على استرداد ممتازة الجذعية (بما في ذلك العمود الفقري) والعرش محواري. على سبيل المثال، يعطي مبدأ تقنية التثبيت المزدوج بغمر أولاً في حل مثبت وثانيا بعد تحديد في أكسيد الاوزميوم على النقيض جيدة للفحص المجهري الخفيفة26. تتم إضافة كمية صغيرة من جلوتارالديهيدي وحمض البكريك الحل إلى الحل مثبت لتعزيز اختراق جسم والحفاظ على أولتراستروكتوري الخلايا النحو المقترح في دراسة سابقة27. كما يوفر permeabilization الدماغ الشرائح باستخدام طريقة تجميد أذاب جنبا إلى جنب مع حماية البرد مع السكروز، بدلاً من منظفات تقليدية، الحفاظ على الأمثل للأنسجة لتحليل مفصل المورفولوجية للخلايا مسجل. وباﻹضافة إلى ذلك، تحسين التصور خاصة من الهياكل الدقيقة جداً بتقليل تلوين الخلفية، مع إينكوبيشنز مع بورهيدريد الصوديوم (نأبه4) وفوق أكسيد الهيدروجين (H2O2). إضافة كلوريد النيكل (نيكل2) الفجل البيروكسيديز (HRP) كرد فعل للحصول على منتج رد فعل صباغ أسود يزيد أيضا من التباين.
البروتوكول التالي يصف الإجراءات المستخدمة للتأكد من الحفاظ على النسيج ممتازة ومفصلة للغاية العصبية 3D عمليات إعادة البناء بعد التسجيلات داخل الخلايا في المختبر. وصف إعداد شريحة، حادة التسجيلات المزدوجة داخل الخلايا باستخدام أقطاب وإجراءات النسيجي اللاحقة المستخدمة في المختبر قد ذكر سابقا28. على الرغم من أن البروتوكول ينطبق على الخلايا مليئة إينتراسيلولارلي بيوسيتين 450 – 500 ميكرومتر شرائح سميكة، يمكن استخدام نفس البروتوكول عقب التسجيلات كامل الخلية. ومع ذلك، سيؤدي إلى استخدام شرائح أرق في عمليات إعادة البناء أقل اكتمالا من الخلايا.
التسجيلات الكهربية في المختبر (الشكل 1 Ac،د و قبل الميلاد، د) جنبا إلى جنب مع histochemical وتمكين الإجراءات المناعي مورفولوجيا مفصلة، ملزمة البروتين الكالسيوم و وسجلت هوية إينتيرنيورونس القشرية الكبار كشف. في منطقة CA2، هذا الأسلوب يسمح بدراسة الدوائر المحلية للمرة الأولى، وكشفت عن الفئات فرعية إينتيرنيورونس التي لا تم وصفها سابقا في CA1 أو CA3: أربور الجذعية واسع ومحواري سلة الخلايا (الشكل 1B)، بيستراتيفيد الخلايا وإينتيرنيورونس SP-ريال.
تم الأمثل للحفاظ على أولتراستروكتوري من الخلايا العصبية والحصول على استرداد ممتازة الجذعية (بما في ذلك العمود الفقري) والعرش محواري البروتوكول هو موضح هنا. الخطوات الحاسمة التي تشمل استخدام أسلوب التثبيت المزدوج لتعزيز التباين للفحص المجهري الخفيفة26 وإضافة حل glutaraldehyde وحامض البكريك إلى الحل مثبت تعزيز اختراق جسم والحفاظ على الخلايا العصبية 27من أولتراستروكتوري. بيرميبيليزيشن تجميد أذاب لطيف يعطي أفضل الحفاظ على بنية دقيقة، بينما أوسميكيشن وتضمينها راتنج الحد من انكماش z-الطائرة28. وباﻹضافة إلى ذلك، تحسين تصور الهياكل الدقيقة جداً (غرامة محاور عصبية مع بتونس الصغيرة على سبيل المثال) التي تفرخ المقاطع مع ح2س2 و نأبه4 للحد من تلوين الخلفية. يمكن أيضا زيادة التباين بالإضافة إلى نيكل2 إلى رد فعل برنامج الصحة الإنجابية.
يوفر الإجراء النسيجي مفصلة هنا نتائج ممتازة من حيث إمكانية تكرار نتائج والموثوقية. ومع ذلك، ستحدد مدة التسجيلات الكهربية جودة بيوسيتين/الأسفار تلطيخ، مع أقصر التسجيلات المرتبطة عادة تلطيخ محواري الفقيرة. اختيار تسجيل البروتوكولات (التسجيلات داخل الخلايا باستخدام أقطاب حادة مقابل لقط تصحيح كامل الخلية) وقد تؤثر أيضا الاحتفاظ بيوسيتين والحفاظ عليها من تشريح غرامة.
رغم الصعوبات التي صودفت في الحفاظ على بنية دقيقة أثناء تجهيز غذائها الموصوفة هنا والوقت المستغرق لإعادة إعمار في التكبير X 100 (1-4weeks تبعاً لدرجة تعقيد إكسون) هي موضع تقدير، ويعطي هذا الأسلوب تمثيل دقيق لأقطار الجذعية ومحواري. الاستخدام أقل تطلبا البروتوكولات للكشف عن وضع العلامات بيوسيتين مفهومة، وهذه غالباً ما تستبعد التصور الواضح لفروع محواري غرامة. المنظفات وتشجيع دخول HRP عبدين للكشف عن بيوسيتين والأجسام المضادة، كثيرا ما تكون ضرورية في أبواب سميكة، ولكن يمكن تعطيل هيكل غرامة. البحث علماء الأعصاب باستمرار لأساليب شبه الآلية لإعادة الإعمار، ولكن للآن ومحاور عصبية خاصة، بيوسيتين-برنامج الصحة الإنجابية مع التعمير اليدوي يظل معيار الذهب31.
مفصلة للغاية العصبية إعادة البناء، لا سيما دقة الرسومات boutons محواري والعقد، ووجود أو عدم وجود المايلين وأعم رسم أربور محواري كاملة، مع تمثيل قطر إكسون دقيقة يتغير على طول لها طول، تقديم مزيد من المعلومات لتحديد دقيق لنوع متميز من إينتيرنيوروني. على الرغم من أن العديد من إينتيرنيورونس قد لا تناسب تماما في فئة معينة، الأسلوب الموصوفة أعلاه توفر بيانات مرتبطة في خصائص الكهربية العصبية، اللدونة القصيرة الأجل المرتبطة بنوع معين من الاتصال ومفصلة الخلايا العصبية إعادة البناء، مما يتيح الرسم التخطيطي الأسلاك، في منطقة CA2، على سبيل المثال، ينبغي أن تدرس بالتفصيل.
غالباً ما يتم تبسيط هيكل غرامة، مفصلة في النماذج الحسابية. بينما مفهومة، وهذا يؤدي إلى فقدان المعلومات التي يمكن أن تكون حاسمة في المستقبل. تحليل لعمليات إعادة البناء ثلاثي الأبعاد مفصلة مع البيانات متشابك موازية تسمح إضافة المزيد من المعايير لتصنيف إينتيرنيورونال. يمكن إيداعها في المستودعات العامة البيانات ويستخدمها النموذجيين: استكشاف نتائج التغييرات متفرقة في قطر إكسون وميليناتيون على انتشار إمكانات العمل حسابياً.
The authors have nothing to disclose.
هذا البحث قد تلقت تمويلاً من شركة نوفارتيس فارما (بازل) ومجلس البحوث الطبية تمنح زين أليكس تومسون، والتكنولوجيا الحيوية و “البيولوجية مجلس بحوث العلوم” (BBSRC-BB/G008639/1)، بمجتمع الفسيولوجية، والاتحاد الأوروبي أفق عام 2020 البرنامج الإطاري للبحث والابتكار تحت رقم اتفاق المنحة محددة 720270 (الدماغ البشري المشروع SGA1) وتحت رقم اتفاق المنحة محددة 785907 (الدماغ البشري المشروع SGA2). نحن ممتنون جداً لزين أليكس تومسون لإعداد البروتوكول في مناطق أخرى القشرية، وتأمين التمويل ودعمها المستمر لهذا المشروع. العرفان بالمساهمات التي قدمها أعضاء المختبر الذي ساعد الأمثل في بروتوكول استرداد وإعادة بنائها CA2 neurones: J. ديوتشارس، باويلزيك H.، هيوز أولاً دال، بانيستر ص أ، ك. أبو شقرة، H. Trigg، بوتشير ألف نون.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |