Costruzione di un foglio di multistrato delle cellule staminali mesenchimali con un sistema di cultura dinamica 3D
Summary
Questo articolo fornisce un metodo efficiente e fattibile per la costruzione di fogli multistrato sulle cellule staminali con proprietà favorevoli della cellula formativa.
Abstract
Terapia della cellula formativa Mostra un promettente futuro nella rigenerazione di tessuti e organo danneggiato, e la tecnica di foglio di cella è stata sviluppata per migliorare la conservazione delle cellule basse e scarsa sopravvivenza all’interno della zona di destinazione. Tuttavia, durante il processo di costruzione di in vitro , è urgente una soluzione per il mantenimento delle cellule staminali bioattività e aumentando la quantità di cellule all’interno del foglio di cella. Qui, questo protocollo presenta un metodo per la costruzione di un foglio di celle multistrato con cellule staminali favorevole bioattività e un’operatività ottima. Pericardio porcino decellularizzato (DPP) è preparato dalla fosfolipasi un metodo di decellularizzazione2 (PLA2) come l’impalcatura di strato delle cellule e cellule staminali mesenchimali di ratto del midollo osseo (BMSC) sono isolate e ampliate come cellule del seminato. La struttura del foglio temporaneo celle multistrato è costruita usando RAD16-ho peptide idrogel. Infine, strato di cellule è coltivato con un sistema di perfusione dinamica per stabilizzare la struttura tridimensionale (3D) e strato di cellule poteva essere ottenuto seguendo una 48 ore di coltura in vitro. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente e fattibile per la costruzione di un foglio di multistrato sulle cellule staminali, e strato di cellule potrebbe essere sviluppato come un prodotto di terapia della cellula formativa favorevole in futuro.
Introduction
Terapia con cellule staminali è stata segnalata come un efficace trattamento per molte malattie; Tuttavia, cella bassa ritenzione e scarsa sopravvivenza all’interno della zona di destinazione rimangono questioni critiche dopo l’iniezione di cellule staminali tradizionale. Per risolvere questo problema, tessuto ingegneria gli scienziati hanno sviluppato la tecnica del foglio di cella. Un foglio monostrato cellulare con intatto della matrice extracellulare in primo luogo è stato preparato utilizzando la risposta di temperatura cultura piatto1e relativi studi di follow-up segnalato i miglioramenti significativi di conservazione delle cellule staminali e la sopravvivenza all’interno il colpito da infarto zona2,3. Tra i metodi, costruendo il foglio di celle multistrato è stata segnalata come una strategia efficace per migliorare la sopravvivenza delle cellule e la cella foglio effetto terapeutico3,4. Da allora, gli scienziati hanno lavorato sullo sviluppo di metodi di costruzione del foglio differenti delle cellule al fine di aumentare la quantità di cellule, cellule staminali proprietà e proprietà meccaniche dei fogli delle cellule. Finora, alcuni tipi di strato delle cellule sono stati costruiti e studiati nel trattamento di infarto miocardico5, cartilagine ferita6, e la pelle ferita7.
La bioattività delle cellule staminali prima di trapianto ha mostrato un’influenza emergente sulla rigenerazione del tessuto danneggiato e cellula diverse strategie di costruzione di foglio hanno effetti diversi sulle cellule staminali. Da un lato, strati delle cellule confluenti consistevano soltanto di cellule staminali ad alta densità e matrici extracellulari naturale potrebbero essere acquistati da impilamento monostrato cellulare fogli8 o utilizzando tessuto magnetico Ingegneria tecniche9. D’altra parte, i ricercatori hanno sviluppato diverse impalcature per fornire un’adeguata resistenza meccanica e supporto delle cellule crescita10,11,12, che ha permesso una cellula staminale bassa densità per garantire la nutrizione di semina fornitura. Tuttavia, nonostante questi approcci, la fornitura di basso efficiente nutrizione all’interno della struttura di strato di celle multistrato rimane delle principali preoccupazioni durante la costruzione in vitro . Di conseguenza, un sistema di costruzione del foglio delle cellule efficiente e fattibile è urgentemente necessario.
Questo protocollo descrive i passaggi per preparare un foglio di cellula staminale (MSC) multilayeredmesenchymal. In questo sistema di costruzione, la resistenza meccanica del foglio di cella è fornita da un DPP. Basato su questa impalcatura, struttura cellulare 3D può essere rapidamente costruita con RAD16-io idrogel peptidici e un sistema di perfusione dinamica viene utilizzata per il foglio di celle multistrato, al fine di stabilizzare la struttura del foglio di cella 3D e fornire sufficiente nutrizione della coltura approvvigionamento per le cellule. Utilizzando questo sistema, un foglio BMSC multistrato è stato preparato correttamente e ha esibito un effetto terapeutico ottimale il ratto infarto miocardico modello13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo segnala un metodo efficiente per la costruzione di un foglio multistrato di MSC. Questo strato di cellule presenta resistenza meccanica ottima, cell ad alta densità di semina e bioattività favorevole sulle cellule staminali. Utilizzando BMSCs come esempio, la struttura cellulare 3D rapidamente costruita con RAD16-io del peptide idrogel. Dopo in coltura nel sistema dinamico di aspersione, il foglio BMSC multistrato è ottenuto con successo e le BMSC mantenere un’alta espressione di marcatori di ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation della Cina (concessione numero 31771064); la scienza e la tecnologia pianificazione progetto della provincia di Guangdong (sovvenzione numeri 2013B010404030, 2014A010105029 e 2016A020214012); la scienza e la tecnologia pianificazione progetto di Guangzhou (concessione numero 201607010063); e l’innovazione dello studente non laureato e il programma di formazione all’imprenditorialità (concessione numero 201610559028); la National Science Foundation per giovani scienziati della Cina (grant numero 31800819).
Materials
| Phospholipase A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Phosphate buffer | Gibco BRL | 89033 | |
| Penicillin streptomycin / amphotericin | Gibco BRL | 15640055 | |
| Buffer bicarbonate | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| Table concentrator | Changzhou Aohua Instrument Co. | KT20183 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| South American fetal bovine serum | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-Glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Biosafety cabinet | Esco,Singapore | AC2-2S1 | |
| Constant temperature incubator | Esco,Singapore | CLS-170B-8 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| EP tube | Axygen | 31617934 | |
| Centrifugal machine | TOMOS | 1-16R | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| Dynamic perfusion culture system | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IPC N8 | |
| Pump tubing | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | tissue carrier components | |
| MINUSHEET | Regensburg | dynamic perfusion system | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | gas exchange equipment | |
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL glass bottle | |
| MINUSHEET 1301 | perfusion culture container |
References
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