Protokollet beskrivs här beskriver immunofluorescens analys, biocytin återhämtning och högkvalitativa rekonstruktioner av hippocampus CA2 interneuroner efter den intracellulära elektrofysiologiska recordings in vitro tillåter neuronala karakterisering och ytterst fina neuronala anatomi studeras.
Hur kortikalt nätverksaktivitet bearbetar är information av betydelse för ett stort antal grundläggande och kliniska vetenskapliga frågor. Protokollet beskrivs här identifierar de grundläggande byggstenarna i denna kretsar. De fördjupade studierna av kortikala regioner kommer att i slutändan ge andra forskare med krets komponenter behövs för förståelsen av hur hjärnan förvärvar, processer och lagrar information och vad som går fel i sjukdom, medan den elektrofysiologiska och morfologiska data används allmänt av computational neuroforskare i byggandet av modellen nätverk som utforska informationsbehandling. Protokollet beskrivs här beskriver hur biocytin-fyllda celler registreras i regionen CA2 i hippocampus är återhämtade och sedan rekonstrueras i 3D. Protokollet beskrivs dessutom demonstrationen av kalcium bindande protein eller peptid innehåll i inspelade interneuroner.
I hjärnbarken och hippocampus är strukturer av sådan komplexitet att klassificeringen av neuronala subtyper1,2,3,4, kartor över kopplingarna mellan dem.5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 och hur detta kretsar stödjer kognitiva funktioner12,13,14,15 är fortfarande under intensiva studier och fortsatta debatt. Till exempel att förstå detaljerna och komplexiteten i kretsarna att samordna data från många olika studier och, det är mycket hjälpsamt för att kunna definiera och beskriva komponenterna, men det är fortfarande en fråga för debatt hur många olika klasser av nervceller finns, eller ens om det är möjligt att definiera alla neuroner som tillhör en viss klass. Beräkningsverktyg som kan bygga och testa kretsar med varierande grad av komplexitet är att vara utvecklade16,17,18, men centralt för dessa strävanden är behovet av detaljerade studier av celltyper och egenskaper av sambanden mellan dem. En stor mängd information om de lokala kretsarna i hjärnbarken hos vuxna råttor har redan samlats in med protokollet beskrivs här10,19,20,21, 22. även om ”kopplingsschema” är långt ifrån komplett, vissa tydliga mönster eller regler har uppstått. Dessutom, även om vissa detaljer varierar, är dessa regler gemensamma till två däggdjursarter (råtta och katt) och över flera hjärnbarkens regioner, möjliggör utveckling av grundläggande byggstenar som sannolikt kommer att vara lika tillämpliga på mänskliga hjärnbarken. Den teknik som beskrivs här används för att utöka vår förståelse för funktionella karta över kortikala kretsar genom att identifiera de presynaptiska och postsynaptiska neuronerna som inblandade i anslutningar i de regioner som inte har studerats i detalj innan, ett protokoll som gör utmärkta vävnad bevarande och anmärkningsvärd färgning återhämtning i vuxen hjärnvävnad. Uppgifter om de lokala kretsarna i CA2 och neuronala boenden i detta delfält har samlats med denna metod genom att kombinera intracellulära elektrofysiologiska inspelningar (Parade inspelningar med skarpa mikroelektroder) med biocytin fyllning, immunofluorescens, histologiska förfaranden och mycket detaljerade neuronala rekonstruktioner, möjliggör direkt jämförelse med närliggande CA regioner23,24,25.
Tekniken som beskrivs i denna artikel har utvecklats under åren för att få detaljerad neuronala anatomi tillåter korrekt klassificering av celler och hög kvalitet och korrekta rekonstruktioner av båda deras dendritiska och axonal arbors, data som kan vara korrelerade med elektrofysiologiska insamlade från Parade inspelningar med skarpa elektroder. Histologiska protokollet har optimerats för att bevara ultrastruktur av nervceller och få utmärkt återvinning av både (inklusive Dendritutskotten) och axonal arbors. Till exempel ger principen om dubbel fixering tekniken genom att för det första nedsänkning i en fixativ lösning och för det andra efter fastställande i osmium vanligtvis en bra kontrast för ljusmikroskopi26. En liten mängd glutaraldehyd och pikrinsyra lösning tillsätts fixativ lösningen att förbättra antikropp penetration och bevara cellernas ultrastruktur som föreslås i en tidigare studie27. Permeabiliseringen i hjärnan skivor med metoden frysning-tining kombinerat med kryo-skydd med sackaros, snarare än ett traditionellt rengöringsmedel, ger också optimalt bevarande av vävnader för detaljerad Morfologisk analys av inspelade cellerna. Dessutom bättre visualisering särskilt av mycket fina strukturer genom att minska bakgrundsfärgning, med inkubationer med väteperoxid (H2O2) och natriumborhydrid (NaBH4). Att lägga till nickel klorid (NiCl2) till pepparrotsperoxidas (HRP) ökar reaktion att få en svart pigment reaktionsprodukt också kontrasten.
Följande protokoll beskriver de förfaranden som används för att fastställa utmärkt vävnad bevarande och mycket detaljerade neuronala 3D rekonstruktioner efter intracellulära inspelningar i vitro. Beskrivning av slice preparatet, intracellulära Parade inspelningar med skarpa elektroder och efterföljande histologiska förfaranden som används i vårt laboratorium har varit tidigare rapporterade28. Även om protokollet gäller för cellerna intracellulärt fylld biocytin i 450 – 500 μm tjocka skivor, får samma protokoll användas efter hela-cell inspelningar. Men kommer att användningen av tunnare skivor resultera i mindre fullständig rekonstruktioner av cellerna.
Elektrofysiologiska inspelningar i vitro (figur 1 Ac,d och f.Kr., d) kombinerat med histochemical och immunhistokemisk förfaranden gör det möjligt för de detaljerade morfologi, kalcium bindande proteininnehåll och identiteten hos vuxna kortikala interneuroner registreras för att avslöjas. I regionen CA2, denna teknik får studien av de lokala kretsarna för första gången och avslöjade underklasser till interneuroner som inte hade tidigare beskrivits i CA1 eller CA3: bred dendritiska och axonal arbor korg celler (figur 1B), bistratified celler och SP-SR interneuroner.
Protokollet beskrivs här har optimerats för att bevara ultrastruktur av nervceller och få utmärkt återvinning av både (inklusive Dendritutskotten) och axonal arbors. Kritiska steg inkluderar användning av dubbel fixering teknik för att förbättra kontrast för ljusmikroskopi26 och tillägg av glutaraldehyd och pikrinsyra lösning till fixativ lösning för att förbättra antikropp penetration och bevara den neuronala ultrastruktur27. Mild frysning-tining vilket ger bättre bevarande av fin struktur, medan osmication och harts inbäddning minska z-planet krympning28. Visualisering av mycket fina strukturer (fina axoner med små knappar till exempel) är dessutom förbättras genom ruvning avsnitten med H2O2 och NaBH4 att minska bakgrundsfärgning. Kontrast kan också ökas med tillägg av NiCl2 till HRP reaktion.
Histologiska förfarandet beskrivs här erbjuder utmärkta resultat när det gäller reproducerbarhet och tillförlitlighet. Varaktigheten av elektrofysiologiska inspelningarna kommer dock avgöra kvaliteten på biocytin/fluorescensen färgning, med kortare inspelningar vanligtvis förknippas med dålig axonal färgning. Valet av inspelning protokoll (intracellulära inspelningar med skarpa elektroder vs. hela-cell patch fastspänning) kan också påverka biocytin bevarande och bevarande av fina anatomi.
Medan svårigheterna som möter i bevara fin struktur under histologisk bearbetning beskrivs här och den tid det tar att rekonstruera på 100 X förstoring (1-4veckor beroende på komplexiteten i axonen) uppskattas, denna metod ger en korrekt representation av dendritiska och axonal diametrar. Användning av mindre krävande protokoll att avslöja biocytin-märkning är förståeligt, men dessa utgör hinder ofta tydlig visualisering av fina axonal grenar. Rengöringsmedel, för att främja införandet av metoden-HRP att avslöja biocytin och antikroppar, är ofta nödvändiga i tjocka sektioner, men kan störa fin struktur. Neuroforskare Sök ständigt för halvautomatiska metoder för återuppbyggnad, men, för förblir nu och för axoner särskilt, biocytin-HRP med manuell återuppbyggnad den gyllene standard31.
Mycket detaljerade neuronala rekonstruktioner, särskilt noggranna ritningar av axonal knappar och noder, närvaro eller frånvaro av myelin och mer allmänt ritningen av komplett axonal arbor, med representation av korrekt axon-diameter förändras längs dess längd, tillhandahålla ytterligare information för korrekt identifiering av en distinkt typ av interneurone. Även om många interneuroner inte kan passar exakt i en viss klass, ger den teknik som beskrivs ovan korrelerade data på neuronal elektrofysiologiska egenskaper, kortsiktiga plasticitet är associerad med en viss typ av anslutning och detaljerade neuronala rekonstruktioner, så att kopplingsschemat, i regionen CA2, exempelvis kan studeras i detalj.
Fin, detaljerad struktur är ofta förenklat i beräkningsmodeller. Medan förståeligt, resulterar detta i förlust av information som kan vara avgörande i framtiden. Analys av detaljerade 3D rekonstruktioner med parallella synaptic data kommer att tillåta tillägg av ytterligare kriterier för interneuronal klassificering. Data kan deponeras i offentliga databaser och används av modellbyggare för att utforska resultatet av sporadiska ändringar i axon diameter och myelinisering på aktionspotentialens spridning computationally.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning har fått finansiering från Novartis Pharma (Basel) och medicinska forskningsrådet tilldelas Prof Alex Thomson, bioteknik och biologiska Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), fysiologiska samhället, EUs Ramprogrammet Horisont 2020 för forskning och Innovation under de särskilda avtal nr 720270 (Human Brain Project SGA1) och under den särskilda avtal nr 785907 (mänskliga hjärnan projektet SGA2). Vi är ytterst tacksamma för Prof Alex Thomson för att ställa in protokollet i andra kortikala regioner, säkra finansiering och för hennes fortsatta stöd för detta projekt. Bidrag från lab-medlemmar som hjälpte till att optimera återhämtning protokollet och rekonstruerade CA2 neuron är erkänt tacksamt: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |