O protocolo descrito aqui descreve a análise de imunofluorescência, recuperação de biocytin e reconstruções de alta qualidade de hippocampal CA2 interneurônios seguindo o intracelulares gravações eletrofisiológicas in vitro, permitindo neuronal caracterização e anatomia neuronal, finalmente, bem a ser estudado.
Como atividade cortical rede processa informações é de importância para um grande número de questões científicas básicas e clínicas. O protocolo descrito aqui identifica os blocos de construção básicos deste circuito. Os estudos em profundidade das regiões corticais, finalmente, irão fornecer outros cientistas com os componentes do circuito necessário para a compreensão de como o cérebro adquire, processa e armazena as informações e o que dá errado na doença, enquanto o eletrofisiológicos e dados morfológicos são amplamente utilizados pelos neurocientistas computacionais na construção de redes de modelo que explorar o processamento de informações. O protocolo descrito aqui descreve como células cheias de biocytin gravadas na região do hipocampo de CA2 são recuperadas e depois reconstruídas em 3D. Além disso, o protocolo descreve a demonstração da proteína de ligação de cálcio ou peptídeo conteúdo em interneurônios gravados.
O córtex e hipocampo são estruturas de complexidade que a classificação de neuronal subtipos1,2,3,4, mapas das conexões entre eles5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 e como este circuito suporta funções cognitivas12,13,14,15 ainda estão sob intenso estudo e objecto de debate contínuo. Por exemplo, para entender os detalhes e complexidades do circuito e coordenar dados obtidos de muitos estudos diferentes, é extremamente útil ser capaz de definir e descrever os componentes, mas continua a ser tema de debate como muitos diferentes classes de neurônios existem, ou mesmo se é possível definir todos os neurônios como pertencendo a uma classe específica. Ferramentas computacionais que podem construir e testar circuitos com diferentes graus de complexidade estão sendo desenvolvidos16,17,18, mas central para estes empreendimentos é a necessidade de estudos detalhados, os tipos de células e as propriedades das conexões entre eles. Uma grande quantidade de informações sobre os circuitos locais do neocórtex de ratos adultos já foram coletada usando o protocolo descrito aqui10,19,20,21, 22. embora o “diagrama de fiação” está longe de ser completa, alguns limpar padrões ou regras surgiram. Além disso, embora alguns detalhes variam, estas regras são comuns a duas espécies de mamíferos (rato e gato) e através de várias regiões neocortical, permitindo o desenvolvimento de blocos de construção básicos que são susceptíveis de ser igualmente aplicável ao neocórtex humano. A técnica descrita aqui é usada para estender a nossa compreensão do mapa funcional de circuitos corticais identificando os neurônios pré-sináptica e pós-sináptica envolvidos nas conexões, nas regiões que não têm sido estudadas em detalhe antes, usando um protocolo Isso permite que tecido excelente preservação e recuperação de coloração notável no tecido do cérebro de um adulto. Foram coletados dados sobre os circuitos locais em CA2 e propriedades neuronais neste subcampo com este método combinando intracelulares eletrofisiológicas gravações (emparelhado com microeletrodos afiados) com biocytin de enchimento, imunofluorescência, procedimentos histológicos e reconstruções neuronais altamente detalhados, permitindo a comparação direta com o vizinho CA regiões23,24,25.
A técnica descrita neste artigo foi desenvolvida ao longo dos anos para obter detalhadas sobre anatomia neuronal, permitindo a correcta classificação das células e da alta qualidade e precisa reconstruções de ambos seus dendríticas e axonal mandris, dados que podem ser correlacionados com dados eletrofisiológicos coletados de emparelhados gravações usando eletrodos afiados. O protocolo histológico foi otimizado para preservar a ultraestrutura dos neurônios e obter excelente recuperação de mandris axonal e dendríticas (incluindo espinhos). Por exemplo, o princípio da técnica dupla fixação imergindo-se em primeiro lugar em uma solução de fixador e em segundo lugar, pós-fixação em tetróxido de ósmio dá um bom contraste para microscopia de luz26. Uma pequena quantidade de solução de ácido pícrico e glutaraldeído são adicionados à solução fixador para melhorar a penetração do anticorpo e preservar a ultraestrutura das células, como sugerido em um anterior de estudo27. A permeabilização das fatias de cérebro usando o método de congelamento-descongelamento combinado com cryo-proteção com sacarose, ao invés de um detergente tradicional, também oferece óptima preservação dos tecidos para análise morfológica detalhada das células gravadas. Além disso, a visualização particularmente de muito belas estruturas é melhorada através da redução de coloração de fundo, com a incubação com peróxido de hidrogênio (H2O2) e o boro-hidreto de sódio (NaBH4). Adição de cloreto de níquel (NiCl2) para a peroxidase de rábano (HRP) reação para obtenção de um produto de reação de pigmento preto também aumenta o contraste.
O protocolo seguinte descreve os procedimentos utilizados para determinar a preservação de tecido excelente e altamente detalhadas reconstruções 3D neuronais após gravações intracelular em vitro. A descrição da preparação fatia, intracelulares emparelhadas gravações usando eletrodos em ponto e subsequentes procedimentos histológicos utilizados em nosso laboratório têm sido relatado anteriormente28. Embora o protocolo aplica-se às células intracelular repleta de biocytin em fatias grossas de 450-500 μm, o mesmo protocolo pode ser usado após gravações de células inteiras. No entanto, o uso das mais finas fatias resultará em menos completas reconstruções das células.
Eletrofisiológicos gravações em vitro (Figura 1 Ac,d e A.c., d) combinado com histoquímico e imuno-histoquímica procedimentos permitem a morfologia detalhada, conteúdo de proteína de ligação de cálcio e identidade do adultos interneurônios corticais registrado para ser revelado. Na região de CA2, esta técnica permitiu o estudo do circuito local pela primeira vez e revelou as subclasses de interneurônios que não tinham sido descritas anteriormente em CA1 ou CA3: células de cesta da árvore dendrítica e axonal larga (figura 1B), células bistratified e interneurônios SP-SR.
O protocolo descrito aqui foi otimizado para preservar a ultraestrutura dos neurônios e obter excelente recuperação de mandris axonal e dendríticas (incluindo espinhos). Passos críticos inclui o uso da técnica dupla fixação para realçar o contraste para microscopia de luz26 e a adição da solução de glutaraldeído e ácido pícrico à solução fixador para aumentar a penetração do anticorpo e preservar o neuronal ultraestrutura27. Permeabilização de congelamento-descongelamento suave dá melhor preservação de estrutura fina, enquanto osmication e resina incorporação reduzem encolhimento do plano z28. Além disso, a visualização de muito belas estruturas (multa axônios com pequenas boutons, por exemplo) é melhorada incubando-se as seções com H2O2 e NaBH4 reduzir a coloração de fundo. Contraste também pode ser aumentada com a adição de NiCl2 para a reação de HRP.
O procedimento histológico detalhado aqui oferece excelentes resultados em termos de confiabilidade e reprodutibilidade. No entanto, a duração das gravações eletrofisiológicas irá determinar a qualidade da coloração, com gravações mais curtas, geralmente associadas com coloração axonal pobre biocytin/fluorescência. A escolha de gravação de protocolos (intracelulares gravações usando eletrodos afiados vs aperto de células inteiras remendo) também pode influenciar o biocytin retenção e preservação da anatomia bem.
Enquanto as dificuldades encontradas na preservação de estrutura fina durante o processamento histológico, descrito aqui e o tempo necessário para reconstruir a ampliação de 100 X (1-4weeks dependendo da complexidade do axônio) são apreciados, este método dá um Represtação precisa de diâmetros dendríticas e axonal. O uso de menos exigentes protocolos para revelar biocytin-rotulagem é compreensível, no entanto, estas muitas vezes impedem a visualização clara de galhos finos axonal. Detergentes, para promover a entrada de avidina-HRP para revelar o biocytin e anticorpos, são muitas vezes necessárias em seções grossas, mas podem atrapalhar a estrutura fina. Neurocientistas busca constantemente para métodos semi-automático de reconstrução, mas, para agora e para axônios especialmente, biocytin-HRP com reconstrução manual continua a ser o padrão-ouro de31.
Altamente detalhados reconstruções neuronais, especialmente desenhos precisos de boutons axonal e nós, a presença ou ausência de mielina e mais geralmente o desenho da arbor axonal completa, com a representação do axônio-diâmetro exato muda ao longo de sua comprimento, fornecer mais informações para a identificação precisa de um tipo distinto de interneurone. Embora muitos interneurônios podem não se encaixam exatamente uma classe específica, a técnica descrita acima fornece dados correlacionados em Propriedades eletrofisiológicas neuronais, a plasticidade a curto prazo, associado a um tipo específico de conexão e detalhadas reconstruções neuronais, permitindo que o diagrama de fiação, na região de CA2, por exemplo, para ser estudado em detalhe.
Estrutura fina, detalhada é frequentemente simplificada em modelos computacionais. Embora compreensível, isto resulta na perda da informação que poderia provar crítica no futuro. Análise das reconstruções 3D detalhadas com dados paralelos sinápticas permitirá a adição de novos critérios para a classificação interneuronal. Dados podem ser depositados em repositórios públicos e usados por modeladores para explorar o resultado de mudanças esporádicas no diâmetro do axônio e mielinização na propagação do potencial de ação computacionalmente.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa recebeu financiamento da Novartis Pharma (Basel) e o Conselho de pesquisa médica, atribuído a Prof Alex Thomson, a biotecnologia e biológicas Ciências do Conselho de pesquisa (BBSRC-BB/G008639/1), a sociedade Physiological, União Europeia Horizonte de 2020 programa-quadro de investigação e inovação sob o subsídio específico acordo n. º 720270 (cérebro humano projeto SGA1) e sob o acordo específico Grant n º 785907 (cérebro humano projeto SGA2). Somos extremamente gratos ao Prof Alex Thomson para configurar o protocolo em outras regiões corticais, financiamento e o seu contínuo apoio para este projeto. Contribuições feitas pelo laboratório-Membros, que ajudou a optimização do protocolo de recuperação e reconstruíram CA2 neurônios são reconhecidas com gratidão: Deuchars J. H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |