מאמר זה מספק שיטה ריאלי ויעיל עבור בניית מרובה שכבות תאי גזע סדינים עם מאפיינים חיוביים תאי גזע.
טיפול בתאי גזע מראה מבטיח עתיד רגנרציה פצוע איברים ורקמות, הטכניקה גיליון תא פותחה כדי לשפר את השמירה תא נמוך ההישרדות המסכן בתוך אזור היעד. עם זאת, במהלך תהליך הבניה במבחנה , פתרון עבור שמירה על תאי גזע אתריים והגדלת הסכום תא בתוך הגיליון התא הוא צורך דחוף. . הנה, פרוטוקול זה מציג שיטה לבניית גיליון תא מרובה שכבות עם תאי גזע חיובית אתריים ו operability אופטימלית. קרום הלב חזירי decellularized (DPP) מוכן על ידי phospholipase שיטה decellularization2 (PLA2) כמו לגרדום גיליון תא, ואני עכברוש מח העצם בתאי גזע mesenchymal (BMSCs) הם מבודדים מורחבת של התאים הזריעה. מבנה גיליון זמני התא מרובה שכבות נבנה באמצעות RAD16-אני הידרוג פפטיד. לבסוף הגליון התא הוא תרבותי עם מערכת דינאמית זלוף לייצב את מבנה תלת-ממדי (3D), הגיליון תא יכול להיות מושגת בעקבות יישום התרבות 48 שעות במבחנה. פרוטוקול זה מספק שיטה ריאלי ויעיל עבור בניית גיליון מרובה שכבות תאי גזע, הגיליון תא ניתן לפתח כמוצר טיפול בתאי גזע חיובית בעתיד.
טיפול בתאי גזע דווחה טיפול יעיל למחלות רבות; עם זאת, תא נמוך שימור של הישרדות המסכן בתוך אזור היעד נותרו בעיות קריטיות בעקבות הזרקת תאי גזע מסורתי. כדי לפתור בעיה זו, מדענים הנדסת רקמות פיתח את הטכניקה גיליון התא. גיליון תא monolayered עם מטריצה חוץ-תאית תקין הוכן קודם כל על-ידי שימוש של תרבות צלחת של טמפרטורה-תגובה1ודיווח על מחקרי מעקב על שיפורים משמעותיים של שימור תאי גזע של הישרדות בתוך infarcted אזור2,3. בין השיטות, בניית הגיליון תא מרובה שכבות דווחה אסטרטגיית יעיל לשיפור הישרדות תא ו-3,4האפקט הטיפולי גיליון התא. מאז, מדענים עבדו על פיתוח שיטות הבניה גיליון תא שונים על מנת להגביר את כמות התאים, תאי גזע, והמאפיין מכני הסדינים התא. עד כה, סוגים מסוימים של תא גליון נבנה ולמד בטיפול של אוטם שריר הלב5, סחוס פציעה6, ו7פצע בעור.
Bioactivity של תאי גזע לפני השתלת הראה השפעה המתעוררים על התחדשות רקמות פצוע, תאים שונים גיליון בניית אסטרטגיות יש השפעות שונות על תאי גזע. מצד אחד, confluent תא גליונות כללה רק בתאי גזע בצפיפות גבוהה, יכול לרכוש מטריצה חוץ-תאית טבעית על ידי תא monolayered הערמה גליונות8 או באמצעות טכניקות הנדסת רקמות מגנטי9. מצד שני, פיתחו פיגומים שונים כדי לספק חוזק מכני נאותה ותמיכה תא הצמיחה10,11,12, אשר אפשרה תא גזע נמוך זריעה צפיפות כדי להבטיח את התזונה לספק. עם זאת, למרות הגישות הללו אספקת תזונה יעילה נמוכה בתוך מבנה גליון תא מרובה שכבות עדיין דאגה עיקרית במהלך הבנייה במבחנה . לכן, מערכת בניית גיליון תא ריאלי ויעיל דרוש בדחיפות.
פרוטוקול זה מתאר את השלבים כדי להכין גיליון התא של תאי גזע (MSC) multilayeredmesenchymal. במערכת זו בנייה ‘, גיליון התא חוזק מכני מסופק על ידי DPP. על סמך זה לגרדום, מבנה תלת-ממדי התא יכול להיות במהירות נבנה עם RAD16-אני הידרוג פפטיד, ומערכת דינמי זלוף משמש תרבות הגיליון תא מרובה שכבות, על מנת לייצב את מבנה גליון התא תלת-ממד, לספק תזונה מספקת ספק עבור התאים. באמצעות מערכת זו, גיליון BMSC מרובה שכבות הוכן בהצלחה, הציג השפעה טיפולית אופטימלית על מודל אוטם שריר הלב13חולדה.
בפרוטוקול הנוכחי מדווח שיטה יעילה עבור בניית גיליון MSC מרובה שכבות. גיליון זה תא תערוכות אופטימלית חוזק מכני, צפיפות זריעה תא גבוה ו אתריים חיובית לתאי גזע. כדוגמא BMSCs, מבנה תלת-ממדי התא במהירות נבנה עם RAD16-אני הידרוג פפטיד. לאחר להיות תרבותי במערכת דינמית זלוף, הגיליון BMSC מרובה שכבות בהצלחה …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (גרנט מספר 31771064); מדע, טכנולוגיה תכנון הפרוייקט של בפרובינצית גואנג-דונג (גרנט מספרים 2013B010404030, 2014A010105029 ו- 2016A020214012); מדע, טכנולוגיה תכנון הפרוייקט של גואנגזו (גרנט מספר 201607010063); חדשנות לתואר ראשון ואת תוכנית האימונים יזמות (גרנט מספר 201610559028); הקרן הלאומית למדע עבור סין של מדענים צעירים (להעניק מספר 31800819).
Phospholipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
Phosphate buffer | Gibco BRL | 89033 | |
Penicillin streptomycin / amphotericin | Gibco BRL | 15640055 | |
Buffer bicarbonate | Sigma-Aldrich | C3041 | |
Table concentrator | Changzhou Aohua Instrument Co. | KT20183 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
South American fetal bovine serum | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
L-Glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
Biosafety cabinet | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
Constant temperature incubator | Esco,Singapore | CLS-170B-8 | |
Centrifuge tube | Corning | 430790 | |
EP tube | Axygen | 31617934 | |
Centrifugal machine | TOMOS | 1-16R | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
Pura Matrix | BD | 354250 | |
Dynamic perfusion culture system | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
Peristaltic pump | Ismatec | IPC N8 | |
Pump tubing | Ismatec | Nr.1306 | |
MINUSHEET 1300 | Regensburg | tissue carrier components | |
MINUSHEET | Regensburg | dynamic perfusion system | |
MINUSHEET 0006 | Regensburg | gas exchange equipment | |
MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL glass bottle | |
MINUSHEET 1301 | perfusion culture container |